大肠杆菌生产人γ-干扰素的发酵条件的探究.doc

燕山大学课 程 设 计 说 明 书大肠杆菌生产人-干扰素的发酵条件的探究设计题目大肠杆菌生产人-干扰素的发酵条件的探究设计主要内容1.不同的培养、诱导时间对菌体生长和重组人-干扰素表达的影响 2.葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响 3.发酵条件对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响 设计要求1.要有明确设计的目的2.设计合理的操作方式3.设计出合理的测定指标4.设计的内容要与题目基本一致5.设计总结与分析工作量1.至少阅读15篇以上的相关科技文献2.设计文字至少在15000字以上工作计划11.2111.23 选定设计题目11.2411.25 查阅相关文献11.2611.27 整理文献11.2811.30 撰写说明书12.1 检查内容，准备答辩12.2 答辩参考资料4 王斌斌, 王贵平, 李春玲 等. 干扰素生物学特性及应用研究进展, 2007, 32(3):13-15.5 李江凌, 成华 猪-干扰素基因克隆及表达效应研究M. 成都:四川大学, 2002.6 Shtrichman R, Samuel CE. The role of gamma interferon in antimicrobial immunity. Current Opinion in Microbiology, 2001, 4(3):251-259.指导教师签字基层教学单位主任签字说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。2011年12月 02日 摘 要本设计拟定在传统大肠杆菌生产人-干扰素的基础上，改变一些发酵条件，以期探究出最佳的发酵方案，提高发酵生产率。设计内容主要分为三部分：不同的培养、诱导时间对菌体生长和重组人-干扰素表达的影响；葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响；发酵条件对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响。第一部分设计拟定探索出最佳的培养、诱导时间，可以获得较高菌浓和-干扰素的高表达量；第二部分设计是在第一部分的基础上分析不同的培养基中成分对发酵生产的影响；第三部分设计就是在前两部分的基础上，探讨其它的发酵条件对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响。通过本次设计，拟定探讨出利用大肠杆菌生产重组人-干扰素的优选方案，以期提高产率。关键词：大肠杆菌；人-干扰素；发酵条件 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书目 录第一部分：文献综述1.干扰素北京概况 11.1 干扰素分类 11.2 IFN-的结构与来源 11.2.1 IFN-的分子结构 11.2.2 IFN-的来源 22. IFN-的主要生物学活性及作用机制 22.1 INF-的主要生物学活性22.1.1 抗病毒作用22.1.2 抗细胞增殖作用32.1.3 抗肿瘤作用32.1.4 免疫调节作用42.1.5 抗寄生虫作用52.2 作用机制63. -干扰素的应用前景83.1 人-干扰素的应用83.2 动物-干扰素的应用104. 干扰素的研究进展及意义10第二部分：课程设计部分1. 试验材料121.1 菌种121.2 培养基121.3 试验仪器122. 试验方法122.1 摇瓶种子培养132.2 摇瓶发酵培养133. 试验设计133.1 培养和诱导时间的影响133.2 培养基组成的影响133.3 发酵条件的影响134. 分析与总结134.1 人-干扰素基因工程菌的生长144.2 不同的培养、诱导时间对菌体生长和重组人-干扰素表达的影响144.3 葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响154.4 发酵条件对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响154. 设计总结16参考文献17燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书第一部分 文献综述1. -干扰素背景概况干扰素是一类多功能细胞因子。干扰素(interference，IFN)是由培养的细胞或动物体受到适宜的刺激时所产生的一种微量的、具有高度生物学活性的非特异性抗病毒物质。英国科学家Aliek等(1957)利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时，从中获得了一种高活性多功能的糖蛋白，该蛋白能够抑制流感病毒在绒毛尿囊膜细胞中的繁殖，他们称其为干扰素(interferon，IFN)。Lampson等(1963)纯化了干扰素，证明其是分子质量为2034ku的蛋白质。近年来，干扰素一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点，尤其是IFN-，因为它是诱导并激活巨噬细胞产生杀伤力机制中最重要的细胞因子1。1.1 干扰素的分类Youngert等(1973)研究结果发现，来自淋巴细胞培养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于以往发现的IFN，遂命名为型IFN。1980年国际干扰素命名委员会建议将各种干扰素先根据动物的来源确定分类，再根据干扰素的抗原特异性和分子结构分成不同的型别。哺乳动物的干扰素分为两类：型干扰素和型干扰素。型干扰素又主要包括IFN-、FN-、IFN-和IFN-，它们具有相关的结构并享用同一类受体。前3种主要是机体对病毒感染的应答产生的，能诱导机体抗病毒蛋白的产生。型干扰素又称免疫干扰素，即IFN-，是由活化的T淋巴细胞在诱导剂的作用下产生的，与型干扰素不享用同一类受体，对免疫系统有调节作用，是哺乳动物的巨噬细胞活化因子。此时型IFN就统一命名为IFN-。在医学界IFN-作为一种免疫佐剂已取得了较好的成就2。1.2 IFN-的结构与来源1.2.1 IFN-的分子结构小鼠的IFN-分子由l33个氨基酸组成。鸡的IFN-则由l64个氨基酸组成，并含有l9个氨基酸长度的信号肽。人的IFN-是一类糖蛋白，由l43个氨基酸组成（不含起始密码ATG 表达的蛋氨酸），其相对分子量为l6 924 D， 无分子内二硫键。糖蛋白通常以分子质量为34kD 的同源双体形式存在。人IFN-的2个亚单位以一种反平行方式互相作用。每个单体含6个螺旋，其中4个装配成短链螺旋细胞因子，不含折叠结构3。1.2.2 IFN-的来源IFN-作为一种细胞因子，是由多种细胞产生的一类能够调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症反应的发生和创伤愈合的激素样(微量而高效)可溶性多肽类物质。IFN-在多种免疫刺激下，如T细胞特异性抗原、葡萄球菌内毒素A、植物血凝素、佛波醇等诱生剂的刺激，主要由活化的T细胞、NK细胞及NK T细胞产生，其他细胞类型如巨噬细胞、刚突细胞和/T细胞在特定的条件下也能够表达IFN-4。2 IFN-的主要生物学活性及作用机制2.1 IFN-的主要生物学活性干扰素-具抗病毒，影响细胞生长分化、抗肿瘤和免疫调节等多种活性，与型干扰素相比，干扰素-具有较强的免疫调节活性，而抗病毒活性和抗肿瘤活性较弱。2.1.1 抗病毒作用干扰素-均有抗病毒作用，动物试验证明干扰素-抗病毒活性远较型低，干扰素-和干扰素-有相互加强抗病毒作用。干扰素抗病毒具有广谱性，但它对细胞抗病毒作用是间接的，而且是非特异性的。当干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后，可诱导细胞内产生有酶活性的抗病毒蛋白( AVP)。已知的AVP至少有3种：蛋白激酶、磷酸二脂酶和2-5A 合成酶，前两种能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，后一种降解mRNA，有的AVP还能抑制转录酶，阻止mRNA的形成，还有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此，可以说干扰素是通过AVP间接地抑制病毒复制而达到抗病毒作用的5。IFN-的抗病毒作用有种属特异性。IFN-引起的抗病毒作用主要是通过诱导一些目的基因的表达来实现的，这些目的基因表达产物主要是一些参与病毒RNA 降解和剪切的酶和蛋白质，这是IFN-抗病毒作用的主要机制，一些病毒感染过程中产生的抑制其信号传导过程的蛋白也是通过抑制IFN-诱导这些酶类的产生而进行的6。IFN-诱导2-5A 合成酶的能力低于IFN-和IFN-。不能诱导Mx蛋白表达。但是IFN-能够诱导病毒感染细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的作用。IFN-还能通过其他未知的途径抗病毒繁殖7。尽管IFN-的抗病毒效果远远低于型IFN，但在机体对病毒感染的长期控制过程中起着非常重要的作用。2.1.2 抗细胞增殖作用与IFN-和IFN-相比，IFN-也能抑制前癌基因的表达，阻止细胞株从G0期进入G1期；IFN-同样也能诱导肿瘤细胞株分化。用IFN-处理人A431细胞后，细胞形态发生改变，继而死亡，其机理可能是诱导了细胞的终末分化。IFN-能抑制许多肿瘤细胞株的生长，IL-1可抑制、协同或不影响IFN-对这些细胞的生长抑制作用。IFN-对另一些肿瘤细胞却有促增殖作用，IFN-还能促进其它细胞因子的抗肿瘤作用，使对IFN-不敏感的细胞转为敏感，两者在亚适剂量合用时即可控制小鼠移植肿瘤的生长。IFN-对癌基因转化的细胞也有抑制生长的作用，并且还能抑制癌基因的表达。IFN-的抗肿瘤作用是多方面的，包括多方面抑制肿瘤细胞生长和诱导多方面的免疫应答8。2.1.3 抗肿瘤作用IFN-在机体肿瘤发生、肿瘤移植排斥和肿瘤免疫检测过程中发挥着重要的作用，IFN抗肿瘤的作用机制是相当复杂的，这些活性可能是上述各种生物学活性综合作用的结果。IFN-可以通过激活机体参与先天免疫应答的多种细胞，发挥其抗肿瘤作用，这些细胞主要包括巨噬细胞、NK细胞和NKT细胞等。由于IFN-、对恶性肿瘤的治疗不理想，人们对IFN-寄以厚望。IFN-抗肿瘤活性主要表现在：直接的抗增生作用，可通过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖；通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程；激活巨噬细胞、NK细胞等以直接杀伤癌细胞或间接抑制癌基因；诱导肿瘤坏死因子并促进癌细胞对TNF受体、MHC类抗原的表达，使其易被杀伤性T淋巴细胞识别而被杀伤8。体外试验结果证实IFN-在许多肿瘤细胞上均可表现出抗增殖和有丝分裂的作用，但在STAT1基因突变或缺失的肿瘤细胞上，这种活性消失，导入STAT1基因后活性恢复，IFN-与受体结合后激活一些编码参与细胞分裂周期的一些抑制因子，阻止了细胞的分裂增殖9-10。2.1.4 免疫调节作用IFN-的主要生理功能是调节MHC和MHC类分子在大多数免疫细胞（如单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等）内的表达，但它却抑制MHC类分子在B细胞中的表达。而型干扰素( IFN-与IFN-)虽然能调节MHC类分子的表达，但却不能诱导MHC类分子的表达11。研究表明，IFN-能将MHC类分子在组成型表达该类分子的细胞中的表达量增加2-4倍，而且还能诱导MHC类分子在MHC缺陷型细胞中的表达。IFN-诱导所生成的反式作用因子能结合于MHC基因启动子区域的顺式作用元件而调节MHC基因的转录，因而增强抗原递呈细胞的抗原递呈能力。IFN-还是激活并调节单核巨噬细胞分化和功能的重要细胞因子之一。IFN-能促使源自骨髓的单核细胞前体分化为成熟的单核细胞，它增强巨噬细胞的抗原递呈功能不仅是通过增加MHC类分子的表达，而且通过增加细胞内很多与抗原递呈有关酶的表达水平。另外，IFN能增加巨噬细胞表面蛋白ICAM-的表达水平从而增强其在抗原递呈过程中与T细胞的相互作用。IFN还能影响免疫系统的其它细胞，如调节B细胞的免疫球蛋白亚型转换并阻止IL-4诱导MHC类分子在B细胞中的表达。IFN能间接调节CD4+ T细胞特异性亚型的分化。研究表明，IFN对CD4+ Th2细胞具有抗增殖效应而对CD4+Th1细胞无影响，IFN的这种调节功能确立了其在免疫应答过程中决定免疫效应功能类型的重要作用。Th2或Th1细胞是决定免疫类型的主要因素，Th1细胞的选择性激活导致细胞免疫，而Th2细胞选择性诱导体液免疫。虽然决定增殖的CD4+ T细胞分化成Th1还是Th2细胞的因素还不甚明确，但是IFN和IL-10交叉调节Th2和Th1细胞的效应功能从而决定免疫应答的方向。IL-10抑制CD4+Th1细胞和NK细胞合成IFN而使免疫应答朝体液免疫方向进行，而IFN通过抑制CD4+ Th2细胞的增殖而抑制其分泌IL-10、IL-4、IL-5等激活B细胞的细胞因子，从而抑制体液免疫而使免疫应答向细胞免疫应答的方向进行。IFN是主要的巨噬细胞激活因子(MAF)，直接诱导参与呼吸爆发的酶的合成，导致巨噬细胞杀伤吞噬的微生物和肿瘤细胞。当前，很多学者纷纷将目光集中在IFN诱导细胞内一氧化氮的合成上。NO是细胞内诱导型一氧化氮合成酶催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的产物，它在细胞清除胞内微生物病原体过程中具有非常重要的作用。在IFN和TNF的诱导下，巨噬细胞内诱导型一氧化氮合成酶迅速表达，因而增强其吞噬活性。IFN能增加高亲和力Fc受体( FcR)在单核细胞、巨噬细胞表面的表达，促进这些细胞参与抗体依赖的细胞毒反应12。2.1.5 抗寄生虫作用IFN是细胞介导免疫的重要免疫分子，具有比较强的抗球虫作用，也是抗弓形虫免疫中起主导作用的细胞因子。Michalski等报道鸡干扰素可以直接作用于寄生虫，而不是作用于宿主细胞。Min在研究多种细胞因子对艾美尔球虫DNA疫苗的佐剂效应时，发现IFN基因可显著抑制该寄生虫的增殖。Lilehoj等提出在抗球虫过程中鸡干扰素可以影响子孢子的发育，但不影响其侵入细胞。IFN可诱导免疫细胞活化，介导机体免疫细胞抑制弓形虫增殖，杀伤细胞内弓形虫。其抗虫作用主要通过活化巨噬细胞产生超氧离子、启动精氨酸依赖的NO途径活化巨噬细胞、诱导降解色氨酸等途径，抑制了弓形虫的增殖。由于动物种类的不同，机体内组织细胞不同，IFN的这种针对不同细胞进行的不同方式的调节，正是它免疫调节作用的独特性。然而，IFN仅是机体对弓形虫的免疫调节复杂网络系统中的一个重要成分，各种细胞因子之间的相互协同，相互制约是免疫调节的基本操作方式，这种调节促成了机体最佳的免疫状态，同时防止机体自身免疫病理性损伤13。不论是外源性IFN，还是内源性的IFN，都表现了强大的抗虫效应。诸多的试验证实外源性的IFN具有强大的抗感染效应，内源性的IFN在阻止弓形虫增殖、促使休眠状态弓形虫包囊形成、防止包囊的活化突破等方面具有重要的作用。资料显示IFN可以降低IL-6对IFN诱导抗弓形虫效应的逆转作用，可对CD8+T细胞的分化成熟起促进作用，进而对弓形虫速殖子感染的靶细胞产生较强的细胞杀伤作用，诱导增强巨噬细胞吞噬杀灭虫体的功能，激活巨噬细胞内的呼吸爆发，释放出各种对虫体具有毒性的含氧离子杀死虫体等14。用弓形虫速殖子感染骨髓源巨噬细胞后，加入IFN或LPS可导致特异性抗原的产生；加入外源性NO可强烈地抑制弓形虫增殖，而内源性产生NO足以使细胞内弓形虫处于静止休眠状态。Suzuki Y等报道，小鼠Lyt22+在抗弓形虫免疫效应中，IFN是主要介导者，IFN在体外活化了巨噬细胞，提高其吞噬能力，抑制弓形虫增殖，杀伤细胞内弓形虫。2.2 作用机制IFN的生物活性在体内的作用机制是很复杂的，相关资料显示它可能有2种信号转导途径。研究结果表明干扰素并不是直接与靶分子结合。首先要与靶细胞表面的特异性受体即IFN受体相结合，使受体发生二聚体化，导致结合在其上的JAKl、JAK2的磷酸化，激活的JAKs进一步使受体磷酸化，招募并磷酸化胞浆内的STAT1。活化的STATl以二聚体形式进入细胞核，结合GAS(gamma-activated sequence)，诱导基因表达。这就是经典的JAK-STAT信号转导途径。一般认为，在未受刺激的细胞，JAKl与IFN-R的亚基相结合，JAK2与IFNR的亚基相结合。在IFN作用后，JAK2也与亚基相结合。JAKl和JAK2相互靠近，相互磷酸化后而激活，由此吸引有SH2结构域的STATl结合到IFN受体上，从而激活STATl。激酶异二聚化相互激活使IFNR亚基的Tyr440磷酸化，它可选择性地与STATl(P91)结合。STATl的第569700位氨基酸序列类似于Src同源结构(SH2)，其中Arg602突变将会丧失其与IFN2受体的结合。STATl与磷酸化的IFN-R结合后，导致STATl中Try701和Ser727磷酸化，形成同源二聚体(又称IFN活化因子，GAF)，进而激活STATl潜在的DNA结合活性。STATl的活化需要2类胞内信号事件的发生，一为结合IFN受体，二为依赖Ca2+内流。IFN可以促进Ca2+向细胞内转移，并激活钙调素依赖激酶(CaMK)，使STATl第727位的丝氨酸磷酸化(Wu，2007)。除了JAK-STAT信号转导途径，-干扰素还存在其他的传导途径来行使它的生物学功能。IFN-与其受体结合后可以激活非受体型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，如Src家族中的P59(fyn)。Uddin等证实IFN-作用于造血细胞系后，P59(fyn)活化并结合JAK2；在IFN-介导的信号通路中，P59(fyn)也能够与IFN-特异性依赖的Tyk2的接头蛋白c-Cbl相互接触。此外，已证实c-Cbl、CRKL、CRKII和Vav等起连接效应的接头蛋白参与了IFN-依赖的信号通路。在IFN-刺激下，c-Cbl发生酪氨酸磷酸化，为衔接蛋白CRKL提供了停靠位点。而CRKL通过其SH3区继而激活相应的鸟苷酸交换因子C3G和小G蛋白RAP21，发挥IFN-的抗增殖效应。此外衔接蛋白CRK蛋白含有的SH2与SH3结构域，能作为衔接分子促进由刺激引起的信号复合物的形成。SH2与上游蛋白-IFN受体作用，通过CRKL的N端SH3结构域与鸟嘌呤核苷酸交接因子(GEF)的C3G相联系。C3G是RAPl的一种GEF，也是一种与RAS相关的小GTP酶。通过CRKL依赖方式，IFN-能快速而短暂地激活RAPl。RAPl下游的激活是IFN抑制生长的一种机制。但是这种RAPl抗增殖作用的准确机制还在研究之中。除了RAPl-RAS，RAPl能活化有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联反应，RAPl下游的效应分子还与IFN-的免疫调节作用有关。Takaoka等在研究IFN-对小鼠胚胎成纤维细胞的作用时发现，IFN-能开放Raf-MEK-MAPK信号转导通路，且该通路的开放受JAK2激酶的调控15。还有报道认为：通过未知递质，由IFN-诱导的JAK能活化磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的催化亚基p110。PI3K的活化导致下游PKC-8的活化，进而使STAT-1上的ser727磷酸化，促进IFN-诱导的转录。PKC-作为STAT-1上ser727的磷酸激酶，通过介导促凋亡基因的转录，诱导凋亡，在IFN-的抗增殖、抗肿瘤特性中起重要作用。研究结果表明，不同PKC亚型的分布具有组织特异性，其他亚型的PKC如PKC-、PKC-也参与IFN-诱导的转录。除了促凋亡，PI3K还能促进IFN-诱导的小神经胶质细胞表达诱生型一氧化氮合酶(iN-OS)，促进单核细胞的黏附。3. -干扰素的应用前景3.1 人-干扰素的应用IFN-经历了对其诱导物、作用介质及血液制品3个阶段的研究，但均未能很好地满足临床应用的需要。随着基因工程技术的发展，20世纪70年代，人们开始尝试用基因工程的方法大规模生产具有高生物学活性同时成本低廉的IFN-，并对其表达系统进行改造。人IFN-基因克隆已成功，并在大肠杆菌、枯草杆菌、哺乳动物细胞和昆虫细胞中进行了表达，且用大肠杆菌表达系统进行了生产。1993年，美国FDA批准基因工程IFN-上市，主要用于慢性肉芽肿性疾病的治疗；2002年，FDA批准IFN-治疗严重恶性骨骼石化症；1994年，我国SFDA批准大肠杆菌生产的重组人IFN-投入市场，用于治疗类风湿性关节炎。近年来，研究者不断尝试应用IFN-治疗或协助诊断一些其他疾病。由于IFN-能够抑制细胞增生，促进细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，具有抗病毒及免疫调节活性，还可抑制基因的表达，因此引起了人们对其在治疗恶性肿瘤方面的关注。目前，已有文献报道将IFN-用于肝细胞癌(Hepatic cellular carcinoma, HCC)切除术后和消融术后，以预防复发，如Nishisuchi 等对30例行HCC根治性术后患者进行长达88周的IFN-治疗，结果显示，IFN-治疗可提高术后患者的累积生存率。Lin等也对行消融术后的HCC患者进行IFN-治疗，结果发现IFN-能够降低肿瘤复发率，提高患者生存率。IFN-局部用药，还可治疗暴露性肿瘤，如恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、宫颈癌等。病理性瘢痕是导致一些疾病术后继发畸形的主要原因之一，研究显示，IFN-能够抑制瘢痕形成的主要效应细胞成纤维细胞的增殖活性及DNA合成，临床上可用于治疗病理性瘢痕。丁丁等探讨了重组人IFN-对体外培养的腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞生物学作用的影响，发现IFN-是成纤维细胞负性调节因子，在防治腭裂术后裸露骨面瘢痕形成中具有一定的应用价值。血管内皮细胞氧化应激损伤是多种临床疾病发生发展的关键环节，常见于动脉粥样硬化、组织缺血/再灌注等。周荣等报道，IFN-可诱导血管内皮细胞对氧化应激的保护作用，减少血管内皮细胞氧化应激性损伤。IFN-的抗病毒活性及其免疫调节作用是其对抗一些病毒性疾病的主要机制。尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒感染所致，该病的发生和对治疗的反应与患者的免疫功能，尤其是细胞免疫功能密切相关，IFN-能够增强细胞免疫功能可能是其可治疗尖锐湿疣的机制。张京滨报道，用大剂量IFN-治疗儿童病毒性脑炎，疗效十分显著；纪晓光等发现IFN-在体外能够抑制SARS 冠状病毒的活性，可用于防治SARS。虽然IFN-对一些疾病显示出十分显著的疗效，但其治疗作用也存在分歧，如对纤维化的治疗：IFN-被认为是一种很强的抗肝纤维化因子，能显著抑制所有细胞外间质成分合成，Weng 等用IFN-治疗慢性乙型肝炎肝纤维化，发现IFN-能够减轻肝纤维化的程度；Ziesche 等用IFN-1b 联合其他药物治疗特发性肺纤维化，对患者肺功能和血气均有所改善，而对照组患者病情出现了恶化；但是，Pockros 等报道，IFN-对慢性HCV引起的严重肝纤维化的疗效不佳；Raghu 等报道，IFN-1b仅能延长病变较轻的肺纤维化患者的生存期，而对肺纤维化疾病进展、死亡率、换气功能、肺功能等无明显改善。因此，对不同病因引起的纤维化，IFN-的治疗效果是否有差异、其治疗纤维化的最佳时机、最佳使用剂量及疗程仍需进一步研究。IFN-的基因多态性及在血清、病理产物中的IFN-水平对一些疾病的诊断和预后有相关性。蓝艳等研究证实，人IFN-基因的874A /T多态性与系统性红斑狼疮（Systemic lupus erthematosus，SLE）的发病具有相关性，携带T等位基因的个体可能通过促进IFN-的高度表达增加了SLE的发病风险。Ben-Ari等研究发现，人对乙肝病毒的易感性与IFN-基因的表达量差异有关。由于IFN-能够激活巨噬细胞增加其对结核杆菌的杀伤能力，抑制分枝杆菌的生长，从而在机体抗结核免疫中起重要作用，因此在机体感染结核杆菌后，IFN-的水平会出现异常。汪先桃等对胸膜患者胸水中IFN-的水平进行了监测，结果显示，结核性胸膜炎患者胸水中IFN-呈现高水平，有助于结核性胸膜炎的诊断。另外，重组人IFN-还可作为佐剂，与弓形虫STAg联合鼻内免疫小鼠，可协同STAg 有效诱导黏膜和系统免疫应答，提高弓形虫攻击小鼠的存活率，降低组织内虫荷，并可使免疫应答持续较长时间16-18。3.2 动物-干扰素的应用IFN-的作用具有一定的种属特异性，对于一些动物疾病的治疗，相应的IFN-具有很好的应用前景。相对于人IFN-而言，动物IFN-的研究相对滞后，虽然目前已有部分动物基因工程IFN-上市，但大部分还处于实验室研究阶段。到目前为止，已有猴、猪、马、牛、羊、鹅、犬、猫、兔、鹿、海豚、鸡、鸭、熊猫等不同动物的IFN-基因被克隆，并已发现鱼的IFN-基因。应用多个表达系统已对一些畜、禽的IFN-进行了表达，如猪、牛的IFN-在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞中获得了表达；马、鸡、犬的IFN-基因也在大肠杆菌中获得了表达。表达产物经细胞病变抑制试验证实，均具有一定的抗病毒活性。除大肠杆菌外，其他表达系统表达的IFN-尚未形成商品化的临床应用制剂，但许多研究表明，动物IFN-直接作为治疗制剂可有效抑制病毒复制，作为免疫佐剂与疫苗同时使用可提高疫苗的免疫效果，增强免疫水平：如重组猪IFN-可抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒、传染性胃肠炎病毒；牛IFN-能够抑制口蹄疫病毒、呼吸道合胞体病毒、副窦病毒等；重组牛IFN-作为免疫佐剂可用于奶牛乳房炎、细菌性疾病的治疗；重组鸡IFN-能抵抗球虫；重组羊IFN-对感染羊细胞的衣原体具有较好的抑制作用。这些研究结果表明，动物IFN-与人IFN-一样，对一些疾病的治疗和预防起着重要作用，值得深入研究19。4. 干扰素的研究进展及意义近年来随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆，许多细胞因子基因工程药物面市。给治疗畜禽疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益。同时我们也应该注意到在IFN的应用过程中出现的不良反应和动物种属特异性等问题。目前看来，从多个角度对IFN的结构进行改造，赋予其新的功能以及大量生产高质量的IFN制剂是重要的两大问题。不同IFN的组织亲和性和生物学作用亦有待了解，IFN的提纯和测定方法尚不够稳定和简化。这些问题的解决，将有助于IFN研究广泛深入地发展。IFN的进一步研究对加强我国畜禽传染病防控的技术，推动畜牧业发展有极大的作用，对构建动物IFN基因重组疫苗，提高其免疫效力、降低病毒载体毒性等方面有着重要的意义。第二部分 课程设计部分大肠杆菌生产人-干扰素的发酵条件的探究人-干扰素具有重要的生物学活性，主要表现为：抗病毒、抗肿瘤（抑制细胞增殖）和对免疫系统的调节作用等，临床上对慢性粒细胞白血病、类风湿性关节炎及过敏性皮炎等疾病均有良好的疗效。由于天然人-干扰素生产成本高，产量低，难以大规模应用于临床，1982年，美国Genetech公司的Gray等人首先完成了人-干扰素基因的克隆和表达，为人-干扰素的大规模制备创造了条件。本设计-干扰素基因工程菌的培养条件进行了研究，确定了人-干扰素高表达的发酵条件，为下一步的复性、纯化工作打下了基础。1试验材料1.1 菌种所采用的菌种为含质粒pBV220IFN-DH5的基因工程大肠杆菌，由浙江大学生物工程研究所保存。1.2 培养基种子培养基：LB培养基，含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，pH为7.27.4，发酵时加入100 mg/L的氨苄青霉素。固体培养基：在上述配方中加入2%的琼脂。发酵培养基：LB+M9培养基，含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，Na2HPO412 H2O 12.6 g/L，KH2PO4 3 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，发酵时加入100 mg/L的氨苄青霉素，浓度为1 mol/L的MgSO48 mL/L，质量分数为20%的葡萄糖溶液10 mL/L. 1.3试验仪器试管、锥形瓶、接菌环、培养皿、等2.试验方法2.1 摇瓶种子培养将保藏的斜面菌种在平板上划线得到单菌落(30 培养24 h以上)，挑取单菌落移接种子液(在50 mL锥形瓶中装入5 mL种子培养基及100 mg/L的氨苄青霉素)，30 ，200 r/min，培养12 h2.2 摇瓶发酵培养将培养好的种子液接种于发酵培养基中（在250 mL锥形瓶中装入50 mL发酵培养基及100 mg/L的氨苄青霉索），转速200r/min，30 培养，42 诱导，测定OD600和重组人-干扰素的表达量。3.试验设计3.1 培养和诱导时间的影响分别在30 培养5、8、12 h，42 诱导后继续生长2、4、6 h，测定OD600和重组人-干扰素的表达量。3.2 培养基组成的影响针对发酵培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和目标蛋白表达的影响，选定这3个因素，进行正交试验L9 (34)，其因素和水平见表1。表1 培养基因素水平表水平葡萄糖/（gL-1）蛋白胨/（gL-1）酵母提取物/（gL-1）1152.522105.033157.53.3 发酵条件的影响针对培养过程中摇床转速、接种量、装液量和pH对菌体生长和目标蛋白表达的影响，选定这4个因素，进行正交试验L9 (34)，其因素和水平见表2。表2 发酵条件因素水平表水平转速/（rmin-1）接种量/%装液量/%pH11801106.022002206.832205407.54分析与总结4.1人-干扰素基因工程菌的生长将培养好的种子液按150的接种量，接入装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30 ，200 r/min培养，每隔1 h取样测OD600值，以OD600为纵坐标，时间（t）为横坐标绘制菌体生长曲线。4.2 不同的培养、诱导时间对菌体生长和重组人-干扰素表达的影响大肠杆菌pBV220IFN-DH5的发酵过程分为两个阶段：30 培养阶段和42 诱导阶段。因为在pBV220IFN-DH5中的噬菌体的启动子PL受控于温度敏感Cits857突变等位基因，在30 培养阶段，细胞合成了阻遏蛋白，该蛋白阻遏了-干扰素基因的正常表达，表现为细胞不合成-干扰素，这一阶段有利于细菌的生长、增加质粒的拷贝及提高质粒的稳定性。在42 诱导阶段，阻遏蛋白失活，-干扰素基因得以正常表达，开始合成-干扰素。由于-干扰素的过量表达，在宿主细胞内形成了称之为包涵体的不溶性聚集体。包涵体对细胞的生长和质粒的稳定性会产生一定的影响。本试验采用在对数生长初期（30培养5 h，OD600=0.34），中期（30培养8 h，OD600=0.9），和后期（30培养12 h，OD600=1.3），分别诱导2、4、6h的培养诱导策略。预期效果，对于最终菌浓，对数后期诱导高于对数中期，对数中期诱导高于对数初期，但对数后期诱导2、4、6 h的菌浓，呈下降趋势。这可能是由于一方面细菌培养时间长，培养基中的养分消耗殆尽；另一方面由于此时温度为42 ，高于大肠杆菌的最适生长温度37 ，菌体的代谢会显著加快，而菌体的过速生长会使菌体提前进入衰亡期。随着诱导时间的延长，-干扰素的表达量逐渐增加。在对数中期诱导6 h表达量最高；在对数初期开始诱导，由于细菌还处于年轻时期，环境突然改变，干扰了微生物代谢，超出了菌体的“承受”能力而降低了-扰素的表达；菌体在对数生长后期时，生长活力已经不太旺盛，培养基养分也不太充足，在此时升温诱导，菌体本身已处于衰老状态，菌体内-干扰素的合成能力降低，表达量也减少；另外，菌体生长与-扰素表达有一定制约关系，在养分有限而菌体生长又比较旺盛时，-干扰素的表达就会受到抑制。片面追求发酵液中菌体密度以获得较高产量的包涵体件往导致菌体蛋白在包涵体形成中的渗入，即使经过尿素、Triton X-100洗涤，也难获得较高纯度的包涵体，最终严重影响到复性产率。在菌体处在对数生长中期，菌体的活力旺盛，培养基养分充足，在此时升温诱导6 h，可以获得较高的菌浓和-干扰素的高表达量。4.3 葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响通过正交试验可以得到不同葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物浓度下菌体生长和-干扰素表达的实验结果。可预期，优选试验方案为：葡萄糖2 g/L，蛋白胨15 g/ L,酵母提取物7.5 g/L。各因素对菌体生长及-干扰物的表达影响作用大小为：酵母提取物蛋白胨葡萄糖。在培养基中添加葡萄糖可以加快工程菌的生长速率，缩短发酵周期。酵母提取物和蛋白胨作为氮源物质与-干扰素的表达密切相关，增加二者的量有利于提高-干扰素的表达水平。4.4 发酵条件对工程菌生长和重组人-干扰素表达水平的影响按照表2设计的正交试验，考察了不同发酵条件下菌体的生长和-干扰素表达情况。预期优选方案为：摇床转速：220r/min，接种量：1%,装液量：20%，pH：6.8。各因素对菌体生长及-干扰素的表达影响作用大小为：装液量转速pH接种量。装液量与摇瓶中的溶氧及营养物质的量有关。溶氧对细菌生长及产物形成都是重要的因素。由于氧在水中的溶解度很小，因此氧往往成为发酵过程的限制性因素。装液量过大，进入摇瓶中的空气量就少，在细菌进入对数生长期后，易造成溶氧恶化；装液量过少，营养物质的量不足，会减少目标蛋白-于扰素的表达量。外源基因在高效转录和翻译时需要大量能量，及时给予充足的供氧量对目标产物的高效表达有重要作用。摇床转速快，溶氧浓度越大，越有利于-干扰素的表达，pH影响代谢中各种酶的活性，大肠杆菌的最适pH为707.2，降低pH虽然减慢了比生长速率，但可以减少杂蛋白的干扰，从而提高包涵体中目标蛋白的产量。接种量并非越大越好，由于摇瓶的装液量是一定的其中的营养物质和供氧量也是一定的，接种量太大，虽然在生长初期，菌体生长繁殖速度快，但到了诱导阶段，由于营养物质和供氧量的限制，导致目标蛋白的表达量降低。综上所述，本实验最终的优选实验方案为：人-干扰索基因工程菌在30 培养8 h，升温至42诱导6 h，培养基组成为葡萄糖2 g/L，蛋白胨l5 g/L，酵母提取物7.5 g/L，NaCl 5 g/L，Na2HPO412 H2O 12.6 g/L，KH2PO4 3 g/L，NH4Cl 1.0 g/L, 发酵时加入100 mg/L的氨苄青霉素，浓度为1 mol/L的MgSO42 mL/L；发酵条件为：摇床转速220 r/min,接种量1%,装液量20%，pH 6.8。5设计体会按照这次的课程设计要求，预期可探索到优选试验方案，产率比传统的生产重组人-干扰素的方法提高30%左右。通过这次的设计，我学习到了很多在课本上学习不了的东西，也了解了许多关于生产发酵实践方面的知识，使我获益匪浅。我相信，这次课设对我以后走向社会，走上工作岗位会有很大的帮助，非常感谢学校和