热毒宁注射液对IL-1、IL-6、ET-1、PGE2炎性介质的影响.doc

热毒宁注射液对IL-1、IL-6、ET-1、PGE2炎性介质的影响* 王开富1#，萧伟2、3 王振中2、3，徐丽君1，毕宇安2、3，, 孙兰2、3，邹欣1，龚菂1，黄光英,11华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉，4300302江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港， 222001 3中药制药过程新技术国家重点实验室, 江苏 连云港， 222001摘要：目的：探讨热毒宁注射液抗炎、清热解毒的作用及其机制，方法：分别以二甲苯致小鼠耳肿、角叉菜胶致大鼠足趾肿胀、冰醋酸致小鼠毛细血管通透性增加等炎症模型；以内毒素感染家兔致内毒素性发热模型，观测小鼠耳肿胀及大鼠足趾关节肿胀度，检测IL-1、IL-6、内皮素（ET-1）、前列腺素E2 (PGE2) 等炎症介质，结果：热毒宁注射液10.15g/kg、5.08g/kg剂量组对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀均有抑制作用，1小时开始显效，持续至4小时；2.54g/kg剂量组在2小时方显效，抑制作用可持续至4小时；10.15g/kg剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，并能降低小鼠毛细血管通透性；注射内毒素2h，模型组家兔肛温值居高不下，但热毒宁2.54 g/kg、5.08g/kg两剂量组具有明显清热、降体温的作用，对家兔血清IL-1、IL-6、ET-1、PGE2；大鼠血清IL-1、IL-6等炎症介质均有不同程度的抑制作用。结论：热毒宁注射液对内毒素引起的家兔发热具有解热降温作用；对角叉菜胶致大鼠炎症有明显抑制作用、能显著降低大鼠IL-1、IL-6水平；并能抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，提示热毒宁注射液具有较强的抗炎解热作用，其机理可能与抑制IL-1、ET-1、IL-6、PGE2等炎症介质有关。 关键词：热毒宁注射液；解热；抗炎；炎性介质# 王开富，男，医学硕士，副研究员，E-mail: 共同通讯作者一：萧伟，男，研究员，高级工程师，E-mail： 共同通讯作者二：黄光英，女，教授、主任医师， E-mail: ；* 国家973项目，项目编号：2010CB735604The influence of Reduning injection on the inflammatory mediums of IL-1, IL-6, ET-1 and PGE2 * Wang KaiFu 1 #, XiaoWei 2, 3, WangZhenZhong 2, 3, XuLiJun 1, BiYuAn 2, 3, SunLan 2, 3, zou xin 1, Gong di 1, Huang GuangYing 1 1Tongji medical college affiliated tongji hospital, huazhong university of science and technology, wuhan, 430030 2 Jiangsu kang Yuan pharmaceutical co., LTD., lianyungang jiangsu, 222001 3National key laboratory for advanced technology in pharmaceutical process of Traditional Chinese medicine, lianyungang, jiangsu, 222001 Abstract: objective: to study the effect of Reduning injection in anti-inflammation and clearing heat and detoxicating and its mechanism. methods: Inflammation models were established by xylene-induced mouse ear swelling, carrageenin-induced rat toe swelling and glacial acetic acid-induced increase of blood capillary permeability in mice, respectively. Endotoxin heating model was induced by infecting the rabbit with toxin. The swelling degree of mice ear and rat digits joint was observed. The inflammatory mediums of IL-1, IL-6, endothelin (ET-1), prostaglandin E2 (PGE2) were detected. Results: Reduning injection with doses of both 10.15 g/kg and 5.08 g/kg inhibited the rat toe swelling caused by carrageenin, with the effect appearing 1 hour and continuing up to 4 hours after receiving the injection. The inhibitory effect of Reduning injection with a dose of 2.54 g/kg dose appeared powerfully in 2 hours and sustained to 4 hours. Reduning injection with a dose of 10.15g/kg had an obvious inhibitory effect on mouse ear swelling induced by xylene, and could reduce capillary permeability of mice. The anal temperature of the rabbit was continuingly high after receiving injection of endotoxin for two hours. Reduning injection with doses of both 5.08 g/kg and 2.54 g/kg could relieve heat, lower body temperature obviously and inhibit rabbit serum inflammatory mediators of IL-1, IL-6, endothelin (ET-1), prostaglandin E2 (PGE2) with different degrees. Conclusion: Reduning injection has antipyretic and hypothermia effect on fever of rabbit caused by endotoxin, inhibited rat inflammation induced by carrageenin obviously, reduced the levels of IL-1 and IL-6 in rat significantly and inhibited mouse auricular swelling induced by xylene. The results indicated that Reduning injection has strong anti-inflammatory and antipyretic effect, its mechanism might correlated with the inhibition of inflammation medium such as IL-1, ET-1, IL-6 and PGE2. Key words: Reduning injection; Antipyretic effect; Anti-inflammation; Inflammatory medium 热毒宁注射液是由青蒿、金银花、栀子等中药合理配伍而成的纯中药注射液，临床观察表明热毒宁注射液治疗上呼吸道感染总有效率达到98.08%【1】，并未见明显毒副作用和不良反应，为了对热毒宁注射液抗炎、解热作用及其机制进行全面的评价，进一步推广临床应用，本实验对其进行了系统研究。 一材料与方法1实验动物日本大耳白兔，60只，雌雄各半，体重1.8-2.5kg，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（SCXK(鄂)2008-0006）；Wistar大鼠，60只，雌雄各半，体重150-160g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（SCXK(鄂)2008-0005）；昆明小鼠，雌雄各半，100只，体重25-30g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（SCXK(鄂)2004-0007）；2. 药物与试剂 热毒宁注射液，由江苏康缘药业公司提供 (批号：20100728)；双黄连粉针剂，由哈药集团中药二厂提供（批号：1004202）；赖氨酸阿斯匹林（也称来比林）粉针剂，由蚌埠丰原涂山制药有限公司提供（批号：091117）；无热源水（细菌内毒素检测用水）购置湛江安度斯生物有限公司（批号：0512310）；无菌生理盐水，购置武汉双鹤药业公司（批号：100825911）；无菌注射用水，购置天津药业集团新郑股份有限公司（批号：100326）；细菌内毒素工作标准品（冻干粉剂）购置中国药品生物制品检定所（批号：150601）； IL-1、IL-6、ET-1试剂盒由北方生物所提供；PGE2由北京华英生物技术研究所检测。3. 统计学方法 采用sas软件进行成组设计资料的t检验4. 实验方法与步骤4.1热毒宁清热解毒的功效及机理研究4.1.1试剂及药物配制：大肠杆菌内毒素（家兔发热模型用药品），冻干品160Eu/每支,用无菌注射用水溶解并稀释至5.3ml则为30.1Eu/ml放置混悬器上振荡15分钟，家兔造模用剂量15Eu/Kg；热毒宁注射液稀释：将盛装药液的玻璃瓶放置180烤箱中干烤2小时冷却后备用，在无菌环境下，按上述低、中、高三个剂量将热毒宁注射液分装于干烤后的玻璃瓶中备用；双黄连注射液配制：将冻干粉针剂（600mg/支）的双黄连用无热源注射用水溶解并稀释至6.85ml则为87.6mg/ml，家兔按2ml/Kg注射。4.1.2实验步骤与方法健康合格家兔60只，适应性饲养三天后动物分组：将动物随机分为6组：正常对照组、模型组、双黄连治疗组、热毒宁注射液（5.08g/kg 、2.54 g/kg、1.27g/kg ）三个剂量治疗组，每组10只。热毒宁注射液、双黄连注射液治疗组均按设计剂量于兔耳静脉注射给药，正常对照组、模型组均用生理盐水注射，连续三天。用细菌内毒素制作家兔发热模型，于药物治疗的第三天，按15Eu/Kg于家兔耳静脉注射细菌内毒素，制作模型【2】，且同时给药治疗（即第三天给药治疗）。在注射内毒素前测量家兔基础肛温值，于注射内毒素后1h、2h、4h三次测量家兔肛温值；以温差值计算并比较用药前后肛温值的变化；于注射内毒素后4h处死家兔分离血清及血浆分别检测IL-1、IL-6、PGE2、ET-1等指标； 注：肛温差值（即肛温值）=1h、2h、4h肛温值-基础肛温值4.2热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠炎症的抑制作用及其机理研究4.2.1试剂及药物配制来比林注射液的配制：将冻干粉针剂（0.9g/支）的来比林用4.46ml无热源注射用水溶解，再按1:2稀释,用于大鼠尾静脉注射； 配制1%角叉菜胶混悬液：称取角叉菜胶1g，混悬于100ml生理盐水中，置于冰箱中放置24h，备用。4.2.2实验步骤与方法 健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，适应性饲养3天。随机分成6组，即模型组、正常对照组，来比林组（262.5mg/Kg），热毒宁注射液（10.15g/kg、5.08g/kg和2.54g/kg）三个剂量组。每日静脉给药一次，注射速度为0.2ml/min，连续3天，模型组、正常对照组给予等体积的生理盐水。末次给药15分钟，在大鼠足跖皮下注射1%角叉菜胶混悬液0.10ml致炎【2】，用毛细管放大测量装置测量致炎前后大白鼠足跖关节以下的容积，计算并比较致炎后1h、2h、3h、4h各组的平均肿胀度和抑制率（注：抑制率30%，并经统计学处理有显著差异者，可认为该剂量具有抗炎苗头）；4h腹主动脉取血，检测IL-1、IL-6。肿胀度=致炎后足趾关节以下的容积-致炎前足趾关节以下的容积抑制率=（对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/对照组平均肿胀度4.3热毒宁注射液对二甲苯致小鼠耳肿炎症的抑制作用4.3.1药物配制 来比林的配制：将冻干粉针剂（0.25g/支）的来比林用3.8ml无热源注射用水溶解并稀释,用于小鼠尾静脉注射；4.3.2实验步骤与方法 小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3天。随机分成5组：对照组，来比林组（525mg/Kg），热毒宁注射液（20.30g/kg、10.15g/kg和5.08g/kg）三个剂量组。每日静脉给药一次，对照组给予等体积的生理盐水，注射速度为0.2ml/min，连续3天，末次给药15分钟后，将二甲苯30l/耳，均匀涂于右耳正反两面，以左耳作对照，30分钟后颈椎脱臼处死动物，剪下两耳，用6mm打孔器将小鼠双耳同部位打孔取材，分别精密称重，以两耳片重差值作为肿胀程度指标，计算肿胀度【2】，并求出抑制率比较药物组和对照组间的差异。肿胀度=右耳取材重量-左耳取材重量肿胀率=（右耳取材重量-左耳取材重量）/左耳取材重量100%4.4热毒宁注射液对小鼠毛细血管通透性的影响 4.4.1 试剂配制 配制1%伊文思兰溶液 4.4.2实验步骤与方法小鼠50只，雌雄各半，适应性饲养3天。随机分成5组：对照组，来比林组（0.2g/kg），热毒宁注射液（20.30g/kg、10.15g/kg和5.08g/kg）三个剂量组。每日静脉给药一次，对照组给予等体积的生理盐水，注射速度为0.2ml/min，连续3天。末次给药15分钟后，腹腔注射0.5%冰醋酸0.2ml，同时尾静脉注射1%伊文思兰0.2ml。30分钟后将颈椎脱臼处死动物，腹腔注入5ml蒸馏水，轻揉腹部数秒钟，于腹壁上剪一小口，用吸管吸取腹腔内液体，590nm处比色，测定OD值【2】。 二实验结果1. 热毒宁注射液对家兔肛温值的影响 注射内毒素后家兔肛温明显上升，1h、2h、4h家兔肛温值减基础肛温值（ 肛温值）的变化如图1，注射内毒素1h各组肛温值明显升高，与正常组比较均有显著性差异，表明发热模型制作成功。伴随药物治疗，热毒宁高、中剂量组均具有明显清热、降体温的作用,于注内毒素2h肛温值下降显著，与模型组比较具有显著性意义（P0.01）。00.811.2124时间/h肛温差值正常对照组模型组双黄连组低剂量组中剂量组高剂量组图1 时间体温反应曲线2.热毒宁注射液对家兔白细胞介素1（IL-1）、白细胞介素6（IL-6）、内皮素（ET-1)、前列腺素E2 (PGE2)的影响 家兔感染内毒素后，IL-1、IL-6、ET-1、PGE2明显升高，与正常组比较，模型组具有显著性差异P0.05；热毒宁注射液对IL-1、IL-6、ET-1、PGE2均有明显抑制作用，如表2。 表2.热毒宁对家兔IL-1、IL-6 、ET-1、PGE2的影响（n=10 ,）组别剂量IL-1（ng/ml)IL-6（pg/ml）ET-1（pg/ml)PGE2（pg/ml)正常组5.552.65#34087.91314377.6861073.46332.88#33.7032.22#模型组8.062.95*44231.71115689.103*1410.26324.56*38.6745.782*双黄连组175mg/Kg6.454.6937588.83813225.078905.43510.30#37.4982.825*低剂量组1.27g/kg6.913.3547221.31522297.927*1137.92313.0834.6972.505#中剂量组2.54g/kg7.642.5337692.48013085.1051207.72287.8936.3022.726*高剂量组5.08g/kg4.932.16#28717.3688286.304#*736.26336.06#35.1293.802与正常对照组比较：* P0.05、* P0.01；与模型组比较：#P0.05、#P0.01 3. 热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度及抑制率的影响由结果可知：热毒宁注射液高、中剂量组对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀均有明显抑制作用，1小时开始显效，持续至4小时；低剂量组在2小时方开始显效，抑制作用可持续至4小时。见表3表3大鼠足跖肿胀度及抑制率（n=10,） 模型组（生理盐水）来比林组(0.1g/kg)高剂量组(10.15g/kg)中剂量组(5.08g/kg)低剂量组(2.54g/kg)1h肿胀度(ml)0.710.0870.160.076#0.180.121#0.370.082#0.560.113#抑制率77.03%74.37%48.88%21.85%2h肿胀度(ml)1.210.1170.350.145#0.440.183#0.660.165#0.820.161#抑制率71.24%63.80%45.78%32.15%3h肿胀度(ml)1.320.0740.250.180#0.530.193*0.700.216#0.880.192#抑制率81.42%59.97%47.13%33.61%4h肿胀度(ml)1.340.1550.210.142#0.460.148#0.620.236#0.790.188#抑制率84.23%65.92%53.87%41.15% 与模型组比较#P0.05. 4. 热毒宁注射液对角叉菜胶致大鼠炎症介质的影响实验结果表明：热毒宁注射液高、中剂量组对角叉菜胶致大鼠炎症介质IL-1有明显的抑制作用；高、中、低三个剂量组对角叉菜胶致大鼠炎症介质 IL-6 均有明显的抑制作用，与模型组比较有显著性差异P0.05，见表4表4. 热毒宁注射液对大鼠血清IL-1、IL-6的影响（n=10，）组别剂量IL-1(ng/ml)IL-6 （pg/ml）正常组0.0650.031#34.5111.45#模型组0.1180.020*194.4194.50*来比林组0.1g/kg0.0610.035#38.43413.87#低剂量组2.54g/kg0.0680.01633.2910.10#中剂量组5.08g/kg0.0600.040#36.7018.84#高剂量组10.15g/kg0.0450.020#34.334 9.39#与正常对照组比较：* P0.05；与模型组比较#P0.05. 5. 热毒宁注射液对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用；对小鼠毛细血管通透性的影响由结果可知：热毒宁注射液高剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀有抑制作用；能明显降低小鼠毛细血管通透性P0.05见表5。表5. 热毒宁对小鼠耳肿胀度、肿胀率、毛细血管通透性的影响（n=10，）组别剂量肿胀度(mg)肿胀率(%)毛细血管通透性（OD值）模型组14.843.461.230.311.1130.412来比林组0.2g/kg7.324.03#0.590.32#0.3140.094#低剂量组5.08g/kg11.195.510.860.43#1.3350.530中剂量组10.15g/kg16.385.531.290.420.8100.505高剂量组20.30g/kg7.175.34#0.550.43#0.5380.181#与模型组比较#P0.05.三讨论本研究给家兔注入大肠杆菌内毒素（LPS）1h，模型组肛温急剧上升,继而出现拒食、嗜睡、寒颤、气急、精神萎靡等一系列内毒素中毒症状（类似上呼吸道感染）；血清中IL-1、IL-6、ET-1和PGE2水平明显增高。上呼吸道感染主要由病毒及细菌所引起，这些外源性致热源（细菌、病毒、内毒素等），作用于人体细胞产生内源性致热源，内源性致热源产生PGE2作用于下丘脑，从而引起发热，内源性致热因子主要包括IL-1、IL-6、TNF-、IFN-， IL-6是由单核/巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及淋巴细胞等细胞产生，具有多种功能的重要促炎因子，在细胞因子网络中发挥多种生物学作用，在上呼吸道感染中是重要促炎因子，不仅有致发热的作用而且诱导了细胞的增殖分化产生免疫球蛋白3。经热毒宁治疗后，动物上述中毒表现和炎性细胞因子的升高以及血管活性介质的失衡均得到明显地控制与改善；家兔肛温明显下降，对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀有明显抑制作用，1小时开始显效，可持续至4小时；大鼠血清IL-1、IL-6水平显著下降，并对二甲苯致小鼠耳肿胀有较强的抑制作用，使小鼠毛细血管通透性降低，结果表明热毒宁具有较强的抗炎解热作用。热毒宁注射液是国家二类新药，注射液有效成份为青蒿、金银花、栀子。青蒿：味苦、辛、性寒，辛以解表、寒以清热，故能透散风热，邪毒从肌表而解；金银花：银花味甘、性寒，功能清热解毒，助君药青蒿以增强其清热及透散之功，在方中为臣药；而栀子苦寒，具有清热解毒，凉血及泻火除烦之功，为佐药，助臣药金银花解毒。研究表明红肿热痛以及脓毒血症是感染性炎症病理过程反映的主要症状,它是由大量炎性细胞产生的介质参与的复杂现象,其中主要是炎性细胞因子的作用。【4】LPS和角叉菜胶都能激活单核细胞/巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子,如TNF、IL-1、IL-6等引起炎症反应【4、5、6】, IL-1可选择性通过血脑屏障，通过温度调节中枢释放PGE2而引起发热；IL-1、IL-6均有促炎症作用【7】。本研究采用LPS和角叉菜胶制模后动物出现体温升高、足趾肿胀、致炎因子增加等一系列炎症反应，与文献报道十分吻合。 不论何种性质的炎症,炎症介质在炎症产生的全过程中均起着非常重要的作用。PGE2是花生四烯酸经COX代谢产生的炎症介质,能扩张