29香菇杂交菌株的ISSR分析

本科毕业论文题 目：香菇杂交菌株的ISSR分析姓 名：汤丰学 号040308025专 业：植物保护指导教师：徐章逸职 称讲师中国武汉二 八 年 六 月分类号 密级华中农业大学本科毕业论文 香菇杂交菌株的ISSR分析学生姓名：汤丰学生学号：20040308028学生专业：植物保护指导教师：徐章逸华中农业大学植物科学与技术学院二八年五月华中农业大学学士学位论文（设计）目 录摘 要I1、前言11.1 DNA分子标记11.2 研究目的和意义12材料与方法22.1 试验材料22.1.1 供试菌株22.1.2 供试培养基22.1.3 供试试剂32.1.3.1 DNA提取系列试剂32.1.3.2 PCR反应系列试剂32.1.4 仪器与设备42.2 试验方法52.2.1 菌丝培养52.2.2 DNA的提取（参照宋小亚，2007，略有修改）52.2.3 DNA的检测52.2.4 ISSR引物筛选62.2.5 PCR扩增62.2.6 ISSR-PCR数据处理63结果与分析63.1亲本及其杂交子的ISSR分析63.1.1 引物筛选结果63.2 香菇ISSR-PCR遗传多样性分析73.2.1 ISSR多态性73.2.2 遗传相似系数83.3.3 聚类分析94讨论104.1 ISSR标记在香菇优良杂交子筛选中的运用10参考文献11致谢13香菇杂交菌株的ISSR分析摘 要本试验运用ISSR标记对杂交组合秋6K95-1及其21个杂交菌株进行了遗传分析。从33个引物中筛选出10条重复性好、谱带清晰的引物，共扩增出128个位点，多态性条带总共为120个，占总带数的93.8%。扩增结果采用软件NTSYS2.10e计算菌株间的遗传相似系数，并进行聚类分析。聚类结果显示，供试菌株在0.46相似水平上划分为两大类。第大类菌株，除QK-17外均能出菇，部分菌株聚类分析结果与农艺性状非常吻合。QK-5与QK-20菇形大小适中，但单菇重量较轻，在0.87相似水平上聚为一类。QK-18与QK-19出菇均很少，产量低，在0.88水平上聚为一类。 QK-15产量较高，超过亲本秋6和K95-1，菌盖形态和亲本K95-1相似，但其菌柄较长，超过菌柄较长的亲本K95-1，与QK-18和QK-19在0.86相似水平上聚为一类。 第大类的4个菌株均没有出菇。QK-4与QK-6的菌丝均能长满菌袋，但栽培袋不起瘤状物不转色；QK-2与QK-11均在栽培袋中被杂菌污染。本试验结果表明，ISSR分析可为优良杂交菌株初筛提供参考，从而减少杂交育种中初筛栽培试验的工作量。关键词：香菇 杂交育种 品比试验 灰色关联度分析 ISSR分析 农艺性状 Abstract ISSR marker was applied for study on genetic analysis of cross combination Qiu 6 K95-1 and their hybrid strains this experiment. 33 ISSR primers were screened and 10 of which could differentiate hybrid strains effectively were selected to amplify the 23 L.edodes strains. A total of one hundred and twenty-eight fragments were amplified, among which one hundred and twenty fragments(93.8%) were polymorphic. According to amplification results, genetic similarity coefficient matrix among thirty-six strains ranged from 0.25 for the lowest similarity co-efficient to 0.83 for the greatest extent of similarity. All the tested strains were clusted into 2 groups at 0.46 similarity level. The strains in the first group all produced fruit except QK-17, amplification products also supported the agronomic characters. QK-5 and QK-20 have the same fruit body quality and average fresh weight of a single fruitbody, they could be classified into the first group at 0.87 similarity level. QK-18 and QK-19 have few fruitbody, so have low yield. QK-7, QK-8 and QK-16 have same fruit body quality, average numbers and fresh weight of a single fruitbody per bag with their parent K95-1which was clusted into one group at 0.80 similarity level. QK-15 have the same pileus shape with parent K95-1, and have higher yield and longer stip then its parents, but it was clusted into one group at 0.86 similarity level with QK-18 and QK-19. The second group have four strains which had no fruit body. ISSR marker is a powerful tool in screening excellen hybrid strains of L.edodes strains, thus greatly reducing crossbreeding in the screening workload.Key word：Lentinula edodes， Crossbreeding， Variety comparative test， Grey relational grade analysis，ISSR analysis，Agronomic characters I华中农业大学学士学位论文（设计）1、前言1.1 DNA分子标记DNA分子标记是继形态标记和生化标记之后发展起来的一种理想的遗传标记，通常也称为DNA指纹图谱，是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。狭义的分子标记特指DNA标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，直接反映DNA水平遗传变异。目前，已开发出数十种分子标记。通常，这些分子标记根据其基本原理可分为三大类，分别是：以分子杂交为基础的分子标记，如RFLP；以PCR技术为核心的标记，如RAPD、ISSR（inter-simple sequence repeat，简单序列间重复扩增）等；以DNA序列为基础的标记技术，如SCAR标记技术。各分子标记具有不同的适用范围和优缺点，目前已迅速地应用于生命科学中的各个领域，如基因克隆、基因定位、遗传图谱构建、遗传多样性分析、育种及菌株鉴定等方面。其中以AFLP（amplified fragment length polymorphim，扩增片段长度多态性）、SSLP、STS、SCAR（sequence characterized amplified region，特征性片段扩增区域）、CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence，裂解扩增多态性序列）、RAPD、ISSR等在蕈菌研究中应用较多。ISSR技术在食用菌育种研究中的应用主要包括三个方面，分别为在食用菌亲本选择、品种鉴定与分类和遗传作图与基因定位。在食用菌亲本选择方面，王子迎和王书通(2006)用13个ISSR引物对26个安徽野生香菇和6个栽培菌株进行了遗传多样性分析，构建了遗传相关聚类图，并根据ISSR分析选择遗传距离远近不同的亲本进行组合杂交，评价了其杂种优势，研究结果显示，亲本间遗传距离较大的组合其杂种优势也较强，而当亲本间的遗传距离很小时，子代不但没有表现出杂种优势，其产量反而低于高值亲本。在食用菌品种鉴定与分类上，唐利华（2006）将ISSR和SRAP标记应用于全国34个主要黑木耳栽培菌株的指纹图谱分析中，结果表明两种标记均适用于黑木耳指纹图谱构建及进行菌株鉴别，并发现一些菌株间遗传关系很近，明显存在同物异名、同名异物现象。张金霞等（2007）对我国1982年至2004年22年间栽培的白黄侧耳Pleurotus cornucopiae30个菌株进行了ISSR分析，聚类分析在遗传相似性61%的水平下将30个供试菌株划分为15个类群，即15个具一定遗传差异的菌株。杨成香等（2007）以中国农业微生物菌种保藏管理中心收集保藏的59个金针菇菌株为实验材料，结合供试菌株栽培性状以及RAPD和ISSR聚类分析结果，供试的金针菇菌株存在丰富的遗传多样性。在食用菌遗传作图与基因定位方面，宋小亚等（2007）的对黑木耳的研究显示ISSR标记可用于黑木耳遗传连锁图的构建。林范学等以野生香菇菌株HW21的131个孢子单核体为作图群体，构建了包括RAPD、ISSR、SRAP和SSR标记在内的第一张香菇混合分子标记遗传连锁图谱。1.2 研究目的和意义目前我国香菇产区遍及全国二十多个省市、自治区，菌种生产厂家甚多，乱引种、乱命名现象普遍存在。然而，我国在食用菌新品种保护和品种审定方面的基础研究还十分薄弱，菌种管理滞后，致使菌种同物异名、同名异物现象十分严重，给新品种知识产权保护菌种质量管理和品种审定带来了很大困难。另一方面，目前香菇的基础研究相对滞后，关于其极性和交配型因子尚存在不同的观点，给遗传研究和育种工作带来很大阻碍。本研究应用ISSR标记对杂交组合秋6和K95-1及其杂交子进行了遗传分析。通过交配试验对菌株的交配型进行研究，分析不同菌株之间交配型基因的差异性；同时对各菌株的亲本及F1代单核体进行PCR扩增，寻找与交配型相关的基因。应用ISSR分子标记对香菇单核体进行遗传分析，通过后期的栽培试验分析了其杂交子出菇的数量和质量。这对推动香菇的基础遗传研究以及优良菌种的选育工作，都具有十分重要的意义。此外，探讨了将香菇栽培菌株交配型及功能基因作为标记应用于菌株鉴别的可行性，以及对香菇栽培菌株中同物异名现象的鉴别提供了新的技术手段，并为客观评价我国香菇栽培种质资源和保护香菇品种知识产权提供理论基础。2材料与方法2.1 试验材料2.1.1 供试菌株香菇菌株秋6与K95-1，来自华中农业大学菌种实验中心。 2.1.2 供试培养基PDA培养基（菌丝活化，菌种保存用）：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，加蒸馏水定容至1L。完全培养基（CYM）（单孢分离，配对试验用）：蛋白胨 2g，酵母膏 2g，MgSO47H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 0.46g，葡萄糖 20g，琼脂 15g，加蒸馏水定容至1L。液体完全培养基（LCYM）（菌丝液体培养用）：蛋白胨 2g，酵母膏 2g，MgSO47H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 0.46g，葡萄糖 20g，加蒸馏水定容至1L。原种、栽培种及栽培袋培养基（香菇栽培用）：杂木屑78，麸皮20，石膏11.5%，石灰0.2%，水适量。 2.1.3 供试试剂2.1.3.1 DNA提取系列试剂贮存液： 5 mol/L NaCl：称取73.05g NaCl溶于蒸馏水，并定容至250ml。1mol/L Tris-HCl：在800ml水中溶解121.1gTris，加入浓HCl调节pH值，加蒸馏水定容至1L，分装灭菌。0.5mol/L EDTA（pH8.0）：在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠，剧烈搅拌，用NaOH调节pH值至8.0，再定容1L，分装灭菌。70%乙醇：95%乙醇70ml加入ddH2O 25ml。10%十二烷基磺酸钠（SDS）（Sigma公司）：在900ml水中溶解100gSDS，加热至68，再加入浓HCl调节pH值至7.2，加蒸馏水定容至1L，并分装备用。50TAE缓冲液：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100ml，加蒸馏水定容至1L。DNA提取液：Solution：NaCl（100mmol/L），Tris-HCl（50mmol/L pH8.0），EDTA（50mmol/L pH8.0）。Solution：NaCl（100mmol/L），Tris-HCl（100mmol/L pH8.0），EDTA（50mmol/L pH8.0），SDS（1%）。PCA（phenol：chloroform：isoamyl alcohol=25:24:1）：将苯酚（北京鼎国生物技术中心的Tris饱和酚）和氯仿、异戊醇按25：24：1的体积比混合，置于棕色试剂瓶中，4保存。CA（chloroform：isoamyl alcohol=25:24:1）：将氯仿、异戊醇按24：1的体积比混合，置于棕色试剂瓶中，4保存。NaCl（AR）：3mol/L无水乙醇（AR）1TE缓冲液（pH8.0）：1mol/LTris-HCl（pH8.0）1ml，加0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2ml，定容至100ml，灭菌后备用。2.1.3.2 PCR反应系列试剂PCR反应所用的DNA Taq酶（TaKaRa Ex Taq）、10Buffer（Mg2+ free）、dNTPs、MgCl2、DNA marker（DL2000）等均购自宝生物工程（大连）有限公司。 琼脂糖、引物购自上海生工生物工程公司。ISSR引物的编号及核酸序列如表1所示。表1 供试的ISSR引物及其序列Table 1 ISSR primers and their sequences used in the study引物编号序列(53)引物编号序列(53)引物编号序列(53)NOsequenceNOsequenceNOsequenceP1(TATG)4P12(GCT)6P23(CACA)4RTP2(TATG)4CP13(AGG)6P24(CACA)4RCP3(GAGA)4TP14(CTCT)4TP25(GAGA)4YCP4(GAGA)4CP15(CTCT)4GP26(GAGA)4YTP5(AGAG)4GP16(TCTC)4CP27(GAGA)4YGP6(AGAG)4CP17(TCTC)4GP28(ATAT)4GP7(ACAC)4TP18(CACA)4GP29(GAGA)4GP8(CTCT)4AGAP19(TGTG)4AP30(GAGA)4CP9GSG(GTGT)3P20(TGTG)4RCP31(CTCT)4RGP10(AGAG)4TP21(AGAG)4YAP32(GAGA)4AP11(CATA)4GP22(AGAG)4YCP33(AGAG)4YT2.1.4 仪器与设备本试验所用的仪器名称、型号及其生产商如下所示：自动灭菌锅 上海申安医疗器械厂超净工作台（SW-CJ-1D） 苏州净化设备厂电子天平（TMP-1） 湖南仪器表总厂天平厂微波炉(WP700(MS-2011T) LG台式离心机 Eppendorf酸度计（DDS-307） 雷磁DYY-8型稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂三用恒温温水箱 北京长源实验设备厂核酸浓度检测仪（Biophotometer） Eppendorf AG电脑三恒多用电泳仪（DYY-12型） 北京六一仪器厂电泳槽（DYC-34A（G）型） 北京六一仪器厂凝胶成像分析系统 Gene GeniusPCR仪（T1 Thermocycler） 德国Biometra 公司冰箱BCD-196B 美菱2.2 试验方法2.2.1 菌丝培养将26个香菇冰箱保存菌种接于试管斜面培养基，转管活化710天，再接入250ml三角瓶液体培养基中，每个菌株各接3瓶，25静置培养1015天，用400目铜网过滤，蒸馏水冲洗，滤纸吸干，保存于-20备用。2.2.2 DNA的提取（参照宋小亚，2007，略有修改）（1）取一定量的菌丝体于研钵中，加液氮研成粉末，收集于1.5mL离心管中；（2）加入Solution，振荡将沉淀悬浮，65水浴30min，每隔5min上下轻轻颠倒一次；（3）12000rpm离心10min；（4）取上清液，加入等体积PCA，慢慢充分摇匀至下层液相澄清，12000rpm离心10min；（5）取上清液，加入等体积CA，慢慢充分摇匀后，12000rpm离心10min；（6）取上清液，加入1/10体积NaCl，混匀，加入2倍体积无水乙醇，混匀后置于-20，维持30min；（7）12000rpm离心10min，去上清，用70%乙醇浸洗3次，倾斜放置于操作台上吹干；（8）沉淀溶解于200uLddH2O中，保存于-20备用2.2.3 DNA的检测将5LDNA样品与1L loading buffer混合，点样于0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压5V/cm, 电极缓冲液为1TAE，电泳结束后取出，在EB溶液中染色20min左右，置于凝胶成像系统下检测DNA提取效果。用Biophotometer核酸检测仪测定DNA样品的浓度与纯度，并用超纯水将其稀释为50ng/L，-20保存。2.2.4 ISSR引物筛选 引物的筛选是进行ISSR分析的一个关键环节，因为不同的物种SSR相差很大。用来筛选引物的模板尽可能采用两个亲缘关系较远或二个具有一定遗传距离的材料，这样筛选出的引物才具有代表性，ISSR-PCR扩增出的结果多态性较高且可能每份供试材料都扩增出丰富的多态性位点（应正河，2006）。2.2.5 PCR扩增PCR反应体系（20L）为：Taq DNA Polymerase 0.5U，1PCR Buffer，Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTP 200mmol/L，Primer 0.75mol/L，模板DNA 100ng；扩增程序为：94预变性5min之后，进行35个循环，即94变性30s，50复性45s，72延伸90s，最后72补平7min；4保存。利用筛选出的扩增重复性好、谱带清晰的引物，对供试菌株进行ISSR-PCR扩增。PCR产物用2.0琼脂糖凝胶电泳，电压5V/cm，电极缓冲液为1TAE，在含有0.5g/mL EB中染色30min，凝胶成像系统拍照记录。2.2.6 ISSR-PCR数据处理电泳获得基因组扩增图中的每一条带（DNA片段）均代表了模板DNA上与引物互补的一对结合位点，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为属于同一位点，其产物按扩增阳性“1”（强带和可分辨、稳定性、重复性好的弱带均赋值为1）和扩增阴性“0”记录电泳带谱，用聚类分析软件NTsys 2.10e计算菌株间的遗传相似性系数，进行聚类分析，自动生成相似性系数矩阵和树状图。3结果与分析3.1亲本及其杂交子的ISSR分析3.1.1 引物筛选结果应用本实验室的33个引物扩增23个供试香菇菌株的DNA，没有扩增出条带的引物有：P1、P2、P7、P8、P11、P15、P22、P28、P29、P31；只能扩增出13条带的引物有：P12、P14、P18、P20、P23、P33；能扩增出4条以上带的引物有：P3、P4、P5、P6、P9、P10、P13、P16、P17、P19、P21、P24、P25、P26、P27、P30、P32；其中扩增重复性好、谱带清晰的引物有：P3、P4、P5、P6、P10、P24、P25、P27、P30、P32，共10个。3.2 香菇ISSR-PCR遗传多样性分析3.2.1 ISSR多态性多态性（Polymorphism）是对遗传变异的一种计量，是指群体内多态性基因座的比例（率）。计算公式为：（顾万春，2004）P=k/n（100%）式中：P为多态位点百分率，k为为多态性位点的位点数，n为测定的位点总数10个引物在所供试的23个菌株中都获得了基因组DNA指纹图谱，片段大小在0.252.0kb之间，在所扩增的片段中，大部分片段是共有的，很少的是各菌株特有的。共扩增出128个位点，多态性条带总共为120个，占总带数的93.8%。部分扩增图谱见图1，图2。图1引物P3对供试菌株的扩增结果Fig. 1. ISSR profile result of tested monokaryotic strains amplified by primer 3.注：编号123分别表示：秋6，K95-1，QK-1，QK-2，QK-3，QK-4，QK-5，QK-6，QK-7，QK-8，QK-9，QK-10，QK-11，QK-12，QK-13，QK-14，QK-15，QK-16，QK-17，QK-18，QK-19，QK-20，QK-21。图2 引物P24对供试菌株的扩增结果Fig. 2. ISSR profile result of tested monokaryotic strains amplified by primer 24.注：编号123分别表示秋6，K95-1，QK-1，QK-2，QK-3，QK-4，QK-5，QK-6，QK-7，QK-8，QK-9，QK-10，QK-11，QK-12，QK-13，QK-14，QK-15，QK-16，QK-17，QK-18，QK-19，QK-20，QK-21。3 15 13 147 6 5 3 M 12 2 1 10 11 23 22 21 20 19 18 17 16 9 8 4 3.2.2 遗传相似系数利用10个ISSR引物扩增所获得的128条带，计算供试菌株间的遗传相似系数即GS值（见表2）。结果表明，23个菌株间的GS值变化范围为0.430.88。其中杂交菌株QK-6和QK-8之间的GS值最小，遗传相似程度最低，遗传距离最远；杂交菌株QK-18和QK-19之间的GS值最大，遗传相似程度最高，遗传距离最近。与亲本秋6之间GS值最大的杂交菌株是QK-1，为0.82，最小的是QK-6，为0.44；与亲本K95-1之间GS值最大的杂交菌株是QK-16，为0.82，最小的是QK-2，为0.44。表2 供试菌株间的遗传相似系数即GS值3.3.3 聚类分析利用ISSR标记数据计算供试菌株间的遗传相似系数矩阵，采用UPGMA法构建了23个菌株的遗传关系聚类图（图3）。供试菌株在0.46相似水平上划分为两大类，亲本秋6、K95-1和部分杂交子聚为第一大类，另一部分杂交子聚为第二大类。聚类结果与农艺性状结论比较吻合。第二大类的菌株均没有正常出菇，QK-4与QK-6聚为一类，这两个菌株的菌丝均能长满菌袋，但菌袋不起瘤状物不转色；QK-2与QK-11聚为另一类，这两个菌株均在栽培袋中被杂菌污染。第一大类的菌株中有聚类结果与农艺性状非常吻合的，如QK-5与QK-20菇形中等，但单菇均较轻，在0.87水平上聚为一类，QK-18与QK-19出菇均很少，产量低，在0.88水平上聚为一类，QK-9前两茬菇均为假菇，第三茬菇才正常，故产量也很低，与它们在0.84水平上聚为一类。与亲本K95-1在0.8水平聚在一类的菌株QK-7、QK-8、QK-16的菇形均与K95-1比较像，单菇重和出菇数均与K95-1差不多。也有不太吻合的现象，如QK-15产量较高，超过双亲，菇盖和亲本K95-1差不多，但其菇柄太长，远超过双亲，农艺性状与QK-18和QK-19相差较大，但与它们在0.86相似水平上聚为一类。QK-1无菌褶，个较小，但与亲本秋6在0.82水平上聚为一类。图3 供试菌株间的遗传相似系数矩阵图4讨论4.1 ISSR标记在香菇优良杂交子筛选中的运用ISSR根据植物中广泛存在的简单重复序列（SSR）的特点，利用在植物基因组中常出现的SSR来设计引物，其引物长度通常为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复序列（有时加上几个非重复序列的锚定碱基）组成。其优点主要有：(1)ISSR分子标记通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,具有很好的稳定性和多态性，(2)DNA用量少,引物设计容易,实验成本低廉，(3)操作过程简单、快速、高效，不需使用放射性同位素。目前该方法已广泛应用于遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传作图、基因定位等方面。本试验将ISSR标记引入到香菇杂交子的初筛中，结合传统栽培方法筛选优良杂交子。试验中筛选出10条扩增重复性好、谱带清晰的引物，对亲本秋6和K95-1及其21个杂交子进行扩增，根据扩增结果采用软件ntsys 2.10e计算菌株间的遗传相似系数并进行聚类分析。研究结果显示，ISSR聚类结果与农艺性状结论比较吻合。供试菌株在0.46相似水平上划分为两大类，第二大类的菌株均没有正常出菇，QK-4与QK-6聚为一类，这两个菌株的菌丝均能长满菌袋，但菌袋不起瘤状物不转色；QK-2与QK-11聚为另一类，这两个菌株均在栽培袋中被杂菌污染。第一大类的菌株中有聚类结果与农艺性状非常吻合的，如QK-5与QK-20菇形中等，但单菇均较轻，在0.87水平上聚为一类，QK-18与QK-19出菇均很少，产量低，在0.88水平上聚为一类，QK-9前两茬菇均为假菇，第三茬菇才正常，故产量也很低，与它们在0.84水平上聚为一类。与亲本K95-1在0.8水平聚在一类的菌株QK-7、QK-8、QK-16的菇形均与K95-1比较像，单菇重和出菇数均与K95-1差不多。也有不太吻合的现象，如QK-15产量较高，超过双亲，菇盖和亲本K95-1差不多，但其菇柄太长，远超过双亲，农艺性状与QK-18和QK-19相差较大，但与它们在0.86相似水平上聚为一类。QK-1无菌褶，个较小，但与亲本秋6在0.82水平上聚为一类。分析原因可能为杂交子的农艺性状由多基因控制，一种分子标记方法不能将所控制性状的基因的差别均显示出来，如果加入多种分子标记方法同时比较可能会更好的区分各杂交子的农艺性状。参考文献1. 包立生应用灰色关联度综合评价抗虫杂交棉新品种上海农业学报，2005，21(1)：12-142. 陈海玲，黄金堂，李清华应用灰色关联分析法评价福建省春花生新品种江西农业学报，2006，18(5)：11-133. 陈五岭，姚胜利He-Ne激光在香菇速生高产菌株选育中的应用()光子学报，1997，26(11)：972-9764. 蔡衍山，黄秀治香菇新菌株Cr-20Cr-62选育报告中国食用菌，2000，(04)5. 付立忠，吴学谦，魏海龙，吴庆其，李海波，张新华，贾亚妮.我国食用菌育种技术应用研究现状与展望食用菌学报，2005，12 (3)：63-686. 关荣霞，郭小丽，刘冬成，曹双河，张爱民小麦T型细胞质雄性不育恢复基因Rf6的ISSR标记分析中国农业科学，2002，35(11)：297-13017. 黄华康用灰色关联度法对福建省水稻区试品种的分析评价中国农学通报，2005（12）8. 荆建国，范彦英，王素阁灰色系统理论在大豆品种综合评价中的应用大豆科学，1995，119. 纪荣昌，陈山虎，卢和顶，