高中生物 第1部分 专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修1.ppt

第1部分 专题5 课题3 理解教材新知 把握热点考向 应用创新演练 知识点一 知识点二 考向一 考向二 1 透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质 2 利用凝胶色谱法分离蛋白质时 相对分子质量大的先洗脱出来 相对分子质量小的后洗脱出来 3 在电泳中 待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小 形状都会影响分子的迁移速度 4 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小 5 蛋白质提取和分离的一般步骤是 样品处理与粗分离 纯化和纯度鉴定 6 在对蛋白质进行纯度鉴定时 使用最多的方法是sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 自读教材 夯基础 形状和大小 电荷 亲和力 1 蛋白质分离的理论依据 2 分离的方法 1 凝胶色谱法 根据分离蛋白质的一种有效方法 也称做法 2 电泳 概念 指在电场的作用下发生的过程 原理 在一定的下 多肽 核酸等生物大分子的可解离基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动 相对分子质量的大小 分配色谱 带电粒子 迁移 ph 正电或负电 相反 影响电泳效果的因素 带电性质 大小 形状 迁移速度 方法 常用的电泳方法有电泳和电泳 琼脂糖凝胶 聚丙烯 酰胺凝胶 3 缓冲溶液 1 配制 由1 2种溶解于水中配制而成 通过调节缓冲剂的就可以得到不同ph范围内使用的缓冲液 2 作用 在一定范围内 抑制外界的对溶液ph的影响 维持ph基本不变 缓冲剂 使用比例 酸和碱 跟随名师 解疑难 1 凝胶色谱法 1 凝胶 是一些微小多孔的球体 内含许多贯穿的通道 具有多孔的凝胶 又称为分子筛 2 原理 2 电泳的常用方法 1 琼脂糖凝胶电泳 由于琼脂糖本身不带电荷 所以 各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异 分子大小 形状不同而不同 从而得以分离 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶形成 单体 丙烯酰胺 交联剂 n n 亚甲基双丙烯酰胺 引发剂和催化剂三维网状结构凝胶 加入sds的作用 使蛋白质发生完全变性 解聚成单条肽链 与各种蛋白质形成蛋白质 sds复合物 sds所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量 掩盖了不同蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于分子的大小 特别提醒 测定蛋白质相对分子质量通常用sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳 原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强 可用检测仪直接测定 自读教材 夯基础 杂蛋白 1 样品处理 1 红细胞的洗涤 目的 去除 以利于后续步骤的分离纯化 措施 分离 低速短时间离心 用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆 下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤 如此重复三次 2 血红蛋白的释放 目的 使红细胞破裂释放 过程 血红蛋白 离心 滤纸 脂溶性沉淀层 分液漏斗 2 粗分离 透析 1 方法 将血红蛋白溶液装入透析袋中 将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中 透析12h 2 目的 将的杂质除去 3 原理 透析袋能使自由进出 而将保留在袋内 小分子 大分子 物质 相对分子质量较小 3 纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 1 凝胶色谱柱的制作 取长40cm 内径为1 6cm的玻璃管 两端需用砂纸磨平 柱底制作 打孔 挖凹穴 安装 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 柱顶制作 打孔 安装玻璃管 组装 将上述三者按相应位置组装 并在下端出口连接带开关的尼龙管 尼龙管放入收集器 移液管头部 2 凝胶色谱柱的装填 色谱柱固定于支架上 干凝胶的计算和称量 溶胀 干凝胶用蒸馏水充分溶胀后 配成 装填 打开 将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内 洗涤平衡 装填完后 立即连接洗脱瓶 用20mmol l的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12h 凝胶悬浮液 下端出口 3 样品的加入和洗脱 调整缓冲液面 与平齐 滴加透析样品 用量为1ml 样品渗入凝胶床 样品完全进入凝胶层 洗脱 打开下端出口 用洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱时 用试管收集流出液 每试管5ml 连续收集 凝胶面 磷酸缓冲液 底端 4 纯度鉴定在鉴定的方法中 使用最多的是电泳 sds 聚丙烯酰胺凝胶 1 洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水 提示 不能 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂 在未洗净血浆中的杂质蛋白前 红细胞如果提前破裂 就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起 加大了分离的难度 2 在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么 提示 加入蒸馏水使红细胞吸水涨破 细胞膜的主要成分中含磷脂 磷脂易溶于甲苯等有机溶剂 加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白 3 血红蛋白呈现红色 这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义 提示 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 跟随名师 解疑难 实验结果分析与评价1 对血液样品处理后样品发生的变化 1 正常现象 由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色 与二氧化碳结合呈暗红色 所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色 2 分层不明显的原因 洗涤次数少 未完全除去血浆蛋白 3 红细胞不纯净的原因 离心速度过高或时间过长 使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成 2 判断装填的凝胶色谱柱成功与否 3 对分离效果的判断 1 若血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整地随洗脱液缓慢流出 则装填成功 分离操作正确 2 若血红蛋白的红色区带歪曲 散乱 变宽 则说明分离效果不好 装填不成功 特别提醒 洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一 如果样品出现浑浊 有沉淀 可离心或过滤后再加样 洗脱液应维持流速的恒定 即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定 例1 下图表示对某蛋白质溶液进行sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果 相似于纸层析法分离色素 下列相关叙述不正确的是 a 蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电 电场中带电的蛋白质分子 或多肽 会向着与其所带电荷相反的电极移动b 蛋白质在sds 聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少c 蛋白质在sds 聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质量的大小d 电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种 但也可能只有一种 解析 蛋白质的氨基与羧基可发生解离 使其带正电或负电 在电场中发生迁移 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的sds可完全掩盖蛋白质本身所带电荷 故其移动速度与本身所带电荷无关 而由其分子大小决定 sds 聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链 故结果所示可能只有一种蛋白质 有两种肽链 也可能是两种蛋白质 答案 b 蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关 在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外 蛋白质的带电性质 电量 形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度 例2 凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术 由于设备简单 操作方便 不需要有机溶剂 对高分子物质有很高的分离效果 目前已经被生物化学 分子生物学 生物工程学 分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用 不但应用于科学实验研究 而且已经大规模地用于工业生产 据图回答问题 1 a b均为蛋白质分子 其中先从层析柱中洗脱出来的是 原因是 2 自己制作凝胶色谱柱时 在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代 3 装填凝胶色谱柱时 色谱柱内不能有气泡存在 原因是 4 洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 填 相同 或 不同 洗脱时 对洗脱液的流速要求是 5 若选用sephadexg 75 则 g 表示 75表示 解析 本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项 可按以下思路进行分析作答 1 原理 由于不同蛋白质其相对分子质量不同 相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道 只能在凝胶外部移动 路程短 速度快 易洗脱 相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道 路程长 速度慢 2 注意事项 凝胶色谱柱的制作 底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱 相当于多孔板 凝胶色谱柱的装填 装填时尽量紧密 不得有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法 样品的加入和洗脱 洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20mmol l的磷酸缓冲液 洗脱时 对洗脱液的流速要求保持稳定 答案 1 aa相对分子质量较大 无法进入凝胶内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快 2 尼龙网和尼龙纱 3 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 4 相同保持稳定 5 凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围凝胶得水值 即每克凝胶膨胀时吸水7 5g 1 实验结果如果不理想 需要重做时 必须进行凝胶