副猪嗜血杆菌及致病因子的研究进展.doc

副猪嗜血杆菌及致病因子的研究进展摘要:副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在条件性致病菌，该菌引起的副猪嗜血杆菌病以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎主要特征。对该菌的毒力因子进行了概述， 以期为副猪嗜血杆菌病的早期诊断和及时防治提供一定的指导。关键词:副猪嗜血杆菌 致病菌 毒力因子副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病(Glassers disease)。副猪嗜血杆菌病又称纤维素性浆膜炎和关节炎， 是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)1引起,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，在一定条件下，可引起猪只发生以呼吸道症状为主的全身性疾病2，死亡率较高。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道一种常在菌， 属于条件性和继发性病原菌，在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，呈世界性分布。其十分娇嫩，对培养基的要求很高，分离培养往往不能成功，而且副猪嗜血杆菌对外界抵抗力不强，干燥环境易死亡。HPS属于巴氏杆菌科， 嗜血杆菌属， 是一种革兰氏阴性菌， 为形态多变、兼性厌氧、非溶血性、依赖V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）性、无芽孢的短小杆菌， 最适宜生长的温度为3537，pH为7.67.83，临床上以58周龄的保育猪最易发病。多年来国内外一些研究人员对该菌做了大量的研究工作， 但对于该菌的研究还很浅，尤其是其致病机理、毒力因子等方面的认识还很少。1 形态学、血清学及流行病学1.1 痛原形态学及培养特性 副猪嗜血杆菌是1922年首次由Schermer等分离到的一种细小杆菌，在显微镜下呈多形态，非溶血性，不运动，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖型，革兰氏阴性，大小为15um(O3O4)um。新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链状，在陈旧培养物中多呈多形态，有长杆状和丝状。Hps属于需氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为3537，pH 7.67.8，C02 35。在适宜培养基上生长的菌落呈圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小，无芽孢，无鞭毛。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，不需要X因子。在巧克力培养基上生长较差，在加NAD、马血清的M96支原体培养基或加酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。如与金黄色葡萄球菌同时培养，Hps在该菌两侧生长良好，菌落直径可达12 mm，形成卫星现象。蔡旭旺等4,5对该菌做了生化鉴定，结果为尿酶试验阴性、氧化酶阴性、接触酶试验阳性，可发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麦芽糖等。1.2 血清学 传统的血清学分型方法是根据热稳定性可溶性抗原和琼脂扩散试验,已有15种血清型得到证实6,7，同时20以上的分离株不能分型8。目前，细菌的血清型已普遍作为其毒力的标志，不同血清型的Hps，毒力和致病力存在差异。研究报道SPF猪腹腔接种血清1、5、10、12、13、14型Hps后，在4 d内发病或死亡，这些菌株归类为高毒力菌株；接种血清2、4、15型Hps后，引起多发性浆膜炎但不致死，这些菌株归类为中等毒力菌株；接种血清3、6、7、8、11型Hps后，感染症状较缓慢或无临床表现，这些菌株归类为无毒力菌株9。由于琼脂扩散试验的局限性，已有建议将其它技术如间接血凝试验(IHA)和协同凝集试验(CA)作为血清学分型的候选方法。协同凝集表现出多种交叉反应，而间接血凝试验提高了特异性反应，除了少数例外。90以上的菌株可以通过间接血凝试验确定血清型，而琼脂扩散试验只能确定63的菌株血清型。目前，PCR-RFLP方法建立并应用于副猪嗜血杆菌流行病学分型，通过PCRRFLP对tbpA(编码转铁结合蛋白的基因)进行分析，从而对副猪嗜血杆菌菌株进行分型。101株副猪嗜血杆菌分离株有33种RFLP图谱，其中10株与标准株获得一致的图谱10。通过免疫扩散试验分型的66株分离株分为25种RFLP群，表明同一血清型副猪嗜血杆菌具有遗传多样性；而27株不能分型的分离株形成14种不同的RFLP群。以上结果表明，血清型和RFLP型没有直接的相关性，PCRRFLP分析结果显示5型流行最广泛(占所研究的20.8)，其中包含血清4、5、13、15型和不能分型的分离株。1.3 流行病学 Hps是猪上呼吸道的正常定居菌，可以从1日龄健康猪的鼻腔、支气管分泌物，尤其是大支气管的分泌物中分离到本菌11，也可以从患病猪肺中分离到本菌，但健康猪肺部分离不到。它可在特定条件下侵入机体从而引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。副猪嗜血杆菌侵入全身的有关机制还不清楚。Hps只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于58周龄，感染高峰通常见于保育期的46周，有些可早在保育舍内最初2周时就开始出现，并一直持续到肥育期早期，发病率可达40，严重时死亡率可达5012。传统观认为格拉泽氏病是零星发生的，且与青年猪的应激有关。但目前此病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势，呈现流行性。2、致病因子的研究 人们推测，Hps毒力和致病性与细菌毒素有关，但至今这方面的报道很少。副猪嗜血杆菌属巴氏杆菌科，而巴氏杆菌科成员具有一些非常重要的毒力因子如荚膜、菌毛、脂多糖(1ipopolysaccharides，LPS)、外膜蛋白(outermembrane protein，OMP)等。但是，副猪嗜血杆菌是否只产生这些毒力因子，以及它们与本菌的毒力是否有关，目前还知之甚少。2.1 荚膜 据Little13和Morozumi等(1986)报道，分离自健康猪上呼吸道的大多数Hps都有荚膜，而从其他部位分离的菌株多数无荚膜。但是，通过活体内传代的方法可筛选出荚膜化的Hps克隆，而在培养基上经多次传代后有荚膜细菌的数量减少。荚膜与其毒力之间的直接关系还有待进一步研究。2.2 外膜蛋白 Ruiz等研究结果表明14，外膜蛋白与Hps的毒力有关，健康仔猪与患病猪分离的Hps OMP不同，有多发性浆膜炎和关节炎症状的猪分离的OMP基本相同。OMP蛋白共有8种，大小分别约为92、88、53、60、46、37、31、15 ku。Hps强毒株都具有一类分子质量在37 ku左右的蛋白质。Zucker等研究了副猪嗜血杆菌合成的脂多糖，结果发现有毒力菌株和无毒力菌株的脂多糖成分很相似15。据报道，不同血清型的菌株抗原性不同，毒力和免疫保护作用呈正相关。免疫动物的抗体主要针对OMP而不是脂多糖和荚膜多糖，证明OMP有更强的免疫原性，但OMP是否是主要的免疫原尚需进一步研究。2.3 菌毛 菌毛是上呼吸道黏附因子，黏附后发生侵袭，进人体内，但侵袭机制不明。副猪嗜血杆菌在猪体内传代后形成纤毛样的结构，且可从没有任何临床症状的猪鼻腔内分离到Hps。Vahle等研究结果表明16，从鼻腔中分离的副猪嗜血杆菌与急性化脓性鼻炎、鼻腔和气管黏膜的急性细胞肿胀及纤毛丢失有关，并推断黏膜的这些变化可能使副猪嗜血杆菌侵入机体并进入血流，且透射电子显微镜和免疫组织化学的结果均显示纤毛丢失和细胞变性的部位有副猪嗜血杆菌17。据研究者推测，副猪嗜血杆菌的一种可溶性毒素可能与所观察到的细胞病变有关。2.4 脂多糖 脂多糖(LPS)可能是副猪嗜血杆菌的一个重要的毒力因子。但是，Zucker等(1996)并未发现副猪嗜血杆菌强毒株的LPS与无毒株的LPS有明显的差异。同样，Miniats等研究结果发现18，用含有LPS和OMP抗原的菌苗免疫动物，有OMP抗体的猪才能抵抗强毒菌的攻击。这些事实表明，LPS不是副嗜血杆菌的主要毒力因子。之后，Amano等19进一步研究了LPS的致病作用，用血清5型菌株接种动物后发现，血液中LPS抗体的出现与血栓形成和弥漫性血管内凝血有关。现已清楚，副猪嗜血杆菌的LPS具有与其他革兰氏阴性细菌内毒素相似的活性。2.5 转铁蛋白 铁是细菌生长不可缺少的元素，但是由于宿主糖蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白的络合作用，细菌外环境的铁含量很少。Charlnad等的研究结果证明20，猪血清中转铁蛋白受体的存在，并分析了两种转铁结合蛋白(tbp)的多肽结构分别是tbpA：94 ku；tbpB：94、60 ku。Hps含铁细胞利用tbp提供细菌生长必需的铁离子，认为tbp在Hps感染宿主动物引起发病过程中起决定性作用。2.6 神经氨酸酶 神经氨酸酶是巴氏杆菌科成员的一个潜在毒力因子， 与透过酶和醛缩酶功能一致， 可通过清除宿主细胞的碳水化合物，从而发挥细菌毒力。而且神经氨酸酶还介导清除与宿主细胞糖原结合的唾液酸， 从而暴露出细菌定居或侵入宿主细胞所需的受体， 并通过降低粘蛋白的粘性来干扰宿主的防御系统21。Carol 等22从HPS 的细胞膜上抽提并纯化了神经氨酸酶， 与哺乳动物的大多膜结合神经氨酸酶相反，该酶抽提后很稳定， 进一步推动了HPS致病因子的研究。参考文献1 袁森泉.副猪嗜血杆菌感染的诊断与防制策略.国外畜牧学猪与禽，2003(2):5961.2 李井怀,王威,李志发,等.仔猪副猪嗜血杆菌病的诊治.吉林畜牧兽医,2009,30(7):24.3 郭时金,周春凤,霍芳. 副猪嗜血杆菌病的临床诊断与防治. 猪场兽医,2010,249(1):6061.4蔡旭旺，Simone Oliveira，Carlos Pijoan副猪嗜血杆菌：诊断、流行病学和防制的新趋势J国外畜牧学-猪与禽，2004，24(6)：49565蔡旭旺，陈焕春副猪嗜血杆菌病的危害及其防治策略J养殖与饲料，2004(6)：34376Kielstein P,Rapp-Gabrielson V.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heatstable antigen extractsJ.J Clin.7Morozumi T，Nicolet JSome antigenic properties of Haemophilus parasuis and a proposal for serological classificationJ Clin Microbiol.1986，23：102210258 张海花,童富淡,朱家新.副猪嗜血杆菌分型方法的研究进展. 中国兽医学报,2006,26(4):454-456.9母安雄，应小飞，陶益，等副猪嗜血杆菌的研究进展J中国畜牧兽医，2005，32(11)t485010Redondo V A P.Mendez J N.Blanco N G Typing of Haemophilus parasuis strains by PCR-RFLP analysis of the tbpA gene 200311 Simone Oliveira，Lucina Galina，Isabel Blanco，et al. .Naturally - farrowed，artificially reared pigs as an alternative model for experimental infection by Haemophilus parasuisJ.The Canadian Journal of Veterinary Research，2003;67:146-150.12 斯特劳, 阿莱尔, 蒙加林, 等. 猪病学（第8 版）M.赵德明, 张仲秋, 沈建忠译. 北京: 中国农业大学出版社, 1998, 407-416.13Little T W AHaemophilus infection in pigsVet Rec，1970，87：39940214 Ruiz A ,Oliverira S , Torremoerll M ,et al. Outer membrane protein and DNA profiles in strains of Haemophilus parasuis recovered from systemic and respiratory sites.J Clin Microl,2001,39:17571762.15Zucker B A，Baghian A，Tarux R，et a1Detection of strain-specific antigenic epitopes on the lipo-oligosaccharide of Haemophlius parasuis by use of monoclonal and polyclonal antibodiesAm J Vet Res，199657：636716Vahle J L，Haynes J S，Andrews J JInteraction of Haemophilus parasuis with nasal and tracheal mucosa of following intranasal inoculation of cesarean derired colostrum deprived(CDCD) swineCan J Vet Res，1997，6l：20020617 季芳,宋长绪,杨增岐.副猪嗜血杆菌病的研究进展.广东畜牧兽医科技,2004,29(1): 1922.18Mini