聚合酶链反应张幻灯片PPT课件.ppt

1 一 概述 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 又称无细胞克隆技术 是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法 数小时达107 108倍1985年 Centus公司KaryMullis发明1993年因此获诺贝尔化学奖 2 PCR扩增仪 3 引物复性 4 延伸 再变性 5 再复性 再延伸 6 短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在P1 P2之间 7 PCR循环的主要参数 1 预变性 92 C 95 C 2 5min2 变性 92 C 95 C 30s 1min3 复性 40 C 60 C 20s 2min4 延伸 70 C 75 C 30s 3min5 总延伸 72 C 7min 8 三 PCR的基本反应步骤 变性95 C 延伸72 C 退火Tm 5 C 9 PCR扩增条件 94 5min94 1min3055 1min72 1min72 7min 10 11 DNAMarker NGF 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 12 13 14 15 三 PCR反应体系 缓冲液提供所需的pH环境DNA模板 欲扩增的DNA样品dNTP 四种脱氧核苷酸MgCl2 提供Mg 离子引物 根据欲扩增的DNA样品设计耐热的DNA聚合酶 来源于喜热的细菌 16 耐热的DNA聚合酶 17 1 PCRbuffer 72 C时 反应体系的pH值下降1个单位 接近于7 2MgCl2 浓度1 2mmol L 过量引起非特异扩增 不足使酶活性显著降低 导致产物量少 2 三磷酸脱氧核苷酸 dNTP 是合成的原料 四种的浓度应相等 浓度一般为50 200 mol L 18 3 引物 0 1 1umol L高浓度 引物二聚体 非特异产物低浓度 产率低4 Taq酶 来自于水生栖热菌 Thermusaquaticus 最适反应温度为70 75oC 常用浓度为1 2 5U 100ul 浓度过高缺乏专一性 过低则产物产量低 19 5 DNA样品按照常用的分子生物学方法制备的DAN或RNA样品 其纯度应能达到实验要求 质量100 500ng不含有蛋白酶 核酸酶 DNA结合酶 Taq酶抑制剂6 石蜡油减少反应液的蒸发 21 四 影响PCR的主要因素 1 温度参数 模板变性温度 低温不产生单链DNA模板 PCR不启动 超过95 C 影响Taq酶活性退火温度温度高 特异性强 引物与模板结合不牢 DNA扩增效率下降温度低 产量高 特异性差Ta Tm 5 4 G C 2 A T 5 22 引物延伸温度 取决于Taq酶最适温度70 75 C大于1Kb的DNA片段 1min以上 并加入明胶或BSA15 20 甘油有助于2 5KbDNA片段扩增 23 PCR扩增平台期 循环到一定次数后 扩增产物不再以指数关系增加 而是以线性关系增加或不增加 称为平台期 提前进入平台期的原因1 引物量不足2 dNTP量不足3 Taq酶失活4 原始模板数量太多 24 循环次数 25 35次次数太多 核苷酸错配 非特异扩增多进入平台期 增加次数效果不大次数太少 产率低 25 2 引物设计 引物与待扩增的DNA序列互补的寡核苷酸片段 5 引物又称上游引物 其核苷酸序列与模板5 序列相同 3 引物又称下游引物 其核苷酸序列与模板3 序列互补 26 引物长度 人类基因组有30亿bp 按照统计学的计算 随机组合的17个碱基的核苷酸序列 在人类基因组中可能出现一次 引物长度一般为20 24个碱基 有时也见50甚至更多的碱基 27 引物组成 碱基随机分布 避免聚嘌呤或聚嘧啶的存在 G C含量一般在40 60 引物内部避免形成次级结构如发卡结构两个引物之间不应互补 避免形成引物二聚体 28 两条引物应避免有同源序列 以免两条引物竞争模板的同一位点 引物5 端 可加上酶切位点或荧光素等引物3 端 5 6个碱基与靶DNA严格配对 29 3 TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATACGGTAAG 5 引物5 GTGAATTCTCTCAACCGTAT3 注 红色部分为限制性内切酶切割位点 碱基与模版链不完全互补 30 逆转录PCR ReverseTranscriptionPCR RT PCR 原理 提取组织细胞总RNA 以其中的mRNA为模板 采用需要的引物 在逆转录酶的作用下反转录成cDNA 再以cDNA作为模板 通过特异性引物 PCR扩增目的基因 应用 分析基因的转录产物 获取目的基因 合成cDNA探针 31 选取适当的组织 提取总RNA 以mRNA做模版 加入引物 逆转录酶 dNTP 合成cDNA的第一链 逆转录酶水解mRNA链 合成cDNA的第二链 加入引物 Taq酶 做常规PCR 扩增出大量的cDNA分子 32 RT PCR操作需注意的问题 1 模版RNA应严格纯化 2 避免RNA酶污染 3 所用与实验有关的物品 需用0 1 的焦炭酸二乙酯 DEPC 浸泡处理 33 增效PCR boosterPCR 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题 一是形成引物二聚体 一是非特异扩增 而特异扩增片段产量降低 对于这种情况 可设置二步PCR 先用较低浓度的引物进行初级PCR 此时由于引物少 形成引物二聚体的可能减少 但它并不影响靶序列的扩增 只是由于引物少产物亦少 约经15 20个循环后补充引物量 以初级PCR产物为模板进行扩增 靶序列的产量将相应增加 34 2 巢式PCR nestPCR 此时也是进行二步PCR 与上面不同的是 第二级PCR需另行设置反应体系 并应用另外的PCR引物 此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧 用初级PCR产物做模板 进行第二步PCR 这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增 除了达到增效PCR同样的目的外 还提高了最终产物的特异性 35 巢式PCR 采用两对引物进行PCR 其中第二对引物位于第一对引物内 P1上 P1下 P2上 P2下 P1上 P2上 36 Firstroundprimers FirstroundPCR Secondroundprimers SecondroundPCR Geneofinterest 37 在同一PCR体系中加入数对PCR引物 如果这些引物的退火温度相近 并且所覆盖的区域不重叠 这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失 或在检测缺失设置内对照 3 多重PCR 38 定量PCR测定靶基因的原始拷贝数目