结核病实验室生物安全与菌株运输ppt课件.ppt

结核病实验室生物安全及菌株运输 内容 一 结核病实验室生物安全二 结核菌株或样本运输三 风险评估 3 一 结核病实验室生物安全 4 结核杆菌的生物学性状 1 结核杆菌为细长略带弯曲的杆菌 约1 4 0 3 0 6 m 常聚集成团 牛型比人型略粗短 2 分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高 约占干重的60 特别是其中的大量分枝菌酸可影响染料的穿入 3 一般用萋 尼 ZiehlNeelsen 抗酸性染色法 以5 石炭酸复红加温染色后可以染上 但着色后不易被盐酸酒精脱色 5 结核杆菌的生物学性状 4 若再加用美蓝复染 则分枝杆菌呈红色 而其它细菌及背景中的物质为蓝色 5 专性需氧 最适温度为37 低于30 或高于42 均不生长 营养要求较高 生长缓慢 初次分离需要营养丰富的培养基 常用的有Lowenstein Jensen培养基 内含蛋黄 甘油 无机盐和孔雀绿等 6 细胞壁的脂质含量较高 影响营养物质吸收 故生长缓慢 在一般培养基中每分裂一代需要10多个小时 在人体内需24 36小时 6 结核杆菌的生物学性状 7 一般10 30天可见菌落生长 菌落呈颗粒 结节或花菜状 乳白色或米黄色 不透明 8 结核杆菌细胞壁中含有大量脂质 可防止菌体水分的丢失 故对干燥的抵抗力特别强 沾附在尘埃上保持传染性8 10天 在干燥痰内可存活6 8个月 9 结核杆菌对湿热敏感 在液体中加热62 63 后15分钟或煮沸即被杀死 7 结核杆菌的生物学性状 10 结核杆菌对紫外线敏感 直接日光照射数小时可被杀死 可用于结核患者衣服 书籍等的消毒 11 结核杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系 如痰液可增强结核杆菌的抵抗力 因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固 包在细菌周围 使细菌不易被杀死 12 5 的石炭酸在无痰时30分钟可杀死结核杆菌 有痰时需要24小时 5 的来苏儿无痰时5分钟杀死结核杆菌 有痰时需要1 2小时 8 结核杆菌的生物学性状 13 结核杆菌对酸 3 HCL 或碱 4 NaOH 有抵抗力 15分钟不受影响 可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质 14 结核杆菌对1 75000结晶紫或1 13000孔雀绿有抵抗力 加在培养基中可抑制杂菌生长 15 结核杆菌对链霉素 异烟肼 利福平 环丝氨酸 乙胺丁醇 卡拉霉素 对氨水杨酸等敏感 但长期用药容易出现耐药性 而吡嗪酰胺的耐药性 5 9 实验室安全操作 原则 1 实验室应按等级要求完善实验设施 如生物安全柜的抽风排风功能 紫外灯消毒 生物安全柜内的除菌滤膜定期更换等 2 普通实验室应注意气流方向 实验过程中尽量避免强气流变化而产生气溶胶 如 人员走动等 3 易产生气溶胶或出现溅出的操作 如涂片 离心或其它操作 应在BSL 2实验室的 级生物安全柜中进行 并使用个体防护设备 10 4 尽可能减少使用注射器针头 实验中使用注射器时 用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头 应直接放入锐气收集器 以免划破皮肤造成接种感染 5 试验结束后 操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的实验器械或物品 能够高压的必须进行高压消毒 6 实验中发生意外污染情况 应立即报告 实验室安全操作 原则 11 实验室安全操作 意外事故处理 1 实验过程中 如标本或含标本的前消化处理液被打翻 污染操作台或地面 应以吸满75 乙醇溶液的卫生纸覆盖污染区 15分钟后卫生纸方可移去 2 实验过程中 如污染物溅落到身体表面 或有割伤 刺伤 烧伤 烫伤等情况发生 应立即停止实验并进行紧急处理 更换被污染的工作服 皮肤表面用消毒液清洗 伤口以碘酒及酒精消毒 眼睛用无菌生理盐水冲洗 3 被污染的器械等立即浸泡于含氯消毒剂或75 乙醇等溶液中 实验完成后再进行高压消毒处理 4 如果发生气溶胶污染或大面积污染 应立即停止实验并关闭实验室 对实验区域和实验室进行紫外灯照射消毒2小时以上 对污染区域进行空气熏蒸消毒 12 实验室安全操作 绝对禁止的处理方法 1 有可能造成污染面积扩大 如使用75 乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的区域 2 直接用火焰对未经任何处理的污染地面 操作台 器械进行烧灼处理 3 使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒 4 使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间 长距离照射消毒 13 实验室消毒与灭菌 1 物理消毒 紫外线 高压灭菌2 化学消毒 乙醇 过氧乙酸 苯酚 含氯消毒剂3 注意事项 物理消毒 紫外线 1 紫外线对结核杆菌有一定的杀灭作用 用辐射强度在100 w cm2以上的30W紫外线灯 相对湿度50 70 的条件下 照射40min以上 对空气中结核杆菌的杀灭效果可达99 9 以上 2 在液层厚度3mm含菌107 108cfu ml的结核杆菌的菌悬液 用10W紫外线灯在距离0 5m处持续照射3分钟 在距离1m处持续照射10分钟后 菌悬液经培养无活菌生长 3 紫外线穿透力弱 通常用于空气和物体表面消毒 对空气中细菌的杀灭更具优势 适合随时性空气消毒 物理消毒 高压灭菌 1 高压灭菌是对实验材料灭菌的最有效和最可靠的方法 2 通常下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器的灭菌效果 121 15min 115 25min推荐121 30min 化学消毒 乙醇 1 结核杆菌 纯培养物 直接接触70 75 乙醇5 30分钟可被杀死 可用于皮肤消毒 2 但由于乙醇能凝固蛋白 使痰表面形成一层把菌体包裹起来的膜 短时间内不能杀死细菌 通常乙醇不用于痰标本的消毒 化学消毒 过氧乙酸 1 过氧乙酸气溶胶渗透性强 易蒸发 作用快速 分解后不留有毒物质 适合于空气消毒 2 用5g L过氧乙酸水溶液经气溶胶喷雾器喷雾消毒 喷雾量为20 10ml m3 密闭60min以上 化学消毒 苯酚 1 主要通过破坏菌细胞膜而致细胞质内容物漏出 使菌体蛋白质变性 凝固 抑制菌体脱氢酶和氧化酶等酶系统杀死结核杆菌 2 2 苯酚5分钟 5 苯酚1分钟能杀死结核杆菌培养物 3 5 苯酚与痰液等量混合 24小时才能杀死结核杆菌 化学消毒 含氯消毒剂 含氯消毒剂能使菌体的酶失活 还能与蛋白质的氨基结合 使菌体蛋白氯化 代谢功能障碍 细菌死亡 但对在蛋白质混合液中的结核杆菌几乎无消毒效果 化学消毒 其它 1 结核杆菌较一般细菌对酸 碱抵抗力更强 可在临床或动物标本中加入4 NaOH 3 HCL和6 H2SO4 消化蛋白质及杀灭杂菌 以分离出结核杆菌 2 结核杆菌对染料 如1 13000孔雀绿和1 75000结晶紫有抵抗力 通常在培养基内加入一定量的孔雀绿或结晶紫抑制其他杂菌生长 21 注意事项 1 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品 实验完成后 应经高压消毒后方可丢弃或焚烧 2 可重复使用的试验用品及器械 高压灭菌后再清洗使用 3 试验用的试管 吸管 注射器 须装在加盖的容器内 经高压消毒后拿出实验室 4 培养物或实验室垃圾 在丢弃前必须经过高压灭菌处理 5 实验室内未经消毒的污水 禁止直接排入公共排水系统 更不允许混入居民生活垃圾 生物安全柜的使用 1 正确安装 确保安全柜与外部排风系统压力平衡 保证安全柜处于正常工作状态 定期维护和检测 确保安全性 2 在开始工作前应考虑实验中的操作步骤和所需设备 充分做好准备工作 3 尽量减少房间内人员走动 保证正常气流 4 准备好消毒剂和处理遗洒事件的物品 5 前窗开至适当高度 打开安全柜的灯和风机 23 生物安全柜的使用 6 将本次实验所需物品放入生物安全柜内 并按照清洁物和污染物分别排列 7 避免物品挡住隔栅 8 将手缓慢放入生物安全柜 并等待2 3min 操作时应在隔栅内侧靠近隔栅处操作 9 避免使用干扰安全柜内层流的实验手段 如离心和使用明火等 24 生物安全柜的使用 10 与污染物接触过的物品从生物安全柜中取出之前必须经表面去污处理 11 所有的托盘或容器从安全柜中取出前必须盖上 12 用75 酒精清洁安全柜所有内壁 清洁时安全柜风机必须处于风机工作状态 13 工作结束后 安全柜继续开机3 5min 14 关闭前窗 灯 风机 打开紫外灯 干净的物品 理想的工作台摆放原则 清洁 污染区 在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行 被污染的区域 垃圾袋 废弃物托盘 生物安全柜的使用 26 二 菌株运输 27 法律依据 1 病原微生物实验室生物安全管理条例 国务院令第424号2004 11 12 2 可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本运输管理规定 卫生部令第45号2005 12 28 3 人间传染的病原微生物名录 卫生部2006 1 11 4 中国民用航空危险品运输管理规定 CCAR276 5 危险物品航空安全运输技术细则 国际民航组织 28 相关定义 1 病原微生物 是指能够使人或者动物致病的微生物 2 实验活动 是指实验室从事与病原微生物菌 毒 种 样本有关的研究 教学 检测 诊断等活动 3 可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本 是指在 人间传染的病原微生物名录 中规定的第一类 第二类病原微生物菌 毒 种或样本 29 结核杆菌分类 人间传染的病原微生物名录 第二类 是指能够引起人类或者动物严重疾病 比较容易直接或者间接在人与人 动物与人 动物与动物间传播的微生物 样本检测 包括样本的病原菌分离纯化 涂片 显微观察 培养 药物敏感性实验 生化鉴定 免疫学实验 PCR核酸提取 等初步检测活动 30 县级将菌株或样本运输至州级 一 申请材料 原件一份 复印件三份 1 可感染人类的高致病性病原微生物菌 毒 种或样本运输申请表 doc 县级 2 容器或包装材料的批准文号 合格证书 复印件 或者高致病性病原微生物菌 毒 种或样本运输容器或包装材料承诺书 县级 3 申请方 县级 接收方 州级 双方法人资格证明材料 复印件 4 接收菌株或样本的单位 州级 同意接收的证明文件 州级自己拟定文件并加盖单位公章 备注 接收单位 州级 具备从事高致病性病原微生物实验活动资格的证明 即要求接收单位 州级 在当地卫生局进行病原微生物实验活动备案 31 县级将菌株或样本运输至州级 二 运输有关规定 1 在固定的申请单位 县级 和接收单位 州级 之间多次运输相同品种菌株种或样本的 可以申请多次运输 多次运输的有效期为6个月 期满后需要继续运输的 应当重新提出申请 2 应当通过陆路运输 没有陆路通道 必须经水路运输的 可以通过水路运输 紧急情况下或者需要将菌株或者样本运往国外的 可以通过民用航空运输 3 有关单位或者个人不得通过公共电 汽 车和城市铁路运输菌株或样本 32 县级将菌株或样本运输至州级 二 运输有关规定 4 运输菌株或者样本 应当由不少于 人的专人护送 并采取相应的防护措施 5 承运单位应当与护送人共同采取措施 确保所运输的菌株或样本的安全 严防发生被盗 被抢 丢失 泄漏事件 33 县级将菌株或样本运输至州级 三 被盗 被抢 丢失 泄漏事的处理 承运单位护送人保藏机构 承运单位的主管部门护送人所在单位保藏机构的主管部门 县级卫生主管部门或者兽医主管部门 公安机关 县人民政府 市级卫生主管部门或者兽医主管部门 省级卫生主管部门或者兽医主管部门 国务院卫生主管部门或者兽医主管部门 市人民政府 省 市 自治区人民政府 任何单位和个人 小时 小时 小时 小时 小时 小时 1小时 34 菌株或样本运输包装要求 35 菌株或样本运输包装要求 36 菌株或样本运输包装 主容器 37 菌株或样本运输包装 次级容器 38 菌株或样本运输包装 外包装 39 菌株或样本运输流程 40 三 风险评估 41 结核杆菌实验室实验活动 不同实验操作的实验室生物安全级别要求 1 BSL 3实验室 根据 名录 的规定 在实验操作涉及结核杆菌的大量培养 制备 结核杆菌离心 冻干等易产生气溶胶的实验操作 2 BSL 2实验室 临床样本的结核杆菌分离培养 药物敏感性实验 生化鉴定 免疫学实验 PCR核酸提取 涂片 显微观察等初步检测活动 3 BSL 1实验室 对经有效方法灭活后不含结核杆菌活菌材料的分子生物学 免疫学等实验 42 实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施 1 实验样本的接收与开启临床含结核菌样本在运输过程中可能会因容器盖子脱落或破碎使一些菌体产生气溶胶 扩散进入空气而造成污染 预防措施应采取防护措施 要求接收和打开样品要在 级生物安全柜内打开 小心操作 避免产生气溶胶 操作人员要佩戴N95口罩 并准备好消毒剂 43 实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施 2 结核杆菌培养 固体 液体培养 在进行结核杆菌接种培养过程中 样本开封 转移 吸管吹吸 漩涡振荡混匀 离心等步骤均可产生气溶胶 在样本转移过程中培养物混合液的溅出 泼洒和容器的破碎等也可造成严重污染 预防措施 1 在 级生物安全柜工作台面应当放置一块垫布 避免感染性物质的滴溅 使用后将其高压灭菌 操作过程中最好使用无菌的一次性吸管 2 涡旋振荡 离心过程中应拧紧样本容器盖子 待气溶胶沉淀后在 级生物安全柜打开盖子 3 样本容器尽可能使用塑料制品 足够坚固 盖好盖子后应无泄漏 4 样本接种后将其固定在架子上 尽可能保持直立 44 实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施 3 结核杆菌药敏试验在药敏试验中菌悬液制备时 需对培养物进行研磨 在使用玻璃研磨器时容器内会产生压力 含有感染性物质的气溶胶就可能逸出 玻璃容器可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者 预防措施应采取防护措施 使用玻璃研磨器时应戴手套 N95口罩 操作和打开研磨器时应当在 级生物安全柜内进行 45 实验活动中可能造成不良后果的因素与预防措施 4 培养物与实验废弃物销毁在待销毁培养物转移过程中培养物混合液溅出 泼洒和容器的破碎等可造成严重污染 实验室内实验废弃物容器外表可能污染病原微生物 未经消毒转移造成污染 用于销毁的培养物与实验废弃物 置入高压灭菌器 如装得过满或过于密闭 可能造成灭菌不彻底 将未灭活的培养物与实验废弃物送出室外 对人与环境造成极大威胁 预防措施 1 传代菌种或培养物销毁应有销毁程序及相应原始记录 所有菌种或培养物灭活或销毁时应均有2人以上共同执行 销毁记录应包括销毁方式 销毁物品明细 灭菌温度与时间 2 在生物安全柜内产生的所有废弃物 出