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文档简介

聚合酶链反应 PCR 聚合酶链 PCR 技术 PCR反应体系 PCR技术过程及原理 1 聚合酶链反应技术 聚合酶链反应 PCR 技术是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程 也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术 2 PCR的反应体系 参与PCR反应的成分 模板 引物 dNTP TaqDNA聚合酶 Mg2 缓冲液 3 模板 即为要被复制的核酸片段条件 需要较高的纯度 4 引物 化学合成的寡核苷酸条件 1 一般长度为20个核苷酸2 两条引物的序列不能互补3 两条引物之间的Tm值不能相差太多 5 dNTP 4种核苷酸条件 4种核苷酸的浓度需要一致 否则容易出现DNA聚合酶错配的概率 6 TaqDNA聚合酶 是从水栖嗜热菌中提取的一种酶 能催化DNA合成 具有5 端 3 端的外切酶活性 7 Mg2 是TaqDNA聚合酶的辅助因子 可以稳定其活性 8 缓冲液 在扩增过程中使PH值维持在7 2左右 使DNA聚合酶发挥最大的活性 9 PCR技术基本过程 变性退火延伸 10 变性 在熔点温度的条件下 94 左右 使双链DNA结构的氢键断裂 形成两条单链分子作为扩增反应的模板 以便与引物结合 94 DNA双链解开 11 退火 将反应体系温度将至熔点温度以下 40 70 以便使引物与模板DNA序列互补 形成杂交链 40 70 引物与DNA模板杂交 12 延伸 将反应体系的温度升至72 此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3 端 在TaqDNA聚合酶的作用下 杂交链不断延伸 直至形成新的DNA双链 新的DNA又可以作为下一个模板进行扩增 如此反复循环 可以到达数十万倍到百万倍的扩增数72 4种dNTP在引物和DNA聚合酶的的作用下延伸 13 定量PCR技术 指在PCR反应体系中加入了荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 14 Taqman荧光探针 5 端荧光基团FAM3 端淬灭基团 15 PCR扩增时 Taq酶的5 3 外切酶活性将探针酶切降解 使探针上的荧光基团和淬灭基团分离 使荧光基团在激发光作用下发出荧光 每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 16 荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准 即PCR扩增产物量的标准 阈值线 实时定量PCR的两个重要概念 17 Ct值 cyclethreshold 的概念 指PCR扩增过程中 扩增产物 荧光信号 到达阈值时所经过的扩增循环次数 它与起始拷贝数的对数成线性关系 即与起始拷贝数反比关系 阈值线 18 方法学评价
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