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基于液芯波导原理的微流控芯片基于液芯波导原理的微流控芯片窗体顶端窗体底端V o l 25 . 2 0 0 4年4月 高等学校化学学报 CH EM ICAL JOU RNAL O F CH I ESE UN I ER S IT IES N V N o. 4 610 613 基于液芯波导原理的微流控芯片长光程光度检测系统 杜文斌, 方群, 方肇伦 ( 浙江大学化学系, 微分析系统研究所, 杭州 310028) 摘要提出了一种基于液芯波导 (L iqu id co re w avegu ide, L CW ) 原理的微流控芯片吸收光度检测系统. 通过 芯片与外界接口技术实现液芯波导管与芯片的耦合, 建立了芯片上长光程 ( 毫米至厘米级) 吸收光度检测池. 采用邻菲啉2铁 ( ) 显色体系验证系统分析性能, 以 5. 5 cm 外覆 T eflon A F 液芯波导管作为检测池 ( 检测 ) 配合物的检出限为 2+ 2+ FeSO 4 ?7H 2O , 加入 2. 5 mL 1 m o l L HC l 稀释至 500 mL. 以超纯水稀释 Fe 储备液, 配制 Fe 标准 D 2C 紫外2可见分光光度计 ( 北京瑞利分析仪器公司). 微流控芯片的检测技术是微全分析系统 1 (M TA S) 中的一个重要研究领域. U V 2 is 检测 2, 3 以其 V 广泛的适用性在仪器分析领域占有重要地位, 也是最早应用于微全分析系统的检测方法之一. 但在微 米级尺度的芯片微通道内实现吸收光度检测, 检测池的吸收光程和光通量均受到很大限制. 近年来, 芯片上长光程光度检测系统的研究 4 10 按其技术路线的不同, 可分为 3 类: ( 1) 采用微加工技术, 加 大微通道的深度或宽度 4 , 或在芯片上制作 U 形 5 结构的流通检测池, 增加吸收光程, 报道的最高检 测 光程为 120 ; ( 2 ) 制作三层夹心结构芯片, 流通池检测光程 ( 720 ) 等于夹层芯片的厚度 6 ; m m ( 3) 采用镜面反射及平面波导技术提高吸收光程 7 10 , 在芯片通道内加工或集成多重平面反射结构作 为吸收池, 报道的检测光程由 272 到毫米级. 上述方法对吸收池光程的提高均较为有限. 在常规光 m 度检测中, 采用液芯波导原理以提高检测光程是一种提高灵敏度的有效方法 11, 12 . 本文利用微流控芯 到厘米级, 检测灵敏度达到和超过常规分光光度计水平. 同时系统还具有结构简单, 容易加工, 对光 学系统要求低等特点, 可应用于芯片上连续流动和流动注射分析系统中 . 片与毛细管耦合技术, 将液芯波导毛细管集成到微流控芯片的通道出口作为吸收池, 建立了一种新的 芯片上长光程的光度检测系统 13 . 采用邻菲啉2铁 ( ) 显色体系验证系统性能, 检测池有效光程达 1实验部分 1. 1试剂和仪器 系列溶液. 测定前将 Fe2+ 标准系列溶液及空白溶液与显色剂溶液预先混合 ( 体积比为 32). W ZS 250F 双通道微量注射泵 ( 浙江大学医学仪器厂) ; 光电倍增管 ( 北京滨松光电子技术有限公 司 ) , 微光测量仪 ( 西安瑞迈科技) ; 数据采集卡 ( PCL 2818L , 122b it A D , 台湾研华科技) ; W FZ8002 收稿日期: 2003205206. 基金项目: 国家自然科学基金重大项目 ( 批准号: 20299030) 及教育部科学技术研究重点项目 ( 批准号: 01093) 资助. 联系人简介: 方群 (1966 年出生) , 男, 博士, 教授, 从事微流控分析芯片研究. E 2 ail: fangqunm ail hz. zj cn . . m 微芯片的加工: 采用湿法刻蚀和高温键合技术加工 15“T ” 形通道玻璃微芯片, 通道宽 100 , 深 m (o2Phenan th ro line) 20. 2% 盐酸羟胺2乙酸钠混合液 14 . Fe2+ 储备液 ( 2 mm o l L ) 配制: 准确称取 0. 278 g ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 池体积 240 nL ) 时, 芯片系统的检测线性范围为 0. 03 50 o l L , 对邻菲啉2铁 ( m 8 nm o l L , 检测池有效光程达 1. 7 cm , 分析精度 R SD (n = 5) 为 0. 8%. 关键词微流控芯片; 液芯波导; 吸收光度检测 中图分类号O 657文献标识码A 文章编号025120790 ( 2004) 0420610204 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯, 并 以 超 纯 水 配 制. 显 色 剂2缓 冲 剂 溶 液 为 0105% 邻 菲 啉 N o. 4 杜文斌等:基于液芯波导原理的微流控芯片长光程光度检测系统 611 30 , 其构造见图 1. 以钻头在通道 A , B 两端钻 m 1. 2操作 直径 1. 1 mm 孔作为试样和试剂的进口, 与注射泵 导管相连; C 端为开口微通道 将平行于 A , B 通 . 道的玻璃侧表面抛光, 以便光源直接照射. 微检测池的加工: 取一定长度的液芯波导管 石英毛细管外覆 T eflon A F (www. dupon t. com teflon af) , o. d. 375 , . d. 50 , 在波导管入 m i m 射端面及入射端外壁涂覆厚约 5 10 的黑色油 m 漆涂层 ( 图 1) 以进行表面避光处理, 涂覆时毛细管 另一端通入空气以保证其通道不被堵塞. 采用文献 F ig. 1Schema tic d ia gram of the m icroch ip system w ith a 方法 16 在芯片 T ” “ 形通道 C 端出口处加工连通微通 道的同轴孔道 ( 3 mm 380 ). 将液芯波导管涂 m 漆端小心插入孔道内, 避免油漆层的破损, 用环氧 树脂胶将芯片与波导管固定. 检测系统光源采用高亮度准单色发光二极管 ( 最大波长 505 nm , 半峰宽 37 nm , 工作电压 3 V ) , sca le) A and B. In let; C. outlet channel coup led w ith L CW cell; the cap illary in let; F. epoxy; G. L CW cap illary; H. m ask ing m aterial; . I w aste reservo ir; J. connected to PM T; K. black box in sulating system from l iqu id core wavegu ide cap il lary for long optica l pa th- length absorbance m ea surem en ts ( not to D. channels in ch ip; E. black pain t covered on surface of op tical fiber 放置于距液芯波导管入口 2. 5 mm 处. 波导管周围 am bien t ligh t; L ED. ligh t2em itting diode, 505 nm. 覆盖避光保护层. 采用 500 直径的单芯石英光 m 纤与波导管出口同轴对准, 直接收集光信号. 光纤另一端进入光电倍增管, 对准光电倍增管的光窗检 测 以上芯片检测系统放置于暗盒内. . 考察芯片性能时, 由芯片的 A , B 两个通道交替注射邻菲啉2铁 ( 速 260 nL s, 时间间隔 1 m in. ) 配合物溶液和空白溶液, 流 2结果与讨论 2. 1光路系统的设计 简化光学系统见图 1. 分析系统的光源采用固定于芯片上的绿色发光二极管, 其发射光线透过玻 璃壁, 直接入射波导管入口, 利用避光涂层和保护层, 挡住从石英管壁和外侧入射的光. 系统无须采 用聚光镜或狭缝等光学器件. 在液芯波导管出口用单芯石英光纤与其同轴对准, 直接收集光信号. 由 光纤将光导入光电倍增管检测. 检测端口同时也是检测溶液出口, 将此部分置于废液池中, 从波导管 流出的样品进入废液池. 保持液体连续流动使试样不在管口留存, 可保持出口检测处的信号稳定. 用 发光二极管直接近距离照射可使得系统有较高的光通量, 有利于降低测定检出限. 如系统在使用空白 溶液时, 透过光可在微光测量仪上产生约 2 V 的输出信号 ( 光电倍增管负高压- 350 V ) , 基线噪声信 号1 mV. 本实验所用光源 发光二极管的半峰宽为 37 nm , 结果显示, 由非单色光所造成的对朗 伯2比尔定律的偏离现象在吸光度大于 1 时方有所显现, 因此对系统分析性能影响很小. 2. 2液芯波导吸收池 16 T eflon A F 液芯波导管 是一种理想的适用于 水溶液体系的全反射吸收池. 其工作原理如图 2 所 示, T eflon A F 的折射率为 1. 29, 低于水的折射率 1. 33, 当入射光与波导管的轴向所成角度 14. 6 时, 入射光在石英管壁和 T eflon A F 膜之间发生全 反射, 当溶液中没有吸光物质时, 光能以极低的损 耗在管内传播. 实际测定时, 入射光通过管内溶液 F ig. 2 Pr in c iple for l iqu id core wavegu ide fused- sil ica cap il lary w ith Tef lon AF- coa tin g 即被待测组分所吸收, 从而产生吸光度变化. ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 612 高等学校化学学报 . V o l 25 理想的吸收池设计, 光源光应全部由波导管液流通道入口导入吸收池, 避免入射光由管壁导入, 否则将增大不经过试样溶液的光通量, 降低检测的灵敏度. 为此, 在波导管入射端截面涂覆黑色油漆 进行管壁的避光处理, 获得良好效果 液芯波导管检测端 CCD 显微拍照实图 ( 图 3) 对比了进行和未进 . 行避光处理的液芯波导管的不同导光效果. 图 3 (A 1 ) 和 (A 2 ) 为波导管入射端面没有避光涂层的光分布 图, 图 3 (B 1 ) 和 (B 2 ) 为进行了避光处理的光分布图. 图 3 (A 1 ) 和 (B 1 ) 管内注射 0. 2 mm o l L 邻菲啉2 铁 ( ) 配合物溶液 ( 采用 1 cm 光程比色池的分光光度计测定, 吸光度为 2. 2) , 图 3 (A 2 ) 和 (B 2 ) 管内注 射空白溶液 可见, 未进行避光处理时, 由溶液光吸收产生的变化对总光量的影响不大, 因为大部分 . 光均在石英壁中传播. 进行避光处理后, 背景光得到有效扣除. 上述处理方法具有油漆涂层的稳定性 好、强度高、方法简单易行、无需使用狭缝及光学对准等器件且有利于实现波导管与芯片的耦合等优 点 通常, 在一定范围内, 吸收光程与波导管的长度成正比. 采用直线型液芯波导管, 对 10 o l L 邻 . m 菲啉2铁 ( ) 配合物进行检测, 2. 0 cm 波导管测得的吸光度为 0. 077, 5. 5 cm 波导管测得的吸光度 为 01187. 入射光在波导管内传播时, 损失很小, 允许的波导管长度可以长至 20 cm 以上, 但是波导管 过长会使试样体积的增大和检测时间的延长, 同时如将波导管弯曲会产生入射光的折射损失. F ig. 3CCD i age of Tef lon AF - coa ted fused- sil ica m cap il lary outlet F ig. 4 Record in gs of absorbance m ea surem en ts by del iver in g ( a l terna tely o- phenan throl i e- Fe n (A 1 ) and (A 2 ) : W ithout coating on the surface of the cap illary ) com plex solution and r in se solution in to 012; 2. 014; 3. 016; in let; (B 1 ) and (B 2 ) : w ith black pain t coating on the surface of the the f low- cel l cap illary in let end. 2. 3系统分析性能 参照文献 14 报道的实验条件, 采用邻菲啉2铁 ( ) 反应体系考察系统的分析性能. 实验中, 注 射泵流速为 260 nL s 在此流速附近得到的检测信号是一系列平台峰, 信号基线 ( 注射空白溶液时) 漂 . 移很小, 说明管中液流稳定, 两通道之间液流无相互干扰. 泵速过慢, 影响分析速度; 泵速过快, 通道 内阻力过大, 易在通道接口处发生渗漏 实验结果显示, 以 5. 5 cm 外覆 T eflon A F 液芯波导管作为检 . 测池时, 检测池内体积为 240 nL. 系统对邻菲啉2铁 ( ) 配合物检测的检测线性范围为 0. 03 50 o l L , 线性回归方程为 A = 0. 0188c + 0. 0023, R 2 = 0. 999 4, 其中 A 为吸光度, c 为 Fe2+ 的浓度 m ( o l L ). 图 4 为 012, 0. 4, 0. 6, 0. 8 和 1. 0 o l L Fe2+ 标准溶液进样的实际结果记录图 以 0. 8 . m m F ig. 5Com par ison of m ea surem en t resul ts by the new system and spectrophotom eter w ith 1 cm cel l F ig. 6Record in gs of absorbance m ea surem en ts for 60 nm ol L Fe2+ solution ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. c ( Fe2+ ) ( l ?L - 1 ) : 1. mo 4. 018; 5. 1. 0 N o. 4 杜文斌等:基于液芯波导原理的微流控芯片长光程光度检测系统 613 ach ieved on the ch ip by u sing an in tegrated liqu id co re w avegu ide (L CW ) silica cap illary coated w ith T eflon A F. T he perfo rm ance of the system w as tested by u sing o2 phenan th ro line2Fe ( ) com p lex as a m odel sam p le w ith spectropho tom etric detection, ach ieving a detection li it of 8 nm o l L fo r the com p lex. T he m 0. 0350 o l L is linear ( R 2 = 0. 999 4 ) and show ed good ab so rbance of sam p les ranging from m repeatab ility w ith a R SD of 0. 8% ( n = 5 ). T he sen sitivity of the ch ip 2 CW system w as a facto r of 1. 7 L . h igher than conven tional spectropho tom etry u sing a 1 cm cell T he p resen t system can be app lied in . con tinou s flow o r flow in jection analysis system s Keywords icroflu id ic ch ip; L iqu id co re w avegu ide; A b so rbance detection M ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. Abstract In th is w o rk, a system fo r h igh sen sitivity ab so rbance m easu rem en ts on m icroflu id ic ch ip s w as developed w ith a detection vo lum e of 240 nL. L ong op tical path 2length ( 1. 7 cm effective path length ) w as ( Ed. : A , G ) o l L Fe2+ 标准溶液连续重复进样, 响应信号的重现性为 0. 8% (R SD , n = 5). 图 5 对比了本芯片分 m 析系统与常规分光光度计 ( 1 cm 比色池) 对相同浓度标液 ( 2 10 o l L Fe2+ 浓度范围) 的测定结果. m 由图 5 可见, 检测池有效光程可达 1. 7 cm , 即 1 cm 液芯波导管吸收池的有效吸收光程为 0. 31 cm. 与 利用芯片通道 ( 深 30 ) 直接进行光度检测的方法相比, 有效光程提高了 560 倍 因此, 本方法可使 . m 2+ ( 3) 为 8 nm o l L , 图 6 为分 芯片上光度检测的灵敏度提高 2 3 个数量级. 分析系统对 Fe 的检出限 析系统对 60 nm o l L Fe2+ 测定结果记录图. 参考文献 1 anz A. , Graber N. , W idm er H. M. . Sen s A ctuato rs B J , 1990, B 1: 244248 . M J , 1999, 20 (2) : 221223 2 HU Q iu 2 uan ( 胡秋娈) , L I N a ( 李娜) , ZHAO Feng 2 in ( 赵凤林) et al. . Chem. J. Ch inese U n iversities ( 高等学校化学学报) L L 3 CH EN H uan 2 en ( 陈焕文) , XU Shu 2P ing ( 徐抒平) , YU A i2 in ( 于爱民) et al. . Chem. J. 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