HPLC基本理论.ppt

第一部分基本理论 色谱起源 色谱分离过程 色谱法定义和特点 1 色谱法定义 利用物质的物理化学性质建立的分离 分析方法实质 分离目的 定性分析或定量分析色谱法与光谱法的主要区别 色谱法具有分离及分析功能 而光谱法不具备分离功能 分析混合物最有力的手段 2 色谱法的特点 1 分离效率高 2 应用范围广 3 分析速度快 4 样品用量少 5 灵敏度高 6 分离和测定一次完成 可以和多种波谱分析仪器联用 7 易于自动化 可在工业流程中使用 色谱法的分类 气 液色谱法GLC气相色谱法气 固色谱法GSC 液 液色谱法LLC液相色谱法液 固色谱法LSC 按两相物理状态分 按分离原理分 吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法排阻色谱法 凝胶色谱法 基本类型色谱法的分离机制 1 吸附柱色谱法 要求 固定相 吸附剂 硅胶或Al2O3 具表面活性吸附中心分离机制 分离过程是样品中各组分分子 Xm 与流动相分子 Ym 在吸附剂表面活性中心竞争吸附的过程 第一步 吸附 第二步 解吸 第三步 再吸附第四步 再解吸 分配系数的微小差异 吸附能力的微小差异 微小差异积累 较大差异 吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出 2 分配柱色谱法 要求 固定相 机械吸附在惰性载体上的液体流动相 必须与固定相不为互溶载体 惰性 性质稳定 不与固定相和流动相发生化学反应分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 连续萃取过程 3 离子交换色谱法要求 固定相 离子交换树脂流动相 水为溶剂的缓冲溶液被分离组分 离子型的有机物或无机物分离机制阳离子交换树脂RSO3 H X RSO3 X H 固定离子 可交换离子 待测离子 4 分子排阻色谱要求 固定相 多孔性凝胶流动相 水 凝胶过滤色谱流动相 有机溶剂 凝胶渗透色谱分离机制 利用被测组分分子大小不同 在固定相上选择性渗透实现分离 离子对色谱 离子对色谱法是将一种 或数种 与溶质离子电荷相反的离子 称对离子或反离子 加到流动相或固定相中 使其与溶质离子结合形成离子对 从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法 离子对形成机理 把和被测物离子A电荷相反的离子B 对离子或反离子 加入到流动相中 使待测离子A与反离子B形成离子对AB 该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同 即间接改变了待测离子的保留特性 离子对形成机理 续 例如 固定相为非极性键合相 流动相为水溶液 在流动相中加入与待测离子A 有相反电荷的离子B 由于离子对A B 具有疏水性 因而被非极性固定相提取 其它待测离子A1 A2 A3 因与B 间的成对能力不同 形成不同疏水性的离子对A1 B A2 B 使得各待测物在柱内的保留值不同 从而达到分离的目的 键合相反相离子对色谱法 根据流动相和固定相的极性分为 反相离子对和正相离于对色谱法 其中以键合相离子对色谱法最重要 键合相离子对色谱的固定相采用非极性的疏水键合相 如十八烷基键合相 ODS 等 流动相为加有平衡离子 反离子 的极性溶液 如甲醇一水或乙睛一水 键合相反相离子对色谱法 键合相反相离子对色谱法操作简便 只要改变流动相的pH值 平衡离子的浓度和种类 就可在较大范围内改变分离的选择性 能较好解决难分离混合物的分离问题 此法发展迅速 应用较广泛 色谱中基本术语 一 色谱流出曲线 二 术语1 基线 baseline 2 死时间t0 tM deadtime 3 死体积V0 deadvolume V0 t0 F0 4 保留值 1 保留时间tR 2 调整保留时间tR 3 保留体积VR 4 调整保留体积VR 保留值与固定相和流动相的性质 固定相的量 柱温 流速和柱体积有关 5 相对保留值r21 特点 只与温度和两相的性质有关 而与柱径 柱长 填充情况及流动相流速等其它色谱操作条件无关 与色谱柱无关 反映了色谱柱对待测两组分1和2的选择性 色谱法中 特别是气相色谱法中 广泛使用的定性数据 5 峰高 h 6 色谱的区域宽度 1 标准偏差 2 半 高 峰宽W1 2 3 峰宽或称Wb Wb 4 1 699W1 2 1 分配系数K 无因次量 由组分及两相的热力学性质决定 只随柱温 柱压而变化 三 分配系数及分配比 结论 一定温度下 各组分在两相间的K不同 在色谱柱中的移动速度不同 使得原来K仅有微小差异的各组分在经过反复多次的分配后 产生很大的分离效果 K小的组分 较早流出色谱柱 K大的组分 较晚流出色谱柱 K 色谱分离的依据 2 分配比k 分配容量或容量因子 k值也决定于组分及两相热力学性质 不仅随柱温及柱压变化而变化 而且还与流动相及固定相的体积有关 3 分配系数 K 和分配比k的关系 令 色谱柱的相比 K和k与tR的关系 k值越大tR越长 要使各组分分离 它们的tR必须不同 而tR是由两组分的K或k决定 4 分配系数比 分离因子 大于1是分离的先决条件 最后从色谱图上得到以下信息 峰的数目 判断样品中所含组分的最少个数 根据峰的保留值进行定性分析 根据峰面积或峰高进行定量分析 根据保留值和峰宽 判断色谱柱的分离效能 由两峰间的距离 判断评价固定相和流动相选择是否合理 色谱分离的基本理论 色谱法是利用混合物中各组分在两相中的分配系数或吸附系数的不同而进行分离的 要使各组分实现有效的分离 必须考虑两方面的问题 第一 热力学问题 提出了塔板理论第二 动力学问题 提出了速率理论 一 塔板理论 1 理论假定 i 在柱内一小段长度H内 组分可以在两相间迅速达到平衡 这一小段柱长称为理论塔板高度H ii 流动相进入色谱柱不是连续的 而是脉动式 每次进入体积为一个塔板体积 Vm iii 所有组分开始时存在于第0号塔板上 而且试样沿轴 纵 向扩散可忽略 iv 分配系数在所有塔板上是常数 与组分在某一塔板上的量无关 柱效能指标 n H 理论塔板数N 组分流过色谱柱时 在两相间进行平衡分配的总次数理论塔板高度H 为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长 二 速率理论 塔板理论成功处 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大值对应的tR 阐明了保留值与K的关系 提出了评价柱效高低的n和H的计算式 塔板理论存在问题 1 做出了四个与实际不相符的假设 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程2 只定性给出塔板高度的概念 却无法解释板高的影响因素3 排除了一个重要参数 流动相的速度 因而无法解释柱效与流速关系 更无法提出降低板高的途径 速率理论 吸收了塔板理论的有效成果 H 并从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素 HPLC H He Hd Hs Hmm Hsm 固定相传质阻力 流动流动相传质阻力 滞留流动相传质阻力 涡流扩散 分子扩散 1 涡流扩散项He He A 2 dp 2 分子扩散项Hd 样品在色谱柱中滞留的时间愈长 色谱谱带的分子扩散也愈严重 Dm 10 5cm2 s 比在气体中要小4 5个数量级 所以在液相色谱中 纵向分子扩散项实际上可以忽略 3 传质阻力项 1 固定相传质阻力项Hs 2 流动相传质阻力项 流动的流动相的传质阻力Hmm 滞留的流动相的传质阻力Hsm VanDeemter方程 固定相粒度大小对板高的影响 总分离效能指标 分离度 又称为分辨率 峰距离近且峰宽 两峰严重相叠 选择性和柱效都很差 两峰距离拉开了 但峰形仍很宽