分子克隆常用工具酶.ppt

第二章分子克隆常用工具酶 田振东Tianzhd Tel 87286939Office 园林楼620 植物基因工程 每一单链具有5 3 极性两条单链间以氢键连接两条单链 极性相反 反向平行以中心为轴 向右盘旋 Structureandfeatures DNA的基本结构 植物基因工程 植物基因工程 Replication 植物基因工程 分子克隆操作过程 克隆目的基因 将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接 制成重组DNA 导入宿主细胞 筛选 鉴定 扩增和表达 植物基因工程 工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割 连接 聚合 反转录等有关的各种酶系统称为工具酶 要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来 需要各种限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 要把不同片段连接起来 需要DNA连接酶 ligase 要合成基因或其中的一个片段 需要DNA聚合酶 polymerase 等 因此 酶是DNA重组技术中必不可少的工具 植物基因工程 核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类 核酸内切酶核酸外切酶 DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶 磷酸酶核苷酸激酶核苷酸转移酶甲基化酶 植物基因工程 限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶 用于核酸操作的常用工具酶 常用的工具酶性质及功能 植物基因工程 植物基因工程 第一节分子克隆最常用两个工具酶 植物基因工程 限制性内切酶Restrictionenzymes 植物基因工程 限制性内切酶是一种能识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶 植物基因工程 一 限制性核酸内切酶的分类 植物基因工程 二 限制性核酸内切酶的命名原则 名属种株序菌株来源称名名名号EcoR EcoR EscherichiacoliRHind Hind HaemophilusinfluenzaedHind Hind HaemophilusinfluenzaedHpa Hpa Haemophilusparainfluenzaea Hind 代表从流感噬血杆菌 Haemophilusinfluenzae d株中分离到的第3个限制酶 植物基因工程 一般分子量为60kd 单链多肽 最适pH为6 8NaCl有抑制作用 能被Mg2 激活 巯基有保护作用对热不稳定 通常贮存于 20 环境 为避免反复冻溶使酶失活 商品酶均含有50 甘油 使用时添加相应的缓冲液稀释 降低反应液中甘油的浓度 三 限制性核酸内切酶学特性 植物基因工程 每一种酶都有各自特异识别位点 它对底物要求有特异的序列 通常的识别序列是4bp 6bp 有些则为7bp 8bp 甚或多于8bp 多数限制酶的识别序列为回文结构 在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键 植物基因工程 植物基因工程 不同限制性内切酶切割的三种结果 植物基因工程 植物基因工程 植物基因工程 植物基因工程 同尾酶 植物基因工程 温度 一般37 盐离子浓度 Na Mg2 缓冲体系 具有稳定pH环境的Tris HCl缓冲体系DTT用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油浓度 商品化的限制性内切核酸酶均加50 甘油作为保护剂 一般在 20 保存 酶切反应时 加酶的体积一般不超过总反应的10 否则甘油浓度过高 影响酶切反应 反应时间 通常为1h 进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 DNA纯度和结构DNA样品中所含的蛋白质 有机溶剂 RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA DNA的甲基化位置会影响酶切反应 四 影响酶切反应的条件 植物基因工程 II型限制性核酸内切酶酶解反应体系 植物基因工程 星 活性Staractivity 星 活性 高浓度的酶 高浓度的甘油 低离子强度 极端ppH值等 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象 在名称右上角加一个星号 表示 如EcoR AATT EcoR GAATTC必须采用规范的实验步骤 应用推荐的反应条件 植物基因工程 植物基因工程 位点偏爱 sitepreference 某些限制性内切酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率 植物基因工程 第二节DNA连接酶DNALigase 植物基因工程 定义 催化DNA上裂口两侧 相邻 核苷酸裸露的3 羟基和5 磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键 使断开的DNA 裂口连接起来功能 具有修复单链或双链的能力 在DNA重组 复制和损伤后的修复中都起关键作用 一 DNA连接酶性质 植物基因工程 植物基因工程 两种DNA连接酶比较 二 常用连接酶 植物基因工程 连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数 多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15 以下 然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37 但在该温度下 粘性末端之间的氢键结合是不稳定的 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷 所以连接反应一般采用16 过夜 三 DNA连接酶的反应条件 植物基因工程 DNA浓度 外源片段浓度比载体DNA浓度高5 10倍由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多 故在平末端连接反应中 T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高 防止环化 碱性磷酸酶预先处理质粒载体时间 过夜最好 1 粘性末端DNA片段的连接 植物基因工程 直接用T4DNA连接酶连接 效率不高 较少采用 同聚物加尾连接平末端DNA片段 先用末端核苷酸转移酶 给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接用衔接物连接平末端DNA分子 目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点 经酶切后产生特异的粘性末端 从而与具有互补末端的DNA连接 2 平末端DNA片段的连接 植物基因工程 植物基因工程 应用互补同聚物加尾法连接DNA片段 植物基因工程 用衔接物分子连接平末端的DNA片段 衔接物 指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的 具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段 植物基因工程 四 重组DNA实验的一般程序 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶 如EcoRI 作位点特异的切割 形成全长的具粘性末端的线性DNA分子再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化 混合 加入DNA连接酶 由于具有相同的 如EcoRI 粘性末端 能退火形成双链结合体 其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后 便产生稳定的杂种DNA分子 植物基因工程 第二节其他分子克隆工具酶 一 DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶 依赖于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶 依赖于DNA的DNA聚合酶 植物基因工程 用途 DNA缺口平移中标记DNA探针 大肠杆菌DNA聚合酶I 以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3 OH端而合成新的DNA 植物基因工程 植物基因工程 基本用途 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 Klenowfragment 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理 获得N端三分之二的大肽段 即Klenow酶 Klenow酶仍拥有5 3 的DNA聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性 但失去了5 3 的核酸外切酶活性 植物基因工程 植物基因工程 植物基因工程 植物基因工程 有3 5 的核酸外切酶活性和5 3 的DNA聚合酶活性 在无dNTP时 可以从任何3 OH端外切 T4DNA聚合酶 T4phageDNApolymerase 植物基因工程 基本用途 植物基因工程 TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌 Thermusaquaticus 中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶 最适温度75 80 需要Mg2 10mmol L 在低浓度Mn2 2mmol L 中有低活性 Ca2 使其完全失活 一价阳离子高至0 1moI L对活性无影响 而最适浓度NaCl为40mmol L KCl为60mmol L最适pH7 8 Tris HCl 与大肠杆菌DNA聚合酶相比 其最大特性是耐高温和无核酸酶活性 TaqDNA聚合酶 植物基因工程 催化RNA体外合成反应依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶 RNA聚合酶 植物基因工程 反转录酶 reversetranscriptase 反转录酶具有5 3 的DNA聚合酶活性 以RNA为模板聚合cDNA链 同时又具有3 5 和5 3 的RNA外切核酸酶活性 AMV和MLV 主要用途 转录mRNA成为cDNA制备基因片段 植物基因工程 双向外切DNA RNA杂合链中的RNA链 植物基因工程 DNA和RNA的修饰酶 核酸酶SI碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶 植物基因工程 1 单链核酸酶SI 功能 降解ssDNA或ssRNA形成5 磷酸末端的单或寡核苷酸片段 植物基因工程 植物基因工程 应用 分析DNA RNA杂交体结构 S1mapping 确定内含子部位 切除DNA片段上的单链末端 形成平末端 切开cDNA合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失 植物基因工程 植物基因工程 Rnase和DNase RNase FreeDNase是一种DNaseI 核酸内切酶 可以降解双链或单链DNA RNaseH 特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键 故能分解RNA DNA杂交体系中的RNA链 该酶不能消化单链或双链DNA RNaseA 广泛应用的核酸内切酶 对RNA有水解作用 但对DNA则不起作用 Rnase酶非常稳定 常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活 DEPC处理 碱性磷酸酶 功能 催化去除DNA RNA上的5 端磷酸基团 从DNA片段上除去5 磷酸以防自身连接 用途 在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接 植物基因工程 植物基因工程 CalfIntestinalAlkalinePhosphatase CIAP 磷酸激酶 T4 多核苷酸磷酸激酶 植物基因工程 植物基因工程 末端脱氧核苷酸转移酶 功能 在一定条件下 催化将一个一个的脱氧核苷酸 沿着5 到3 加到DNA链的3 OH末端 该过程不需要DNA模板 对双链 单链DNA都适用 经常用于人工粘性末端的构建 末端脱氧核苷酰转移酶 TDT 植物基因工程 甲基化酶 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员 用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割 Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基 受其影响的酶有BccllII MbbooII等 Dcm甲基化酶识别CCmAGG或CCmTGG序列 在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基 受其影响的酶有EccooRIIII等 植物基因工程 基因工程中常用的工具酶 植物基因工程 植物基因工程 思考题 载体构建的工具酶主要有那些类型 限制性核酸内切酶 同裂酶 同尾酶 宿主的限制与修饰 核酸内切酶命名原则 操作注意事项及产生星活性的原因 影响其酶活性的因素 T4DNA连接酶的性质及用途 Klenow酶的基本性质及用途 其他工具酶的用途 练习题 1 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果 EcoRI5kbEcoRI HindIII1 2 3 4kbHindIII3kb 7kbEcoRI PstI2 3 5kbPstI10kbHindIII PstI1 3 6kb将各限制酶位点绘制在DNA分子上 2 另一DNA分子经相同处理后得如下结果 将各限制酶位点标在DNA分子上 EcoRI1 3 6kbEcoRI HindIII1 3kbHindIII4 6kbEcoRI PstI1 3 5kbPstI2 8kbHindIII PstI2 6kb3 下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点 两位点相距10bp 现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能 他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区 他应如何设计此实验 假定EcoRI PstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析 但PstI位点左侧的DNA不能除去 4 假如PstI位点为另一限制酶HindIII 实验又该如何设计 5 现有一研究者打算将一EcoRIDNA片段克隆到一个DNA分子的BamHI位点以便DNA扩增 但扩增后的DNA分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收 如何设计此实验 6 一研究生要将一质粒 pI 上的BamHI HindIII片段取代另一质粒 pII 上的BamHI XbaI片段 所获重组质粒 pIII 上的插入片段要求能用BamHI HindIII进行回收 问如何设计此实验 7 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示 已知HindIII克隆片段中的BamHI 3kb 片段含有一完整的基因编码区 现要将此3kb的BamHI片段克隆到另一表达载体pB的BamHI位点 如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架 如何证明插入基因的转录方向是相同的 8 为了检测绿豆核酸酶对5 端突起的单链DNA切割是否准确有效 即该酶只除去单链而不损伤双链区 有一研究者设计了一套非常精巧的实验 其中一个实验是将一XbaI片段插入pBR322的Apr基因内的ScaI位点使该基因失活 然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致 你能否设计出这一套实验 pBR322除含有Apr基因外 还含有Tcr基因 9 某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区 现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒 他应做什么实验来检查插入片段的