地贫筛查中血红蛋白电泳教学PPT课件.ppt

地贫筛查中的血红蛋白电泳操作技术解放军第三0三医院血液实验室王荣新 1 血红蛋白的组成 血红蛋白由血红素与珠蛋白组成血红素 铁原子与原卟啉 复合物 珠蛋白 包括 和 珠蛋白6种 血红蛋是由两种不同的鳌合了血红素的珠蛋白肽链所形成的四聚体结构 在人体的不同发育时期 其主要的血红蛋白 Hb 组成不同 2 人体发育过程中H 的组成 3 Hb的种类 A 正常的Hb分三类a HbA 2 2 b HbF 2 2 c HA2 2 2 B 异常Hb有两类a 快速异常Hb 稳定Hbb 慢速异常Hb 不稳定Hb 4 基层常用的电泳分析方法 醋酸纤维膜电泳琼脂凝胶电泳 5 醋酸纤维膜电泳 主要过程 琼脂凝胶电泳 RBC洗涤 制备溶血 点样 电泳 染色与脱色 扫描法 比色法 分区剪下色带 洗脱分区切割色带 融化琼脂 干燥 透明 比色 6 血红蛋白电泳设备 7 醋酸纤维膜电泳 8 9 10 HbA2的常用测定方法 原理 根据不同Hb自带电荷的不同 分子量大小的不同 结构和等电点的不同 在一定pH值的缓冲液中朝特定方向泳动 在一定的电压下经一定时间 可分离出各自的区带 主要类别 醋酸纤维素膜电泳法琼脂凝胶电泳法HbA2含量测定 洗脱法扫描法 11 血红蛋白A2测定 不连续电泳将HbA2分离后 分别剪出膜条中的HbA和HbA2区带 分别放入试管中 HbA加蒸馏水20ml HbA2加4ml 浸泡30分钟 不定时摇动 使Hb完全冼脱下来后混匀 用721分光光度计以波长413nm蒸馏水校正零点 读取光密度OD值并计算出结果 12 抗碱血红蛋白 HbF 测定 设备 721分光光度计 刻度吸管 秒表 玻璃漏斗 滤纸 试剂 1 12mol LKOH或NaOH溶液 酸性半饱和硫酸铵溶液 方法 取两支试管 测定管加入溶血液0 1ml 对照管加入0 02ml 于测定管中加入KOH1 6ml 摇匀 1分钟时立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3 4ml 倒转6次 放10分钟 滤取溶液检测 用波长540nm蒸馏水校正零点 分别读取测定管和对照管光密度OD值 计算出结果 14 HbCS的区带多在HbA2位置的前后 含量低 2 左右 很不稳定 有时还可分开成三或四小区带 用联苯胺染色可确定 HbE为慢速异常区带 其位置相当于HbA2 HbH和HbBart s为快速异常区带 15 全自动Hb电泳仪 目前国内使用的主要有美国的Helena电泳仪 扫描仪和分析系统 法国的Sebia电泳仪 扫描仪和分析系统 国产的金桑特电泳仪 扫描仪和分析系统 1 通过扫描定量给出HbA HbA2和HbF值 2 异常区带通过查表确定 16 HbE区带的鉴别 A 联苯胺染色 鉴定是否为HbB 区带位于HbA2区带位置上 在阴性 泳动速度最慢的一种异常Hb 难与A2区分开C HbA2定量在10 以上 应考虑为HbED HbE纯合子只有HbF和HbE HbE高达95 以上 17 HbH区带的鉴定 A 联苯胺染色 确定是否为HbB 在阳极 泳动速度最大的Hb区带C HbH包含体阳性 D pH6 5缓冲液 酸性 唯一向阳性 移动的Hb区带E Hb MCV MCH F HbBart s区带在HbH区带后 泳动速度比HbH稍慢些 有Bart s区带 一般都有H区带 H含量高达30 多 但不会超出40 低少到1 左右 18 HbA2在血红蛋白病中的意义 HbA2组成 2 2HbA2参考值 1 2 3 5 HbA2含量的改变 HbA2水平升高 是 地贫基因携带者的特征性标志 故HbA2定量的准确与否 对于临床一线 地贫基因携带者的筛查至关重要 19 血红蛋白 Hb 病 1 血红蛋白病 基因突变导致合成的珠蛋白肽链结构异常 如 镰状细胞血红蛋白病 HbS 2 地中海贫血 基因突变导致一种或多种珠蛋白肽链合成减少或缺如 地贫 3 获得性血红蛋白病 接触或误服化学药物 20 Hb病为世界上发病率最高危害最大的单基因遗传病 被WHO列为严重危害人类健康六大疾病之一 全球约有4 83 的人口携带Hb病基因 每年各类重型地贫 包括地贫复合异常Hb病类型 患儿的出生率不低于2 4 据此推算 全球每年至少约35万Hb病患儿出生 至今为止 全球在分子水平上已鉴定出近1000种不同的珠蛋白突变基因 其中包括700多种异常Hb变异体和200余种 地贫基因以及70多种 地贫突变 其中中国人群中异常Hb 地贫基因和 地贫突变各占70多种 34种和11种 21 临床常见的异常血红蛋白 以速度快慢排序1 血红蛋白E A22 血红蛋白D S3 血红蛋白G4 血红蛋白K5 血红蛋白J6 血红蛋白H 22 Hb电泳操作中的经验与教训 1 RBC洗涤 离心的速度和时间要够 生理盐水与血比例要5 1 血浆与冼涤生理盐水要尽量吸干净 2 制备溶血 加入的溜水 溶血剂与红细胞体积要符合要求 离心的速度和时间要够 3 点样 血红蛋白液适量 不能太宽 4 电泳 醋纤膜浸泡时间要够长 平衡时间要够 5 染色与脱色 时间要够 23 1 正常新生儿9 轻型 地中海贫血2 胎儿水肿综合征10 异常HbD杂合子3 地中海贫血1 脐血 11 异常HbG杂合子4 HbCS HbH病型12 轻型 地中海贫血复合HbE5 重型 地中海贫血复合HbE13 正常成人6