毕业设计（论文）-基于检测双氧水的N-丁基-1,8-酰胺硼酸酯荧光探针研究.doc

本科生毕业论文本科生毕业论文 设计设计 题 目 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 酰 胺硼酸酯荧光探针研究 学生姓名 所在学院 化学化工学院 学 号 专业班级 化学 09101 班 指导老师 完成时间 2013 年 5 月 目目 录录 摘要 1 关键词 1 Abstract 2 Keyword 2 1 引言 3 2 实验部分 5 2 1 实验仪器与试剂 5 2 1 1 实验仪器 5 2 1 2 实验试剂 5 2 2 探针化合物的合成 6 2 2 1 化合物 4 溴 1 8 氮丁基萘酰胺的合成 6 2 2 3 化合物 3 的核磁共振氢谱图 7 2 3 溶液的配制 8 2 3 1 探针化合物 3 的母液 8 2 3 2 过氧化氢溶液的配置 8 2 3 3 不同 PH 值缓冲溶液的配置 9 3 结果与讨论 9 3 1 光谱性质 9 3 1 1 紫外吸收光谱 9 3 1 2 荧光发射光谱 9 3 2 时间考察 10 3 3 PH 考察 11 3 4 反应机理 12 4 结论 12 参考文献 14 致 谢 15 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 1 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺 硼酸酯荧光探针研究 张芳芳 化学化工学院 化学 09101 班 摘要摘要 本文设计合成了一种基于荧光增强的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针 即文中 的化合物 3 研究了该探针分子对过氧化氢识别的荧光光谱性质 在乙腈水溶液中 该探针化合物 3 本身无荧光 加入过氧化氢后 该探针的荧光发射强度显著增强 并且 荧光发射强度随着过氧化氢浓度的增加而增强 在一定的范围内呈现良好的线性关系 测定目标化合物 3 的紫外吸收光谱 实验表明目标化合物对过氧化氢有响应 通过时 间考察 研究表明过氧化氢浓度越大 该目标化合物与过氧化氢所需的反应时间越长 表明该探针具有时间分辨检测双氧水的能力 通过 PH 考察 可知当 PH 值为 8 时 荧光发射强度最大 即在 PH 值等于 8 的条件下用该探针检测过氧化氢的含量最适宜 并且分析得到该探针检测过氧化氢含量的酸碱范围较宽 是一个较好的探针 关键词关键词 过氧化氢 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯 荧光探针 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 2 Detection of hydrogen peroxide based on N butyl 1 8 naphthyl amide borate fluorescent probe Zhang Fangfang Chemical class 09101 Abstract In this paper the design and synthesis of a method based on the fluorescence enhancement of N butyl 1 8 naphthyl amide borate fluorescent probe compounds namely the 3 increase of fluorescence spectra of hydrogen peroxide the probe molecule recognition in acetonitrile solution the probe compound 3 has no fluorescence the addition of hydrogen peroxide the fluorescence probe the emission intensity was significantly enhanced and the fluorescence emission intensity with hydrogen peroxide and enhancement which showed a good linear relationship within a certain range Determination of compound 3 ultraviolet absorption spectrum experiments show that the target compounds have response to hydrogen peroxide At the same time through the investigation experiments show that the concentration of hydrogen peroxide is required the target compounds with hydrogen peroxide reaction time Through the PH study experiments show that pH has a great effect on the fluorescence intensity of absorption when the pH was 8 the fluorescence intensity of absorption maximum When the PH is greater than 7 the solution was alkaline fluorescence intensity is big the detection of hydrogen peroxide in alkaline solution is appropriate Keyword Hydrogen peroxide N butyl 1 8 naphthyl amide borate fluorescence probe 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 3 1 引言 活性氧 reactive oxygen species ROS 一般是指生物体内含有氧原子并且性质活泼的 一类物质的总称 主要包括超氧阴离子自由基 过氧化氢 单线态氧分子 羟自由基 过氧化脂质 和次氯酸盐等 体内活性氧 ROS 主要由分子氧经线粒体呼吸链电子传递 产生 过氧化氢作为活性氧的主要成员 是有氧存在时不可避免的副产物 它通过促进 氧化应激来达到机体累积的氧化损伤 生理水平的过氧化氢对于细胞内多种过程的调 控是必不可少的 如免疫细胞的活化 哺乳动物的血管重塑 植物中气孔的关闭和根的 生长等 然而 越来越多的证据表明 过氧化氢还可以作为第二信使参与调节多种严重 的疾病 包括恶性肿瘤 神经退化性帕金森氏症和阿尔茨海默氏综合征等 由此可见 能够适时准确地检测体内过氧化氢的含量对于某些疾病的预防 诊断以及病理的研究 具有十分重要的指导意义 然而 过氧化氢本身稳定性差 导致通常情况下稳态浓度 极低 反应活性高 且生物体内多种氧化物和抗氧化物的存在都给过氧化氢的测定带 来一定难度 目前 检测过氧化氢的方法主要有电子自旋共振法 化学发光法 分光 光度法和荧光法等 其中 荧光法不仅具有操作简单易行 高灵敏度 高选择性的特 点 更加吸引人的是探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞 与胞内靶分 子结合 并通过借助于激光共聚焦成像技术 实现细胞内过氧化氢的 可视化 从而实 现对它在生命体内进行 实时在线 的检测 因此 设计合成选择性好 灵敏度高 具 有生物兼容性的荧光探针用于检测活细胞和组织内的过氧化氢是生命化学学科发展中 具有挑战性的前沿课题之一 近年来 过氧化氢荧光探针在设计 作用机制和应用等方 面取得了很大的进展 比如 2 7 二氯二氢荧光素 2 7 dichlorodihydrofluo rescein DCFH 1 是一种传统的检测 ROS 的探针 它自身无荧光 当它被 ROS 氧化成 2 7 二 氯荧光素 2 7 dichlorofluorescein DCF 时 即发出强烈荧光 之后 DCFH 的双乙酸酯 衍生物 2 7 二 氯荧光素二乙酸酯 2 7 dichlorodihy drofluorescein diacetate DCFH DA 2 被报道 该探针较 DCFH 具有更好的脂溶性和透膜性 因此被广泛地应用于细胞内 ROS 的检测 此外 其它一些经常用作细胞内 ROS 检测的探针还有 双羟基化合物 10 乙酰基 3 7 二羟基 吩嗪 10 acetyl 3 7 dihydroxyphenoxazine AmplexRed 3 25 以 下为几种常见的 ROS 探针 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 4 图 1 几种常见的 ROS 探针 这些化合物对过氧化氢的选择性较差 它们的荧光响应是一种氧化机理 不仅对细 胞内活性氧有响应 而且对其他的氧化物质亦有响应 由于其在没有活性氧存在的条 件下也能被氧化 会产生较高的背景干扰 因此 设计一种选择性好的荧光探针对于 检测过氧化氢十分必要 近年来硼酸或硼酸酯基团与荧光团直接相连的过氧化氢探针 在荧光团分子中引入硼酸酯或硼酸基团作为探针的开关很好地解决了这一问题 硼酸 酯或硼酸基团能淬灭荧光团的荧光 因此探针自身不发光或发微弱的荧光 当硼酸酯 与过氧化氢反应后能够被水解为羟基 从而发出荧光 因此 引入硼酸酯识别基团能 够提高荧光探针对过氧化氢的选择性 本课题合成了一种对过氧化氢具有较高选择性 的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针 适合应用于细胞和生物体内成像 对过氧化 氢均有较好的选择性 并且可以用于细胞荧光成像研究 以下总结了几类不同荧光团 的硼酸及硼酸类的荧光探针 如下图所示 PF2 PF3 PE1 图 2 以硼酸酯为荧光开关的荧光素类过氧化氢探针 如前文所述 硼酸及硼酸酯类荧光探针在检测过氧化氢方面有着诸多的优势 如反 应的灵敏度和选择性都比较好 另一方面 荧光团能够较方便的和硼酸酯基团相连接 能够衍生出多样化的过氧化氢探针 采用荧光探针法不仅能够克服过氧化氢本身的性 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 5 质对于检测研究的障碍 而且结合共聚焦显微成像技术和微区光谱检测技术可以对活 细胞和组织内的过氧化氢 实时 可见 定量 的检测 600 1000 nm 的近红外光区 生物体的光吸收和荧光强度较小 且致密介质 如组织 的光散射大大降低 激发光的穿 透性更大 因而自发荧光的背景干扰会大大降低 且能量较低可减少光照对细胞的损 伤 所以近红外荧光探针拥有良好的发展前景 因此 设计合成选择性好 灵敏度高 具有生物兼容性的红外 近红外荧光探针用来检测活细胞和组织内的活性氧是生命化 学学科发展中具有挑战性的前沿课题之一 本课题研究的就是这样一种能检测过氧化 氢的硼酸类荧光探针 2 实验部分 2 1 实验仪器与试剂 2 1 1 实验仪器 X 4B 显微熔点仪 上海精密科学仪器有限公司 ZF3 型紫外透射反射分析仪 上海嘉鹏科技有限公司 ZF 2型三用紫外仪 上海市安亭电子仪器厂 恒宇电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂 DF 101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司 BS210型电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 YW 1型远红外电热干燥箱 江苏省东台市电器厂 KQ5200 B 超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司 R 1000 型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司 PHS 3C型pH计 雷磁上海精密科学仪器有限公司 BRUKER 500型核磁共振仪 德国电子仪器厂 AGILENT1100型液质联用仪 美国电子仪器厂 2 1 2 实验试剂 试剂 规格 生产厂家 过氧化氢 分析纯 长沙市湘科精细化工厂 冰醋酸 分析纯 长沙市湘科精细化工厂 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 6 4 溴 1 8 萘酸酐 分析纯 阿拉丁 上海晶纯试剂有限公司 1 4 环氧六烷 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心 乙醇 分析纯 长沙市湘科精细化工厂 频哪醇硼酸酯 分析纯 长沙市湘科精细化工厂 硫酸 优级纯 湖南省株洲市化学工业研究所 正丁胺 分析纯 阿拉丁 上海晶纯试剂有限公司 氢氧化钠 分析纯 湖南汇虹试剂有限公司 乙酸乙酯 分析纯 天津市进丰化工有限公司 石油醚 分析纯 天津市进丰化工有限公司 乙腈 分析纯 天津市恒兴化学试剂制造有限公司 乙酸钾 分析纯 长沙市湘科精细化工厂 盐酸 分析纯 株洲市星空化玻有限责任公司 氢氧化钠 分许纯 株洲市星空化玻有限责任公司 二氯甲烷 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 二苯基二茂铁氯化钯 分析纯 天津市进丰化工有限公司 2 2 探针化合物的合成 2 2 1 化合物 4 溴 1 8 氮丁基萘酰胺的合成 O Br OO NH2CH2CH2CH2CH3 CH3CH2OH N Br OO 1 2 图 3 化合物 4 溴 1 8 氮丁基萘酰胺的合成 准确称取 4 溴 1 8 萘酸酐 1 38g 5mmol 于一个洁净干燥的 100ml 三颈圆底烧瓶中 量取 10 m L 乙醇慢慢加入圆底烧瓶中 在室温搅拌条件下 使固体溶解 溶解完全后 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 7 装上回流冷凝管 在氮气保护下抽真空 并且在真空保护下用注射器注入 1ml 正丁胺 在 90 下回流过夜 24h 后 停止加热 TLC 薄层色谱 跟踪反应进程 在 ZF 2 型 三用紫外仪观察 确认反应完全后 将溶液冷却 会有黄色晶体出现 抽滤 得黄色 固体 称其质量为 2 2g 产率为 84 7 并测得熔点为 188 190 2 2 2 化合物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺硼酸酯的合成 N Br OO O B O O O Pd dppf Cl2 N B OO OO 2 3 图 4 化合物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺硼酸酯的合成 准确称取频哪醇硼酸酯 2 42g 5mmol 以及 4 溴 1 8 氮丁基萘酰胺 2 17g 5mmol 和催化剂二苯基二茂铁氯化钯 0 242g 0 5mmol 溶解于 10ml 1 4 环氧六烷中并缓慢滴 入有氮气保护装置的 100 mL 圆底烧瓶中 室温下搅拌 20 分钟 在 50 条件下反应 g 过夜 24 小时后 TLC 薄层色谱 跟踪反应进程 对合并的有机相进行旋转蒸发 除去 溶剂后 对剩余物通过硅胶柱色谱进行硅胶柱分离提纯 用湿法上柱 以 乙酸乙酯 石 油醚 1 1 V V 为洗脱剂 旋转蒸发得到紫红色固体化合物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺硼 酸酯 2 02 g 产率 82 5 2 2 3 化合物 3 的核磁共振氢谱图 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 8 图 5 化合物 3 的氢谱图 图 5 是探针化合物 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯在 BRUKER 500 型核磁共振仪上得到 的核磁谱图 从图中可以得出 1H NMR 500 MHz DCH2Cl 9 10 d 1H 8 59 m 2H 8 43 d 2H 8 30 d 1H 7 71 t 1H 4 19 t 2H 1 72 t 2H 1 50 t 2H 1 45 s 12H 0 98 t 3H 2 3 溶液的配制 2 3 1 探针化合物 3 的母液 准确称取一定量的探针化合物 3 溶于适量的乙腈中 制成 5 0 10 2 mol L 1的贮备 液 使用时根据需要适当稀释 2 3 2 过氧化氢溶液的配置 将 23 8gHEPES 溶于约 90ml 的水中 用 NaOH 调 pH 为 7 4 然后用水定容至 100ml 分别用微量进样器移取 4 L 探针母液和适当量过氧化氢于 10 mL 容量瓶中 配置过氧化氢浓度梯度的探针测试液 过氧化氢浓度分别为 0 0 0025 0 005 0 05 0 5 1 12 5 20 25 50 75 uM 加入 5 mL 乙腈 用 HEPES 缓冲液 pH 7 4 定容 震荡摇匀 配制成探针化合物 3 的 20 uM 的中性水溶 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 9 液 50 mM HEPES 缓冲液 pH 7 4 包含 50 CH3CN 作为共存溶剂 溶液 在室温 条件下放置 5 分钟后 测定该体系中过氧化氢不同浓度条件下探针分子的荧光发射光 谱 2 3 3 不同 PH 值缓冲溶液的配置 向装有适量 pH 7 4 的 HEPES 缓冲溶液的小烧杯中加入 0 1mol L 1的盐酸或 0 1mol L 1的氢氧化钠溶液 用 PH 计测试烧杯中缓冲溶液 PH 值 依次调成 PH 值为 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 的缓冲溶液 3 结果与讨论 3 1 光谱性质 3 1 1 紫外吸收光谱 对探针化合物 3 紫外吸收光谱性质的研究是在 50 mM HEPES 缓冲液 pH 7 4 50 CH3CN 作为共存溶剂的体系中进行的 温度为室温 图 6 记录的就是该条件下探 针 3 分别在在没有加入过氧化氢和过氧化氢浓度为 5 10 5M 的光谱情况 如图 6 所示 黑色曲线表示没有加入过氧化氢的探针测试液 红色曲线表示过氧化氢浓度为 5 10 5M 的探针测试液 从图中我们可以看出 在没有加入过氧化氢的溶液中 最大吸 收波长为 350nm 然而在有过氧化氢存在的溶液中 最大吸收波长变为 440nm 由此表明 目标化合物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰亚胺对过氧化氢有较好的响应 Wavelength 300400500600700 Abs 00 0 0 2 0 4 0 6 50uM L 50uM L 500uM H2O2 图 6 目标化合物 3 在有无过氧化氢时的紫外吸收光谱图 3 1 2 荧光发射光谱 对探针化合物 3 荧光发射光谱性质研究是在室温下进行的 下图记录的就是探针 化合物 3 在不同浓度过氧化氢溶液中的荧光光谱情况 从图中可以看出 在过氧化氢 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 10 加入前 化合物 3 没有荧光 加入过氧化氢之后 化合物 3 在 570 nm 处的荧光发射强 度显著增加 并且该荧光发射强度随着过氧化氢浓度的增加而增强 对荧光发射强度 与过氧化氢浓度的关系线性拟合 得到图 8 所示曲线 说明另外二者在一定的范围内 呈现良好的关系 上述实验结果表明 化合物 3 可作为一个高灵敏度的探针测定过氧 化氢的浓度 Wavelength 450500550600650 Fluorescence 0 500 1000 1500 0 0 0025uM 0 005uM 0 05uM 0 5uM 1uM 12 5uM 20uM 25uM 50uM 75uM 图 7 不同浓度的过氧化氢存在时化合物 3 的荧光发射光谱图 Concentration uM 020406080 F F0 0 10 20 30 图 8 不同浓度的过氧化氢存在时化合物 3 的荧光发射光谱与浓度拟合曲线图 3 2 时间考察 为了进一步研究过氧化氢浓度与荧光发射强度的关系 测定了不同浓度的过氧化 氢与相同量的目标化合物反应完全所需要的时间 以下三条曲线表示过氧化氢的浓度 分别为 0 05uM 5uM 25uM 由图可知 0 05uM 过氧化氢与目标化合物反应完全所需要 的时间为 2min 5uM 过氧化氢反应完全所需要的时间为 6min 25uM 过氧化氢反应完全 所需要的时间为 10min 实验表明过氧化氢的量越大 与目标化合物反应所需的时间 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 11 就越长 表明该探针具有时间分辨检测双氧水的能力 Time minutes 0481216 F F0 0 10 20 3025uM 5uM 0 05uM 图 9 不同量的过氧化氢与目标化合物反应的时间考察 3 3PH 考察 为了探究什么环境下该探针检测过氧化氢最灵敏 对其进行 PH 考察 用 PH 值分 别为 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 的 5 10 6 M 的荧光探针测试液 检测 3 75 10 5M 浓度的过氧化氢溶液 观察不同 PH 值条件下荧光发射的情况 观察图 10 可知 探针溶液 PH 值范围在 6 12 之间时荧光发射强度都较大 当 PH 值为 8 时 荧 光发射强度最大 即在 PH 值等于 8 的条件下 检测过氧化氢含量最适宜 该实验表明 该探针检测过氧化氢适用的的酸碱范围较宽 是一个较好的探针 PH Wavelength 480520560600640 Fluorescence 0 400 800 1200 1600 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 图 10 不同 PH 值时 探针化合物在相同浓度过氧化氢的荧光发射光谱 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 12 PH 36912 F F0 0 40 80 120 160 图 11 不同 PH 值时 PH 与荧光强度线性关系的拟合曲线图 3 4 反应机理 根据文献 12 硼酸酯或硼酸基团是能淬灭荧光团的荧光 因此探针自身不发光或发 微弱的荧光 当硼酸酯与过氧化氢反应后能够被水解为羟基 从而发出荧光 由此可 推测本课题合成的目标化合物与过氧化氢的反应机理应当如图 12 所示 N B OO OO H2O2 NOO OH 图 12 目标化合物 3 与过氧化氢的反应机理 4 结论 本文采用 4 溴 1 8 萘酸酐为原料 与正丁基胺在乙醇中反应合成得到中间产物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺 再利用中间产物与频哪醇硼酸酯在二氯乙烷和催化剂二苯 基二茂铁氯化钯条件下进一步反应合成得到一种高灵敏度 高选择性的目标化合物 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺硼酸酯 同时研究了该探针对双氧水的响应性能 通过研究该探 针的紫外吸收光谱 可知该探针对过氧化氢有较好的响应 通过研究该探针的荧光光 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 13 谱 可知该探针的荧光发射强度与过氧化氢的浓度成良好的线性关系 并且发射强度 随过氧化氢浓度的增大而增大 由此得到该探针可以作为检测双氧水的高灵敏探针 通过时间考察 可知过氧化氢浓度越高 反应完全所需要的时间越长 表明该探针具 有时间分辨检测双氧水的能力 通过 PH 考察 可知该探针在 PH 值为 6 12 的范围内 对过氧化氢均有较好的响应 表明该探针检测双氧水的酸碱适用范围宽 通过查阅文 献推测该探针化合物检测过氧化氢的机理 是由于目标化合物有硼酸酯基团 该基团 能淬灭荧光团的荧光 因此该探针自身不发光或发微弱的荧光 当硼酸酯与过氧化氢 反应后能够被水解为羟基 从而发出荧光 因此 引入硼酸酯识别基团能够提高荧光 探针对过氧化氢的选择性 综上所述 本文合成了一种高灵敏度 高选择性的 N 丁基 4 溴 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针 可实现在生物体中对较低浓度的过氧化氢进行荧光 检测 基于检测双氧水的 N 丁基 1 8 萘酰胺硼酸酯荧光探针研究 14 参 考 文 献 1 Geiszt M Lekstrom K Leto TL Analysis of mRNA transcripts from the NAD P H oxidase 1 Nox1 gene evidence against production of the nadph oxidase homolog 1 short NOH 1S transcript variant J Biol Chem 2004 279 51661 51668 2 Slesak I Libik M Karpinska B Karpinski S Miszalski Z The role of hydrogen peroxide in regumidchik V Bothwell JHF Mylona P Miedema H Torres MA Linstead P Costa S Brownlee C Jones JDG Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth Nature 2003 422 442 446 3 Barnham KJ Masters CL Bush AI Neurodegenerative diseases and oxidative stress Nat Rev Drug Discov 2004 3 205 214 4 Krohn K Maier J Paschke R Mechanisms of disease Hydrogen peroxide DNA damage and mutagenesis in the development of thyroid tumors Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007 3 713 720 5 Khanma weixu khizarulh et al Electron in jection and transport mechanism in organic devices based on electron transport materials J J Phys D Appl Phys 2008 41 22 1 6 6 Finkel T Serrano M Blasco MA The common biology of cancer and ageing Nature 2007 448 767 774 7 李宏林 胡明明 彭孝军等 甲基汞检测研究进展 J 化学研究与应用 2011 23 2 29 136 8 张跃华 1 8 萘酰亚胺荧光单体的合成表征与荧光性质 精细石油化工 2008 25 5 288 299 9 杨建新 梁跃华 王心亮 1 8 萘酰亚胺类荧光化合物 的合成与应用 J 染料与染色 2004 41 3 165 167 10 李静 范大和 李红波 等 水溶性汞离子荧光探针的 研究新进展 J 光谱实 验室 2010 27 3 825 8