大肠菌群检验PPT课件.ppt

一 大肠菌群的食品卫生学意义 1 作为粪便污染食品的指标菌有来源特异性 即仅来自肠道 在肠道中的数量较多 易于检出 在外环境中有足够的抵抗力 能生存一定期间 食品细菌学检验方法敏感 特异 2 作为肠道致病菌污染食品的指标菌 1 二 大肠菌群的定义及检测方法 1 大肠菌群的传统定义大肠菌群 Coliformgroup 系指一群需氧及兼性厌氧 在37 24小时能发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌 包括肠杆菌科的艾希氏菌属 柠檬酸杆菌属 肠杆菌属和克雷伯菌属 其中以艾希氏菌属为主 称为典型大肠杆菌 其它三属习惯上称为典型大肠杆菌 2 大肠菌群检验的标准方法 1 最近拟数法 MPN GB4789 2 1994 2 样品0 1g 30 01g 30 001g 3乳糖胆盐发酵管37 24hr产酸产气管伊红美蓝平板 分离 37 24hr可疑菌落乳糖发酵管 证实 37 24hr根据经证实的乳糖胆盐发酵管阳性管数 查MPN表 3 2 平板直接计数法 SN0169 92 样品0 1g 20 01g 20 001g 2结晶紫中性红胆盐琼脂 VRBA 37 24hr计数紫红色菌落 乘以稀释倍数报告 4 3 ISO关于大肠菌群的定义 ISO9308 1 2000 ISO INTERNATIONALSTARDIZATIONORGANIZATION国际标准化组织 大肠菌群是革兰氏阴性 无芽孢 氧化酶阴性的杆状细菌 可需氧或兼性厌氧地生长在含胆盐 或其他具有同样抑制生长性能的表面活性剂 的培养基上 当在36 2 培养时 通常能于48hr内发酵乳糖产酸和醛 它们还具有 半乳糖苷酶 5 4 依据 半乳糖苷酶快速测定大肠菌群的原理 大肠菌群产生的 半乳糖苷酶可分解培养基中的酶底物 即色基与 半乳糖的结合物 使带色基团游离而显色或发荧光 该反应灵敏快速 测定 半乳糖酶常用的底物有4 甲基伞形酮 D半乳糖苷 MUGal 5 溴 4氯 3 吲哚 D 半乳糖苷 X gal 3 4 环已酮 D 半乳糖苷和8 羟基喹啉 D 半乳糖苷等 1993年Brenner等人用加4 甲基伞形酮 D 半乳糖苷 MUGal 和吲哚氧基 D 葡糖醛酸苷的培养基检测大肠菌群和大肠杆菌 3 取得满意结果 1995年该方法被美国国家环境保护署采纳 CodeofFederalRegulation40 141 21ProtectionOfEnvironment 美国SIGMA公司有商品化试剂 但价格昂贵 2000年James等独家报导了一种新的检测大肠菌群的酶底物 茜素 D 半乳糖苷 Aliz gal 该试剂具有比同类酶底物更灵敏的性能 在固体培养基中可使大肠菌群呈现带色菌落 色素为脂溶性不扩散 易与辨别 另还可以和不同的阳离子 Fe Al K NH4 形成带色的螯合物 这样就便于和其他的显色剂合用 组成具有多种性能的鉴别培养基 以提高检测的灵敏度 目前 国内外均无商品化试剂出售 6 三 应用4 甲基伞形酮 D 半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群 1 检测步骤样品0 1g 30 01g 30 001g 3MUGal肉汤37 24hr在紫外光下观察产荧光管数 查MPN表得MPN值大肠菌群 D 半乳糖苷酶4 甲基伞形酮 D 半乳糖苷4 甲基伞形酮 兰色荧光 7 2020 1 7 8 MUGal肉汤 胰蛋白胨20g氯化钠5g无水磷酸氢二钾2 75g无水磷酸二氢钾2 75g月桂基硫酸钠0 1gMUGal0 08g水1000ml加热使溶化 调Ph7 4 分装试管 每管10ml 116 高压灭菌10min 待培养基冷却后 以无菌手续在每管培养液内加入0 1mL经过滤除菌的500ug mL头孢磺啶稀释液 9 2 试验情况简介 当在MUGal肉汤中生长的大肠菌群数量较少时也可在紫外灯下呈现明显的蓝色荧光 反应较乳糖产酸显色快速灵敏 结果易读 以13株与肠杆菌科相关的标准菌株验证MUGal肉汤 其结果与在LST和乳糖胆盐肉汤中的乳糖发酵结果完全一致 符合相关菌株的特性 将自制MUGal与SIGMA产MUGal比较测试26份样品 两者阳性符合率为94 6 以自制MUGal肉汤与LST肉汤比较检测66份样品中大肠菌群 其24h阳性检出率是LST肉汤48h的1 5倍 但延长LST肉汤培养时间至96小时后 两者结果逐步接近 表明MUGal多检出的阳性部分多为受伤生长缓慢或迟缓发酵乳糖的大肠菌群类菌株所致 10 将MUGal肉汤阳性管中的可疑菌株进行触酶 氧化酶和硝酸盐还原试验 并任选其中18株用API20E鉴定 证明95 1 的MUGal肉汤阳性管中含有大肠菌群 综上所述 自制MUGal肉汤检测大肠菌群灵敏 快速 准确 无需验证 可一次完成 自制MUGal性质稳定 无游离荧光 可替代昂贵的进口产品使用 鉴于以MUGal检测大肠菌群的方法早在1995年即为美国国家环境保护署采纳 有关大肠菌群具有 半乳糖苷酶的特性 也在ISO9308 1 2000给予了明确的定义 因此 经过本次试验我们认为 以MUGal肉汤快速检测食品中大肠菌群作为一种推荐的标准方法加以应用是可行的 11 四 应用茜素 D 半乳糖苷快速检验食品中的大肠菌群 1 检测步骤样品0 1g 20 01g 20 001g 2Aliz gal琼脂37 24hr计数紫色和红色菌落 乘以稀释倍数报告大肠菌群 D 半乳糖苷酶茜素 D 半乳糖苷茜素 Fe NH4 Al K 紫色和红色 12 茜素 D 半乳糖苷琼脂 Alig gal琼脂 Aliz gal50mg蛋白胨20g无水磷酸氢二钾2 75g无水磷酸二氢钾2 75g氯化钠5g月桂基硫酸钠0 1g异丙基硫代半乳糖苷0 03g硫酸铝钾0 5g柠檬酸铁铵0 5g琼脂15g蒸馏水1000mL 调Ph7 4 13 2 试验情况简介 Aliz gal检测食品中大肠菌群可在18 24h内显示出半乳糖苷酶反应 在同类性质的酶底物中 Aliz gal的用量较低 做倾注培养时在琼脂深层菌落特征较明显 由于采用测定 半乳糖苷酶的方法易于检出迟缓发酵乳糖的大肠菌群和厌氧大肠杆菌