分子量(还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程.doc

细胞因子分子量（还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：中华人民共和国药典2005年版第三部。范围：适用于细胞因子蛋白质分子量测定。目的：测定待检品分子量是否符合中华人民共和国药典2005年版要求原理： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。其催化系统为过硫酸铵-TEMED系统。而SDS这种阴离子表面活性剂的加入，它能使蛋白质氢键、疏水键打开，并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素，从而达到分离不同组分的蛋白质的目的，并在还原剂巯基乙醇的存在下，（定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原；以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去，使蛋白质具有相同的构象），可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。内容：1 材料11样品：经二人复核批号无误后检测12试剂甲醇 CH3OH分析纯无水乙醇 C2H5OH分析纯浓盐酸 HCl分析纯甘油 C3H8O3 分析纯硝酸银 AgNO3 分析纯重铬酸钾 K2Cr2O7分析纯正丁醇 C4H9OH 分析纯甲醛 HCHO分析纯丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析纯甲叉双丙烯酰胺 （CH2CHCONH2）2CH2 分析纯过硫酸铵 （NH4）2S2O8 分析纯TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯甘氨酸 C2H5NO2 分析纯SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯乙酸 CH3COOH 分析纯碳酸钠 Na2CO3 分析纯-巯基乙醇 HSCH2CH2OH 分析纯溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯13分子量标准品：法玛西亚公司。14注射用水：符合中华人民共和国药典2005年版要求15设备扭力天平 上海第二天平仪器厂垂直板状电泳槽北京东方仪器厂恒温恒流电泳仪法玛西亚公司快速电泳槽BIORADUSA全自动扫描仪CS-930日本岛津TS-1型摇床16器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管、3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。2 方法21准备工作211工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。212调试仪器设备2121恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌。2122全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用”标志牌。2123扭力天平工作状态良好，已挂“备用”标志牌。213摘下扭力天平“备用”标志牌，挂“运行”标志牌。214配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。2141聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml 用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g, 甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。一般不超过12个月。2142分离胶缓冲液 100ml 用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2143浓缩胶缓冲液 100ml用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2144 1%SDS 50ml用扭力天平准确称取SDS 0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。2145 1% TEMED 50ml用吸管准确吸取TEMED0.5ml，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2146 1% 过硫酸铵 50ml 用扭力天平准确称取过硫酸铵0.5g，溶于50ml注射用水中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。2147电极缓冲液 3000ml 用扭力天平准确称取Tris9g 、甘氨酸43.2g、SDS3g，溶于2000ml注射用水中，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。2148固定液 500ml 用量筒准确量取甲醇250ml，乙酸50ml，补加注射用水至500ml，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。2149洗液 3000ml 用量筒准确量取无水乙醇300ml，乙酸150ml，补加注射用水至3000ml，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21410重铬酸钾溶液 200ml用扭力天平准确称取重铬酸钾10g，加注射用水至200ml；加浓HNO32ml摇匀溶解，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。21411硝酸银溶液 200ml用扭力天平准确称取硝酸银0.4g，加注射用水至200ml，置于棕色瓶中，避光保存，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，限当次试验使用。21412显色液 3000ml 用扭力天平准确称取Na2CO318g，加注射用水至3000ml，溶解后，加0.6ml甲醛，置于3000ml三角瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21413终止液 500ml 用吸管准确吸取乙酸5ml，溶于500ml注射用水中，置于500ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温贮存。21414样品处理液（还原型） 10ml用扭力天平准确称取Tris0.303g、SDS0.8g、溴酚蓝0.189g，溶于2ml注射用水中，加入甘油4ml，-巯基乙醇2ml，浓HCl 0.189ml，加注射用水定容至10ml，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4冰箱放置。215样品准备：将样品自冰箱内拿出，放置室温溶化后，将样品与样品处理液按3：1（V/V）的比例混匀，沸水处理35分钟，待用。22操作过程2211分离胶（13.5%）制备聚丙烯酰胺凝胶母液14.4ml, 分离胶缓冲液8ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水3.2 ml，1%过硫酸铵1.6ml，1%TEMED1.6ml，制成胶量32ml。2212浓缩胶（4.5%）的制备 聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml, 浓缩胶缓冲液4ml, 注射用水4.8ml，1%SDS 1.6ml，1%过硫酸铵1.6ml，1%TEMED1.6ml， pH6.8，成胶量16ml。2213灌胶 灌胶时先将电泳槽阳极侧用透析纸包上，在电泳槽内加满水，靠水压封住阳极侧缝隙，以免胶溶液漏出；在两玻璃板间加分离胶，加胶完毕后，用注射器沿玻璃板在液面上覆盖一层（约0.3cm高）正丁醇；待胶凝固后，将电泳槽内注射用水及胶表面的正丁醇倒掉，并用滤纸吸干；向电泳槽内加入电极缓冲液、在浓缩胶位置插上梳子，在分离胶上加浓缩胶，待胶凝固后抽去梳子。 222加样:将处理后样品按每孔不少于5ug的蛋白量，加入样品槽内，同时在另一测加入分子量标准品作对照。223电泳: 打开电泳仪，摘下“备用”标志牌，挂“运行”标志牌，调定电流， 起始电流15mA，待指示线跑至分离胶处，改电流为25 mA，电泳时间约为2.5小时，待指示剂至底线处，停止电泳,关闭电泳仪，摘掉“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。224染色电泳完毕后取下胶片，置于5倍胶体积的固定液内12h（或室温振荡30分钟）；洗液洗三次，每次10分钟，37摇床内振荡；取5ml重铬酸钾母液加入200ml注射用水中，将胶片置其中,避光,振荡10分钟；用注射用水洗数次至黄色本底变白；加入新配制的0.2 %AgNO3溶液白炽灯下照射30分钟；水洗五次；显色液500ml中加甲醛0.35ml，待样品蛋白带及分子量蛋白带清晰后弃去显色液加入终止液。225扫描2251打开扫描仪,摘下“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌。2252对胶片进行扫描,同时记录下扫描结果。2253关闭扫描仪,摘下“运行”标志牌,挂“备用”标志牌。226摘下场地“使用中”标志牌,挂“待处理”标志牌。3 结果判定31制作标准蛋白泳动曲线：以各标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。32计算检品的Rf值蛋白质样品移动距离 染色前胶长 脱色后胶长 指示剂移动距离Rf=在标准蛋白质分子量的泳动曲线上查得LogMW，查反对数表即得待检品的蛋白质分子量。33判定标准所得的检品蛋白质分子量结果与理论值进行比较，误差不超过10%，为合格。IFN1b理论值：19.4KDIFN2b理论值：19247 KD IFN2a理论值：19.2KDIL-2理论值：15.5KDGM-CSFb理论值：14.5KD34判定结果，填写记录。4 清场41需要低温贮存的液体放入冰箱，避光的液体放入阴暗处。42称药之后将药品瓶盖盖紧，放回药品柜。43关闭扭力天平，清洁干净后放回原处，挂“备用”标志牌。44清洁工作台面，用专用抹布擦净，地面用专用拖布拖净。45用过的玻璃器皿用纯化水冲洗干净后返回洗刷组。46填写清场记录。47 清场后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后,摘下待处理标志,挂“清场合格”标志牌。5 注意事项51本实验所用SDS需高纯度SDS,如不纯需重结晶。52样品必须经沸水处理3-5分钟,以免有亚稳聚合物存在。6引用文献61参考标准：中华人民共和国药典2005年版。62生化实验技术和方法，张龙翔主编，高等教育出版社。63医用实验病毒学。附:SDS-PAGE(快速电泳)准备工作同前。1 制胶11分离胶制备：（13.5%）聚丙烯酰胺凝胶母液7.2ml, 分离胶缓冲液4ml, 1%SDS 3.2ml，注射用水 1.6ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成胶量16ml。12浓缩胶的制备(4.5%)聚丙烯酰胺凝胶母液1.2ml, 浓缩胶缓冲液2ml,注射用水2.4ml，1%SDS 0.8ml，1%过硫酸铵0.8ml，1%TEMED0.8ml， pH6.8，