改-CD4 T淋巴细胞绝对计数检测.doc

CD4+T淋巴细胞绝对计数检测写在课前的话：CD4+T淋巴细胞是HIV感染的主要靶细胞，而其本身又是免疫反应的中心细胞，CD4+T淋巴细胞计数作为直接测定免疫功能的方法，是提供HIV感染病人免疫系统损害状况最明确的指标。本次课程使学员熟悉淋巴细胞的分类，掌握HIV感染后，CD4+T淋巴细胞计数的意义和基本方法。一、淋巴细胞的分类和作用（一）粒细胞分类在流式细胞仪上，根据细胞的大小和颗粒度将粒细胞分为三个亚群，淋巴细胞是CD45强阳性，颗粒度较低的一群绿色细胞。中性粒细胞为颗粒度比较大的一群蓝色细胞。单核细胞为颗粒度比较小的一群红色细胞。 （二）淋巴细胞分群根据其表面的分子标记，分为三群细胞。1、CD19阳性为B淋巴细胞，约占淋巴细胞总数的20%。2、CD3阴性、CD16和CD56双阳性的细胞，即NK细胞，大约占淋巴细胞总数10%。3、其余大约70%的细胞都是CD3阳性T淋巴细胞。CD3阳性T淋巴细胞又可以分为CD4阳性辅助性淋巴细胞（Th细胞）和CT8阳性细胞毒性T淋巴细胞（Ts细胞）。（三）淋巴细胞的作用1、淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。2、CD4阳性T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持是具有枢纽的作用。3、CD4阳性T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。CD4阳性T淋巴细胞具有维持细胞免疫和体液免疫平衡的枢纽作用，而艾滋病是一种免疫缺陷性疾病，那么在HIV感染后，CD4阳性T淋巴细胞会出现什么变化？对它的计数又有什么意义？二、CD4阳性T淋巴细胞在HIV感染后的作用（一）CD4阳性T淋巴细胞在HIV感染后减少的原因HIV病毒可通过多种直接和间接的病理机制导致CD4阳性T淋巴细胞数量的缺失，最终引起感染者免疫功能缺陷。 据推测有以下几个原因：HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病的作用。感染细胞和未感染细胞形成合胞体。感染细胞发生程序性细胞死亡（凋亡）。自身免疫机制特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用。（二）HIV感染后CD4阳性T淋巴细胞和CD8阳性T淋巴细胞的变化1、CD4阳性T淋巴细胞的绝对计数出现持续减少。2、CD8阳性T淋巴细胞增高，而疾病晚期则下降。3、T细胞亚群比例出现倒置，CD4/CD8500/ul（29%）A1B1C1200-499/ul（14-28%）A2B2C2200/ul（14%）A3B3C33、并发症与CD4阳性T淋巴细胞计数的关系依据CD4细胞数的水平能够判断HIV感染者发生临床合并性的可能性，并可针对进行预防。当CD4细胞计数在200500/l时，临床上可出现肺炎球菌或其它细菌性肺炎的感染，包括肺结核、带状疱疹、鹅口疮、隐孢子虫病、卡波济肉瘤、口腔毛壮白斑病、何奇金淋巴瘤、淋巴细胞间质肺炎等。CD4细胞计数在100200/l时，可出现卡氏肺孢子虫肺炎、组织孢浆菌病、球孢子菌病、粟粒性肺结核或肺外结核和多发性多灶性脑白质病。此时一些非感染性并发症也会出现，包括消瘦、周围神经紊乱、HIV相关性痴呆、心肌病、空泡性脊髓炎、进行性多发性神经根病、何奇金淋巴瘤等。CD4细胞计数在50100/l时，会出现弥漫性单纯疱疹、弓形体病、隐球菌病、慢性阴孢子虫病、微孢子虫病、念珠菌食道炎等。CD4细胞50/l时，会出现严重感染，包括弥漫性巨细胞病毒感染、鸟分枝杆菌综合征等。4、CD4细胞计数是确定治疗开展时机的一个重要依据。病程CD4+T淋巴细胞病毒载量建议症状期任何值任何值治疗无症状期CD4+T细胞200/mm3，但30000（bDNA）或55000(RT-PCR)建议治疗。另外还要根据CD4+T细胞下降率和患者的愿望无症状期CD4+T细胞350/mm330000（bDNA）或55000(RT-PCR)建议延迟治疗观察。未经治疗者3年发展至AIDS15% 虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断标准。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果：- 丙球蛋白缺乏症- 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症)- 严重的联合免疫缺陷（五）生理状况和疾病对CD4+T细胞计数的影响1、昼间变化：最低值是中午12：00左右，最高值是晚上20：30左右，并随着季节更替而变化。2、急性感染和免疫接种：CD4+细胞计数减少。3、药物：肾上腺皮质激素使CD4+细胞计数下降。4、性别、成人的年龄、妊娠、心理压力等对CD4+细胞计数影响很小。5、避免在并发感染治疗后或免疫接种后4周内检测。（六）计数结果1、对于CD4+T淋巴细胞计数结果，要至少连续两次CD4+T淋巴细胞检测均显著性变化，才能说明确实发生了变化。2、CD4+T细胞绝对数改变30%以上，或CD4+T细胞百分比改变超过3%才有意义。例如：CD4+T细胞数为500/l、CD4+细胞百分比为20%的病人，连续两次CD4+T细胞计数下降，绝对数减少至340/l ，百分比降低为16%，说明CD4+T细胞确实发生了显著性变化。选用何种方法来对CD4阳性T淋巴细胞进行计数？计数的基本原理又是什么？三、CD4+T细胞的测定（一）仪器选择1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞仪（FACSCalibur、Coulter)。2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪（FACSCount、Guava)。3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads）。4、除此之外，在不具备CD4细胞检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于1000/l时，强烈预示CD4细胞小于200 /l）。（二）流式细胞仪1、概念流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。2、流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/s统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞3、流式细胞术工作原理流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM，又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。4、流式细胞仪的结构包括三大系统：液流系统、光学系统、电子系统。液流系统如图，吸上来的细胞，被侧液包裹，使之位于喷嘴中，形成了单细胞的液流。通过时被不同波长激光激发，而发射出不同颜色的光，对光内信号进行吸收并处理。Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid 细胞被戴上特殊的标记，所用标记细胞的探针是能够与待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子可发射出不同波长的光。经过吸收后，被光处理系统再处理成各种数据，从而得到结果。（三）FACSCaliburTM 系统 选用BD专用试管进行检测。1、样本的采集和处理EDTA（1.50.15mg/ml血液）抗凝血。采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，防止凝固。 收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 2、样本的运送在室温下（1823）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。 不可检测溶血或结冰的样品。 不可检测凝血的样品。 如果样品的采集时间已超出48h，不可检测。 3、试剂的选择BD公司的CD3/4/8联合抗体和BD公司的TruCount管。BD公司CD3/4/8联合抗体BD公司TruCount管4、操作步骤将20l抗体和50l全血都加到TruCount管的底部，混匀后，避光静置15min，加入450l FACS溶血素后，再次避光15min，然后上机进行检测。5、应用软件MultiSETMultiSET为FACS系列流式细胞分析仪使用的全自动软件。外周血直接多色荧光分析。自动获取标本，分析数据。可获得关于外周血中淋巴细胞各类亚型细胞的信息。绝对计数，直接给出结果。检测外周血，计算淋巴细胞及待测亚型的相对含量和绝对含量。使用直接荧光标记抗体，一步完成三色或四色荧光标记。免洗试剂设计，操作简便，减少细胞丢失。质量控制保证。6、CD4绝对计数个结果报告实验室报告包括样本编号和样本的名称，检测结果包括CD3阳性的T淋巴细胞绝对计数、CD4阳性T淋巴细胞占CD3阳性T淋巴细胞的百分比、CD4阳性细胞T淋巴细胞绝对计数、CD8阳性细胞占CD3阳性淋巴细胞数的百T淋巴分比和CD8阳性T淋巴细胞的绝对值等。 检测结果样本编号名称散点图临床报告临床报告包括两个方面内容，一是中间的检测结果，另一个为正常参考值范围，这个临床医生进行参考。 正常参考值测定结果 7、使用MultiSET软件的注意事项使用精密加样器，准确加取50ml标本，建议使用反向加样法。TruCount管批号不同，beads含量不同，更换批号时注意更改MultiSET中的 Lot Id和beads count。不同批号的TruCount不能混用。 TruCount管应在225C密封干燥保存，取出后应在1h内使用。 配套使用FACS溶血液。 应使用新鲜标本进行试验。（四）BDB FACSCountTM 系统 如不具备购买这个流式细胞仪的条件，可以购买FACSCount系统来代替。 1、仪器结构内置微处理器实现数据自动分析，自动打印质控与病人的检测结果，简单易用的系统控制面板，配套的样本制备工作台，简捷的样本制备方法，避免细胞损失。2、仪器特点样本稳定性：样本在制备后，可以在室温储存48h。全血稳定性：采集后室温(20250C )储存48h。检测范围CD4+：502000个细胞/mlCD8+：1002000个细胞/mlCD3+：1003500个细胞/ml（五）CD4阳性T淋巴细胞检测的质量控制1、质量控制：是指在每一次实验过程中，为了确保实验工作的正常进行，而必须采取的各种措施。2、质量控制包括室内质量控制和外部质量控制。室内质量控制要求工作人员做好仪器方面和操作过程的质控。外部质控主要是要求CD4阳性T淋巴细胞检测实验室参加这个检验能力的验证。质量保证行政支持、实验室管理、环境条件质量控制培训外部质控室内质控过程质控仪器质控数据质控样本质控试剂质控3、具体实验室质量控制的要求n 实验前质量控制采集标本前病人的准备；正确的标本采集方法；准确及时的运送标本；实验前正确地处理和保存标本。n 实验中质量控制质控品的准备；试剂的评价选择； 仪器的校准；开展Levey-Jennings 质控图质控（或“即刻法”质控）。n 实验后质量控制实验后准确填写检验结果；及时发出报告；正确地解释检验结果的临床意义； 文件管理。 4、国内CD4T淋巴细胞检测实验室参加能力验证流程图 中国CDC艾滋病参比实验室复核样品，填写样品接收单，在要求