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染色体标本制备及核型分析 染色体核型分析 1 一 名词解释二 染色体标本制备三 染色体核型分析 实验耗材前期处理实验步骤 玻片标本质量评价计数标准 合格指标染色体核型排列核型检测的可重复性 2 一 名词解释 核型分裂相 一个体细胞中的全部染色体 按其大小 形态特征顺序排列所构成的图像 小鼠 40 XY 40 XX人类 46 XY 46 XX 细胞分裂过程中每个时期的细胞形态特征 包括细胞的总体形状和遗传物质的变化 3 一 名词解释 数量变异 性染色体丢失 增加 近端着丝粒染色体三体 中期 分裂相核型 结构变异 缺失 重复 倒位 易位 4 二 染色体标本制备 实验耗材 仪器设备 超净工作台 恒温培养箱 恒温水浴箱 离心机 光学显微镜 刻度离心管 乳头吸管 棕色试剂瓶 载玻片 吹风机 玻片架 染色缸主要试剂 秋水仙素 低渗液 卡诺氏固定液 吉姆萨染液 胰酶 1NHCl 1NNaOH MEF培养基 PBS 5 二 染色体标本制备 前期处理 样品要求 对数期生长 状态良好 紧密度高 折光性好 细胞量 T25 60mm平皿差速贴壁法去除MEF KSR培养体系除外 终止培养前1 2小时 加入秋水仙素 100ug ml 最终浓度为0 1 0 2ug ml 6 7 二 染色体标本制备 实验步骤 8 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 消化并收集细胞至离心管 吹打成单细胞悬液 250g 5min离心 弃上清 实验步骤 9 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 加入37 预热的低渗液 0 075mol L 5ml 吹打至均匀 37 水浴15 20min 实验步骤 10 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 加入37 预热的低渗液 0 075mol L 5ml 吹打至均匀 37 水浴15 20min 实验步骤 配制 0 075mol LKCl溶液作用 低渗作用因素 时间 温度 浓度 11 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 离心弃上清 将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔地重悬细胞 沿管壁缓慢加入固定液0 5 1 0mL 边滴加边震荡均匀 静置5min后离心弃上清 12 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 离心弃上清 将细胞沉淀震荡悬浮或气泡吹打法轻柔地重悬细胞 沿管壁缓慢加入固定液0 5 1 0mL 边滴加边震荡均匀 静置5min后离心弃上清 配制 甲醇 冰乙酸 3 1 现用现配 作用 固定并维持染色体结构的完整性防护 甲醇 毒性 冰乙酸 刺激性和腐蚀性 13 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 1 加入3ml固定液 静置30min 离心弃上清 2 再次加入3ml固定液 吹打均匀并静置30min 14 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 离心弃上清液 根据细胞数量情况 加入1 2mL固定液 吹打细胞制成悬液 悬液呈微白色时为最佳 15 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验内容 用滴管吸取细胞悬液 高空滴在冰冻玻片上 立即在酒精灯的火焰下过火几次 置80 烤箱中烤片2h 16 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 用滴管吸取细胞悬液 高空滴在冰冻玻片上 立即在酒精灯的火焰下过火几次 置80 烤箱中烤片2h 要求 洁净 冰冻处理 逐片清洗 洗洁精 超声波 自来水 纯水 95 乙醇浸泡24h 纯水逐片刷洗 放置于装有纯水的器皿中 4 保存 17 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 预热胰蛋白酶消化25 30s Giemsa染色10min 清水冲洗染液 用吹风机吹干 18 二 染色体标本制备 细胞收获 制片 固定 预固定 低渗处理 实验步骤 预热胰蛋白酶消化25 30s Giemsa染色10min 清水冲洗染液 用吹风机吹干 要求 0 25 pH6 8 7 2作用 去除染色体上的蛋白质 便于染色 配制 Giemsa原液 磷酸缓冲液 pH7 4 1 9 现用现配 19 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 玻片颜色 蓝紫色玫红色着色浅 解决方案 配制新的染液 适当提高胰酶消化玻片的时间 20 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 细胞密度 过密适中过稀 解决方案 制备玻片时 对每一个样品都先进行试片 并在镜下观察细胞密度 从而调整悬液密度 21 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相密度 足够稀少 解决方案 适当提高固定液中冰醋酸比例 制备较多的玻片 22 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 紧密度 过密适中过散 解决方案 过密 适当提高固定液中冰醋酸比例 过散 适当降低固定液中冰醋酸比例 23 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 过密适中过散 解决方案 过密 适当提高固定液中冰醋酸比例 增加滴片高度 过散 适当降低固定液中冰醋酸比例 减小滴片高度 24 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 分裂相形态 解决方案 尽量将细胞吹打成单细胞悬液 滴片时勿重复滴加同一区域 重叠 25 三 染色体核型分析 玻片标本质量评价 染色体形态 适中短小过长扭曲交联消化过度 26 三 染色体核型分析 计数标准合格指标 分裂相需完整独立 染色体不过于松散 周围无其他距离很近的分裂相 染色体形态适中 不过度短小或纤长 染色体彼此间无交联缠绕或者交联的染色体能明确的区分 染色体G显带普遍较清晰 质检人员能够精确的判断核型位置 计数30个分裂相 正常比例 50 数量是否异常暂不涉及核型排列 结构是否异常 27 三 染色体核型分析 染色体核型排列 28 三 染色体核型分析 染色体核型排列 29