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第三章细胞培养基本技术 1 内容 原代细胞分离 培养 酶消化法和组织块培养法 细胞生长状况的观察 培养细胞一代生长过程 传代 冻存与复苏 细胞培养注意事项 如细胞污染 细胞培养的一些专业术语介绍 如细胞株 系 上皮细胞型 成纤维细胞型 2 第一节细胞原代培养 原代培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养 3 原代培养组织或细胞的特点 1 组织和细胞刚刚离体 生物学特性未发生很大变化 仍具有二倍体遗传性 最接近和反映体内生长特性 是药物测试 细胞分化等实验的很好对象 2 缺点是成分组成比较复杂 因而原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定 如要做较为严格的对比性实验研究 还需对细胞进行短期传代后进行 4 一 原代培养的方法 一 消化培养法 二 组织块培养法 三 其它 如机械方法 5 一 消化培养法 1 培养前的准备 培养用品的消毒根据所要进行的具体培养对象如组织块贴壁原代培养 末梢血白细胞培养 传代培养等 准备培养所需器械和物品 清点无误后进行清洗 包装和消毒灭菌 培养室的消毒培养室每天用0 2 的新洁尔灭或2 5 的来苏儿拖洗地面一次 拖布专用 30瓦紫外灯管照射消毒30 50分钟 超净工作台的消毒 6 2 无菌培养操作注意事项 为保证无菌 除实验所需物品需预先消毒外 实验中还需保持无菌操作 工作台面上的用品要布局合理 原则上是右手使用的东西置右侧 左手使用的东西置左侧 酒精灯置中央 实验前点燃酒精灯 一切操作如安装吸管帽 打开或封闭瓶口等 都应在火焰近处并经过烧灼进行 7 3 常用消化试剂 胰蛋白酶 胶原酶 蛋白水解酶 EDTA 8 4 原代细胞培养程序 1 取材2 漂洗3 剪切4 消化5 过滤6 清洗7 计数8 接种 9 1 培养细胞的取材 1 取材的组织最好尽快培养 若不能及时培养 可将组织浸泡于培养液内放置于冰浴或40C冰箱 若组织块很大 应先将其切成1cm2以下的小块再低温保存 但时间不能超过24小时 因放置时间长或组织块太大都易造成细胞的死亡 2 取材时严格无菌操作 用预先消毒好的器皿和带有少量培养液的培养瓶进行取材 所取组织要尽量避免紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘 汞等 从消化道及周围有坏死组织等有污染因素存在的区域取材时 为减少污染 可用含500 1000单位 ml的青 链霉素BSS液漂洗5 10分钟 或用10 达克宁注射液冲洗浸泡10分钟再作培养 3 取材时要细心去除组织中的血液 结缔组织 脂肪及坏死组织等 修剪和切碎过程中 为避免组织干燥 可将其浸泡于少量培养液中 10 原代细胞培养操作 鼠胎组织细胞培养为例 取材 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡 把整个孕鼠浸入盛有75 乙醇的烧杯中数秒钟消毒 取出后放在大平皿中携入超净台 用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤 剖腹取出子宫置于无菌平皿中 用消过毒的剪刀剪开子宫 取出鼠胎 剪去头 爪 以平衡盐溶液洗去血污切割 用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次 然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎 直到成1mm3左右的小块 再用平衡盐溶液清洗 洗到组织块发白为止 静置数分钟 使组织块自然沉淀到管底 弃去上清消化 接种培养 加入0 25 胰蛋白酶消化液 5 10倍量 与组织块混匀 置37 水浴 观察消化情况 每隔几分钟摇动一下试管 静止 吸去上清 加入5 10ml细胞培养液 用吸管吹打混匀 移入二个培养瓶中 置于二氧化碳培养箱中培养 11 2 例如 滋养层细胞分离与培养 A 真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于冰浴PBS 含1mM葡萄糖 中取回 B 在无菌条件下立即用无Ca2 和Mg2 的PBS漂洗15 20次以除去血块 C 用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛 用剪刀剪碎至1 2毫米左右 D 加入5 胰蛋白酶330 l 1 25 至10ml细胞悬液中 4 消化45min 勿动 静置 然后去上清 E 重新加入消化液37 消化10min 勿动 静置 然后去一半上清 加等体积Ham sF12 DMEM1 1 FD 培养液 内含10 胎牛血清 1mM丙酮酸钠和2mM谷氨酰胺 终止消化 吹打细胞悬液 12 F 再加入终浓度为15IU ml的DNA酶 37 消化10min 吹打细胞呈悬浮状 经80目和150目细胞筛过滤 1 000 rpm离心10min收集细胞 G 重复离心洗涤二次 再次重悬细胞 细胞悬液经1 25 2 5 BSA FD配制 的密度梯度沉降1h H 收集淡黄色的细胞滋养层细胞 清洗一次 接种于涂有I型胶原的24孔培养板中 于37 95 空气和5 CO2条件下培养 I 所得细胞经免疫荧光染色cytokeratin7阳性 vimentin阴性 本方法所获得细胞滋养层细胞纯度约为95 左右 13 3 计数 14 15 16 细胞浓度的计算 Volume 体积 長x寬x深度 1mmx1mmx0 1mm 0 1mm3 1x10 4cm3 ml 17 细胞密度 个 mL 4个大方格的细胞总数 4 10 4 4个大方格的细胞总数 4 104 18 动物细胞工程的实验室基础 表3 3培养器皿特性 表3 3培养器皿特性 表3 3培养器皿特性 培养器皿特性 AnimalCellBiotechnology CollegeofVeterinaryMedicine MABao hua 19 动物细胞工程的实验室基础 培养器皿特性 AnimalCellBiotechnology CollegeofVeterinaryMedicine MABao hua 20 动物细胞工程的实验室基础 培养器皿特性 AnimalCellBiotechnology CollegeofVeterinaryMedicine MABao hua 21 原代细胞培养程序 1 取材2 漂洗3 剪切4 消化5 过滤6 清洗7 计数8 接种 22 4 原代细胞实验操作要领 除去组织块多余水分操作要领 器械使用的操作要领 原代细胞混匀的操作要领 严格无菌操作 离心管入台时要做好管口的消毒 23 高密度接种 细胞多 调节环境能力大 细胞易存活 一般细胞接种数为5 105 ml 高度分化二倍体细胞 肝脏 胰 神经组织接种数为106 108 ml 高分化细胞常用塑料器皿培养 因塑料器材表面涂有多聚赖氨酸等碱性物质 可增加细胞贴壁率 用玻璃器材 细胞常不贴壁 需要涂细胞外基质 要注意做好标记 24 培养板或培养瓶的标记 25 二 组织块培养法 1 组织块翻转干涸法培养 适于组织块移植 组织量少和细胞易于游离出来的组织 26 流程 直接从机体某一器官取下组织 尽可能剥除脂肪 纤维结缔组织等 用Hanks液清洗组织 将组织切割后剪成碎块 1 2mm3 低速离心去上清 将组织小块接种于培养器皿内 组织块翻转干涸法培养 经过3 4h的锚定以后 轻轻的加入0 5培养基 27 注意 铺细胞外基质 FN 纤粘连蛋白 胶原 或MatrigelTM胶 MatrigelTM胶 BD公司 特点 4 情况下呈液态 至37 培养箱中 30min后凝固成胶体状 测量细胞迁移的距离所用的软件为ImageJ 28 关键的过程 组织块贴壁时间灵活掌握 5 8h翻转 29 2 湿润系统培养组织块 组织块贴壁10分钟后 先加0 5ml培养液湿润组织块 37度孵育过夜 次日从瓶侧面缓慢加入2ml培养基 30 总的流程 31 三 非化学法游离细胞 1 离心 取材为血液 羊水 胸水和腹水等细胞悬液时 可采用离心法分离 一般用500 1000rpm的低速离心 时间约5 10分钟 若一次离心的样品量很多 时间可适当延长 但离心速度过大 时间过长 细胞常会因挤压而造成损伤甚至死亡 2 切割分离 在进行组织块培养时 可采用剪切法 一般多剪切成1mm2左右大小的块 主要步骤 取1cm2大小的组织块 置入青霉素瓶或小烧杯中 左手斜位持容器 右手持眼科剪或弯剪 柄愈长愈好 伸入容器中 反复剪切组织至要求大小为止 成糊状 加入3 5mlHanks液 轻轻吹打片刻 低速离心 去上清 余下组织块即可用于培养 32 3 机械分离 某些软组织如脑 胚胎及一些肿瘤组织可采用此法进行分散 有以下方法 1 把组织放在注射器内通过6号针头挤压出 2 剪切到一定程度后用吸管反复吹打 3 反复用剪刀剪切后收集脱落下来的细胞 4 挤压通过不锈钢纱网 5 用Dounce宽缝玻璃匀浆器手动慢速研磨组织 33 第二节培养细胞的观察 34 一 培养细胞生长状况常规检查 1 培养液 颜色与透明度的变化2 细胞生长状况 3 细胞形态变化 4 微生物污染 35 1 培养液PH值 颜色变化 变黄 表示PH值下降 细胞生长旺盛 代谢产生的酸性物不断积累导致 变红或紫红色 表示PH值上升 细胞生长停滞 死亡 一般生长稳定的细胞需要2 3天换液1次 生长慢的细胞需要3 4天换液一次 36 原代细胞换液 原代细胞经24小时培养 培养液颜色变浅 表示细胞代谢好 少量换液可刺激细胞生长 通常每周两次 每次换半量或1 5 1 3量 原代细胞第1次换液时 切记不要把培养液全部倒掉 37 1 培养液换半量的方法 A 瓶口消毒B 从瓶侧面吸去原培养液量的一半 C 从瓶侧面补加等体积新培养液 D 培养液覆盖细胞面 瓶口消毒加盖 38 2 细胞系 株 换液 条件合适时生长迅速 过夜就变黄 可进行全量换液 这种情况下 最好减少细胞接种数 延长换液的时间 方法 39 2 细胞生长状况 常规应特别注意细胞的生长增殖情况 原代细胞 经历一个适应或潜伏期 细胞系 多为24小时以内 细胞长满瓶底80 时应及时传代 40 3 细胞形态变化 生长良好细胞 透明度大 折光性强 轮廓不清 生长状态不良时 细胞折光性变弱 轮廓增强 胞质中常出现空泡 脂滴 颗粒样物质 细胞之间空隙加大 41 4 微生物污染 培养液颜色与透明度 培养液混浊 液体内漂菌丝或细胞菌 支原体污染 没有明显症状 但细胞生长却明显变缓 42 细胞培养的污染和检测 细胞污染的种类细菌 酵母菌 霉菌和病毒污染源无菌操作技术不当操作室环境不佳污染之血清污染之细胞 43 细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了 洋葱佰克霍尔德菌 Burkholderiacepacia 原属假单胞菌属 是植物病原菌 44 白色念珠菌污染 45 真菌感染 46 支原体污染电镜照片 煎蛋状和其他形状 47 二 培养细胞分型 体外培养细胞的生长类型 按生长方式 2型1 粘附型 贴壁依赖性 细胞 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞2 悬浮型细胞 不必附着于固相支持物表面 而在悬浮状态下即可生长的细胞 只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 48 粘附 贴壁 依赖型 性 细胞 唯有粘附于固相表面才能生存的细胞细胞在体内 外的粘附方式 存在差异体内 粘附是全方位外形具有复杂的立体特征体外 多数情况 细胞只有一个附着平面外形一般与体内时明显不同体外培养的贴壁细胞 按照培养细胞的主要形态 可分为几大类型 49 贴壁型细胞按照其生长类型进行分类 根据形态大致的不同 主要2类 上皮样成纤维细胞样其它 不定型 游走细胞型以及多细胞型 50 1 上皮样细胞型 名称 仅形态上似体内 实际上不完全等于体内情况 来源 类似于返祖现象 来源于内 外胚层 如 皮肤及其衍生物消化道 乳腺 肺泡上皮性肿瘤形态 类似体内的上皮细胞扁平 不规则多角形 中有圆形核 51 生长特点 易相连成片相靠 紧密相连 成薄层 铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动 52 2 成纤维细胞样细胞 名称 凡在培养中形态与成纤维细胞类似来源 由中胚层间充质组织起源的组织如 真正的成纤维细胞 心肌 平滑肌 成骨细胞 血管内皮形态 似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2 3个长短不等的突起 中有卵圆形核 53 生长特点 排列成放射状 漩涡状并不紧靠连成片 细胞 细胞接触易断开而单独行动游离的单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 54 3 悬浮生长型 概念培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源自血 脾或骨髓 尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点在悬浮中生长良好细胞圆形 单个或小细胞团 55 优点生存空间大 提供数量大传代方便 不需消化 易于收获可获得稳定状态缺点观察不方便很多细胞不能悬浮生长 尤以正常细胞 56 4 培养细胞的形态不稳定 条件改变 细胞形态可有变化 57 培养细胞形态不稳定血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮样细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞样上皮样细胞细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮样细胞生长状态改变悬浮或贴附悬浮贴附圆形成纤维或上皮样转化与否未转化转化后成纤维样可成上皮样 58 三 细胞培养中的常用术语 1 组织培养 TissueCulture 指的是从体内取出组织 在模拟体内生理环境 使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 2 器官培养 OrganCulture 培养的是器官的原基 器官的一部分或整个器官 使之在体外生存 生长和保持一定功能的方法 3 细胞培养 CellCulture 培养物是单个细胞和细胞群 59 4 原代培养 primaryculture 从体内取出细胞或组织的第一次培养 5 传代 passage 也称再培养无论是否稀释 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养 也称再培养 6 细胞系 cellline 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系 60 7 亚系 sub line 由原细胞系分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系 8 有限细胞系 finitecellline 细胞系形成后仅能维持有限传代次数 最后死亡 9 连续或无限细胞系 continuouscelllineorinfinitecellline 具有无限繁殖能力 获得不死性 immortality 和能反复进行传代细胞系 61 10 细胞株 cellstrain 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株 11 亚株 sub strain 由原细胞株分离出的具有原株性状不同的细胞株 62 12 体外培养转化 invitrotransformation 细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化 但不一定具有致癌性 13 汇合 confluent 细胞相互连接成片占据所有底物面积 14 超汇合 superconfluent 单层培养细胞附在底物上生长 汇合后发展成多层状态 15 接触抑制 contactinhibition 细胞汇合相互接触后失去运动的现象 63 16 克隆 clone 由单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体 17 克隆形成率 cloningeffeciency 向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数 64 四 培养细胞一代生长过程 体外培养细胞从细胞接种到分离再培养 每代贴附生长细胞的生长过程一般要经过以下五个阶段 游离期 贴壁期 潜伏期 指数增生期 停止期 65 细胞传代的三个阶段 1 游离期 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态 也称悬浮期 此时细胞质回缩 胞体呈圆球形 10分钟一4小时 66 细胞附着于底物上 游离期结束 细胞株平均在10分钟一4小时贴壁 底物 胶原 玻璃 塑料 其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素 胶原等糖蛋白 生长基质 这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上 悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着 进口塑料培养瓶涂有生长基质 化学合成的功能基团 2 贴壁期 67 68 69 3 潜伏期此时细胞有生长话动 而无细胞分裂 细胞株潜伏期一般为6 24小时 70 4 对数生长期 指数增生期 细胞数随时间变化成倍增长 活力最佳 最适合进行实验研究 指数生长期是细胞活力最好的时期 在接种细胞数量适宜情况下 指数生长期持续3 5d后 随细胞数量不断增多 生长空间日趋减少 细胞相互接触汇合成片 呈现接触抑制 Contactinhibition 而恶性细胞则无接触抑制现象 因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制 Densityinhibition 71 5 停止期 平台期 细胞长满瓶壁后 细胞虽有活力但不再分裂机制 接触抑制 密度依赖性 72 四 原代培养细胞的生命期 原代培养期传代期衰退期 73 细胞培养的生长过程 a 原代培养或初代培养期首次培养 1 4周 细胞接种后一般几小时内就能贴壁 并开始生长如接种的细胞密度适宜 5天到一周即可形成单层 74 b 传代期 细胞在培养器皿中生长一定时间后 被分开接种至两个或者更多的培养器皿中 数天到一周左右 目的 传代以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞 并维持细胞种的延续培养的细胞形成单层汇合以后 由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭 将培养的细胞分散 从容器中取出 以1 2或l 3或l 5以上的比率转移到另外的容器中进行培养 即为传代培养 75 细胞传代方法 3种 1 悬浮生长细胞传代离心法传代 离心 1000转 分 去上清 沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法 悬浮细胞沉淀在瓶壁时 将上清培养液去除1 2一2 3 然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 2 半悬浮生长细胞传代 Hela细胞 此类细胞部分呈现贴壁生长现象 但贴壁不牢 可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来 进行传代 3 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代 常用的消化液有0 25 的胰蛋白酶液 76 贴壁生长细胞传代方法 1 吸光培养瓶中的培养液2 加入0 5 2ml0 25 的胰蛋白酶液 以消化液能覆盖整个瓶底为准 然后两种方式处理 一种30S后 吸去消化液 剩余的酶液继续作用 后在相差显微镜下观察 第二种 不吸去消化液 静置2 10min 显微镜下动态监测 在倒置镜下观察被消化的细胞 如果胞质回缩 细胞变圆 相互之间不再连接成片 3 吸去胰蛋白酶液 加入含血清的培养液 77 4 用吸管吸取瓶内培养液 反复吹打瓶壁细胞 形成细胞悬液 按顺序 然后离心沉淀细胞 5 吸取1 2 5细胞悬液 接种于新的培养瓶内 6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内 7 将后者放入培养箱中培养 78 盖玻片条细胞培养法 1 盖玻片的准备 1 购买 2 小砂轮将盖玻片划成大小不一数块 再经95 酒精浸泡 蒸馏水冲洗 干燥备用 3 消毒 硫酸纸包或小皿 2 细胞接种 培养皿先加少量培养液 再加盖玻片 79 在此期间细胞开始时虽仍然存活 但生殖已经很缓慢并逐渐完全停止 进而细胞发生衰亡 死亡 传代30 50次以后 c 衰退期 80 第四节细胞冻存 复苏和运输 81 冻存和复苏的原则 慢冻快融 当细胞冷到零度以下 可以产生以下变化 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 相反 结晶就大 大结晶会造成细胞膜 纲胞器的损伤和破裂 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 82 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂 能大大提高冻存效果 常用的低温保护剂是DMSO 它是一种渗透性保护剂 可迅速透入细胞 提高胞膜对水的通透性 降低冰点 延缓冻结过程 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外 在胞外形成冰晶 减少胞内冰晶 从而减少冰晶对细胞的损伤 83 细胞冻存方法 1 预先配制冻存液 含20 血清培养基10 DMSO2 取对数生长期细胞 经胰酶消化后 加入适量冻存液 用吸管吹打制成细胞悬液 1 106 5 106细胞 ml 3 加入1ml细胞于冻存管中 密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 84 冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢 4 30 60分钟 20 30分钟 80 16 18小时 或过夜 液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期 活力大于90 无微生物污染 细胞浓度控制在 1 107 5 107 ml 85 简易程序 将冷冻管 管口要朝上 放入纱布袋内 纱布袋系以线绳 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口 按每分钟温度下降1 2 的速度 在40分钟内降至液氮表面 停30分钟后 直接投人液氮中 根据原理 标准程序 当温度在 25 以上时 1 2 min当温度达 25 以下时 5 10 min当温度达 100 时 可迅速放入液氮中细胞冻存器 86 细胞复苏方法 l 从液氮中取出冷冻管 迅速投入37 38 水浴中 使其融化 1分钟左右 2 5分钟内用培养液稀释至原体积的5 10倍以上 3 低速离心10分钟 4 去上清 加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 87 解冻与复苏要点 快速解冻冻存细胞从液氮中取出后 立即放入37 水浴中 轻轻摇动冷冻管 使其在1分钟内全部融化 不要超过3分钟 24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液 以去除DMSO 88 细胞运输 1 长距离运输 几天 选择生长良好细胞 换细胞液 补充新培养液至瓶颈部 保留微量空气 拧紧瓶盖 瓶子口用胶密封 并用棉花包 放在携带者贴身口袋带回 或用包装盒空运 2 短距离运输 几小时 去掉大部分生长液 仅留少量液体覆盖单层细胞 防止细胞干燥 将细胞附着面朝上带回 3 液氮冻存运输 89 细胞培养常见问题解答 90 3 为何培养基保存于4 C冰箱中 颜色会偏暗红色 且pH值会越来越偏碱性 培养基保存于4 C冰箱中 培养基内之CO2会逐渐溢出 造成培养基越来越偏碱性 而培养基中之酸碱指示剂 通常为phenolred 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红 培养基偏碱之结果 将造成细胞生长停滞或死亡 若培养基偏碱时 可以通入无菌过滤之CO2 以调整pH值 91 4 培养细胞生长减慢可能原因 由于更换不同培养液或血清比较新培养液与原培养液成分 比较新血清与旧血清支持细胞生长实验增加起始培养细胞浓度培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏让细胞逐渐适应新培养液 换入新鲜配制培养液 补加谷氨酰胺或生长因子 92 培养物中有少量细菌或真菌污染用无抗生素培养液培养 如发现污染 丢弃培养物 或用抗生素除菌 试剂保存不当血清需保存在 5 到 20 培养液需在2 8 避光保存 含血清完全培养液在2 8 保存 并在2周内用完 93 5 培养细胞不贴壁 胰蛋白酶消化过度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度支原体污染分离培养物 检测支原体 清洁支架和培养箱 如发现支原体污染 丢弃培养物培养液中无贴壁因子 94 6 欲将一般动物细胞离心下来 其离心速率应为多少转速 欲回收动物细胞 其离心速率一般为300 xg 约1 000rpm 5 10分钟 过高之转速 将造成细胞死亡 95 8 培养液pH值变化太快 CO2张力不对按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度 2 0g L到3 7g L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5 到10 改用不依赖CO2培养液培养瓶盖拧得太紧松开瓶盖1 4圈NaHCO3缓冲系统缓冲力不足加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度 96 培养液中盐浓度不正确在CO2培养环境中改用基于Earle s盐制的培养液 在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液细菌 酵母或真菌污染丢弃培养物或用抗生素除菌 97 9 培养液出现沉淀 但pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来用去离子水反复冲洗玻璃器皿 然后除菌冰冻保存培养液将培养液加热到37 摇动使其溶解如沉淀仍然存在 丢弃培养液 98 10 培养液出现沉淀 同时pH发生变化 细菌或真菌污染丢弃培养物抗生素除菌 99 11 原代细胞培养物污染 原代培养组织在进入培养前已污染培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织 100 12 支原体 mycoplasma 污染的细胞 是否能以肉眼观察出异状 不能 除极有经验之专家外 大多数遭受支原体污染的细胞株 无法以其外观分辨之 如有支原体污染 直接灭菌后丢弃 以避免污染其它细胞株 101 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成 从形态上区别死 活细胞是困难的 1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上 其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆 克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比 克隆形成数 接种细胞数缺点 操作繁琐优点 精确 可靠 102 2 台盼蓝法活细胞不被染色 死细胞染成蓝色 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力已淘汰 103 3 四唑盐 MTT 比色法四唑盐 MTT 商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物 formazan 并沉淀在细胞中 而死细胞没有这种功能 二甲亚砜 DMSO 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比 再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速 准确 广泛应用于新药筛选 细胞毒牲试验 肿瘤放射敏感性实验等 104 操作步骤 1 单细胞悬液接种于96孔培养板 103 104细胞 孔 每孔培养基总量200微升 96孔培养板每孔容积370微升 37 5 CO2培养箱中培养一段时间 根据实验目的决定培养时间 2 加入2毫克 毫升的MTT液 50微升 孔 继续培养3小时 3 吸出孔内培养液后 加入DMSO液 150微升 孔 将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟 使结晶物溶解 4 酶标仪检测各孔OD值 检测波长570纳米 记录结果 绘制 105 106 3 MTT法 3 4 5 二甲基噻唑 2 2 5 二苯基四氮唑溴盐 原理 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物 formazan 并沉淀在细胞中 而死细胞没有这种功能 DMSO能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比 再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速 准确 广泛应用于新药筛选 细胞毒性试验 肿瘤放射敏感性实验等 107 操作步骤a 100 L单细胞悬液接种于96孔板 5 104 b 培养24h后 加药 设六个平行样 c 给药72h后 加入0 5mg mL的MTT液 50 L 继续培养4h d 吸出孔内培养液后 加入DMSO 200 L 然后微孔板扳荡器上振荡10分钟 e 酶标仪检测各孔OD值 检测波长570nm 抑制率 1 给药组平均OD 对照组平均OD 100 108 实验结果 剂量细胞抑制率 g mL SGC 7901HepG 21 15 2 19 95072 056 910083 078 215082 979 5IC50分别为22 406 g mL和31 429 g mL 109 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成 从形态上区别死 活细胞是困难的 1细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上 其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆 克隆形成卒用来表示细胞的增