高效液相色谱仪及固定相、流动相.ppt

仪器分析课程讲义 第四节高效液相色谱仪 目录 高效液相色谱仪高效液相色谱的固定相和流动相 输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统 6 2高效液相色谱仪 一 输液系统 1 贮液器贮液罐的材料应耐腐蚀 对溶剂呈惰性 容积约为0 5 2 0L 贮液罐放置要高于泵体 使用过程贮液罐应密闭 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0 45um滤膜过滤 2 脱气装置 作用 脱去流动相中的溶解气体 1 吹氮脱气法 2 加热回流法 3 抽真空脱气法 4 超声波脱气法 5 在线真空脱气法 on 1inedegasser 3 高压输液泵输送流动相压力 150 350 105Pa作用 将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性 高压泵按其性质可分为恒压泵 恒流泵两类 1 往复式柱塞泵 恒流泵 易于更换溶剂 适用于梯度洗脱但有脉冲波动 可以加一阻尼器抑制脉冲 2 气动放大泵 恒压泵液缸体积大 更换流动相不方便 不便于梯度洗脱 无脉冲 稳定流量的输出 现多用于装柱 高压定量进样阀 六通阀进样装置 优点 进样准确 重现性好 适于定量分析c 自动进样器 计算机控制 适合大量进样 二 进样装置停留进样装置 缺点 不能承受高压 须停流进样 无法取得精确的保留时间 三 高效分离柱色谱柱是实现分离的核心部件 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 常规液相色谱柱1 6mm 10 50cm 微孔填充柱0 5 1mm毛细管柱30 50 m装柱方法 有干法和湿法 按粒度20 m划分 柱温控制 下列几种情况需要控制柱温 法定标准分析方法中 要求保留时间具有再现性 必须通过改变柱温来提高分离效率 对高分子化合物或黏度大的样品 对一些具有生物活性的生物分子 对一些组成复杂的样品 使用二维色谱技术 四 液相色谱检测器1 紫外检测器 应用最广 对大部分有机化合物有响应 作用原理 被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收 组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律 特点 灵敏度高 可达10 9g mL 1 线性范围高 可用梯度洗脱 对流动相的流速和温度变化不敏感 不适用于对紫外不吸收的试样 紫外光不透过的溶剂不能用 苯等 2 光电二极管阵列检测器 紫外可见光度检测器的重要进展 1021个二极管阵列 各检测某一特定波长 无需停流扫描而观察色谱柱流出物的各个瞬间的动态光谱吸收图 光电二极管阵列检测器 3 差示折光检测器 differentialrefractiveindexdetector 除紫外检测器之外应用最多的检测器 可连续检测参比池和样品池中溶液的折光指数差值 差值与浓度呈正比 特点 通用型检测器 灵敏度低 10 7g mL 1 不能用于痕量分析 对温度敏感 要求使用温度恒定 对流动相流量变化敏感 不能用于梯度洗脱 许多有机化合物 特别是芳香族化合物 受紫外光激发后能够辐射出荧光 4 荧光检测器 fluorescencedetector 高灵敏度 比紫外检测器高两个数量级 达10 11g ml 1 高选择性 线性范围窄 测量中不能使用抑制 吸收荧光的溶剂 对不产生荧光的物质 可使其转变成荧光物质 广泛应用于生物化工 制药 食品和环境监测中 5 电导检测器 electricalconductivitydetector 属电化学检测器 是离子色谱法中应用最为广泛的检测器作用原理 根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质的含量 五 液相色谱法固定相 固定相的形状 1 全多孔型最初由氧化硅 氧化铝 硅藻土等制成的多孔球体100 m的大颗粒 表面涂渍固定液 传质速度慢 柱效低 现采用10 m以下的小颗粒 2 表面多孔型 薄壳型微珠 30 40 m的玻璃微球 表面附着一层厚度为1 2 m的多孔硅胶 表面积小 传质速度快 但柱容量低 2 液 固吸附固定相极性 硅胶 氧化镁 分子筛等 非极型 高聚物微球 石墨化碳黑 聚合物包裹固定相 结构类型 全多孔型和薄壳型 粒度 5 10 m 3 液 液色谱固定相 惰性载体 硅胶 无机氧化物 高分子聚合物 脲醛树脂等 多为3 10um的全多孔微球 固定液 正相 氰基柱 胺基柱等反相 烷基柱 苯基柱 4 化学键合固定相 化学键合固定相 目前应用最广 性能最佳的固定相 一般用硅胶作为基体 a 硅氧碳键型 Si O Cb 硅氧硅碳键型 Si O Si Cc 硅碳键型 Si Cd 硅氮键型 Si N 化学键合固定相的特点 1 传质快 表面无深凹陷 2 寿命长 无固定液流失 耐流动相冲击 3 选择性好 可键合不同官能团 4 有利于梯度洗脱 六 液相色谱法流动相 流动相特性 1 流动相的种类 配比可显著改变组分分离状况 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相 称为正相液液色谱法 3 流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液液色谱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 2 流动相类别按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 固定组成淋洗和梯度淋洗 常用溶剂的极性顺序 水 酰胺 腈 醇 酮 酯 醚 烃类 etc 流动相可分为 底剂及洗脱剂底剂 决定基本的色谱分离情况 洗脱剂 调节试样组分的滞留并对几个组分具有选择性的分离作用 3 流动相的选择 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 正相液 液分配分离 液固色谱极性固定相 底剂 低极性的溶剂 如正己烷 苯 氯仿等 洗脱剂 根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚 酮 醇等 反相色谱 液固色谱非极性固定相 底剂 水 洗脱剂 有机溶剂作为极性调节剂 4梯度洗脱 梯度洗脱 与气相色谱中的程序升温一样 可极大地改善分离效果在分离过程中按照一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性 通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素 通过梯度洗脱 可缩短分离时间 提高分辨能力 改善峰形 还可提高分析精度 溶剂的组成在15min内 从10 V V CH3CN H2O随时间改变至50 CH3CN H2O 梯度淋洗装置外梯度 两台高压泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 讨论1 用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品 以某一比例甲醇 水为流动相时 样品容量因子较小 若想使容量因子增加 较好的办法是A增加流动相中甲醇的比例B增加流动相中水的比例C流动相中加入少量HAcD流动相中加入少量的氨水 讨论2 在反相色谱法中 若以甲醇 水为流动相 增加甲醇的比例时 组分的容量因子k与保留时间tR如何变化 作业 1 在ODS柱上 以甲醇为流动相 某组分的分配容量k 1 2 如以乙腈为流动相 其k值是增加还是减少 为什么 2 在硅胶柱上 用甲苯为流动相 某组分的保留时间是30min 如果改用四氯化碳或乙醚为流动相 试分析该组分的保留时间如何变化 3 在液相色谱法中 梯度淋洗适用于分离何种试样 人干扰素 等电点8 5底剂 50mmol L磷酸盐缓冲液 pH8 0洗脱剂 50mmol L磷酸盐缓冲液 pH8 5 1mol LNaCl 2 离子交换色谱流动相组分保留值可通过流动相中盐浓度及pH来调节 七 高效液相色谱的应用1 环境中有机氯农药残留量分析 固定相 薄壳型硅胶 37 50 m 流动相 正己烷流速 1 5mL min色谱柱 50