（遗传学专业论文）人类新基因znf307的功能研究.pdf

摘要 细胞凋亡是生物生命活动过程中不可缺少的生理过程 细胞凋亡 是一个复杂的过程 受一系列基因的精确调控 研究发现 一旦调控 细胞凋亡的信号途径遭破坏 就会引起一系列的人类疾病包括癌症 研究细胞凋亡过程中起调控作用的基因和分子途径 将促进人们从分 子水平认识细胞凋亡和癌症发生的机制 p 5 3 和p 2 1 信号传导途径是 已知的与细胞凋亡有关的途径 为了研究调控细胞凋亡和癌症发生的 新基因 本研究分析了一个从心脏e d n a 文库中克隆出的人类新基因 z n f 3 0 7 0z n f 3 0 7 基因位于6 号染色体 n o r t h e r n 杂交结果表明在成 人的心脏 脑 胎盘 肺和肾组织中表达 而在1 7 周胚胎在肝 骨 骼肌 脑 心脏和小肠都有不同程度的表达 通过构建增强型绿色荧 光蛋白与z n f 3 0 7 融合基因的真核表达系统 转染c o s 7 细胞系 瞬 时表达后荧光显微镜观察了它编码蛋白的活细胞定位及表达 结果显 示e g f p z n f 3 0 7 融合蛋白在细胞核表达 且绿色荧光呈大小不等的 颗粒状 e g f p z n f 3 0 7 一d z n f 融合蛋白则在细胞质表达 而无s c a n 结 构域的e g f p z n f 3 0 7 一d s c a n 融合蛋白虽然仍然定位于细胞核 但绿 色荧光呈均匀分布 z n f 3 0 7 在c o s 7 细胞中过表达均能抑制转录因 子s r e p 5 3 和p 2 1 的转录活性 这说明z n f 3 0 7 蛋白可以在m a p k p 5 3 和p 2 1 信号途径中作为抑制因子介导细胞功能 在h e k 2 9 3 中进 行z n f 3 0 7 的r n a 干扰发现 沉默z n f 3 0 7 后 被z n f 3 0 7 抑制的p 5 3 和p 2 1 的转录活性上调了 进一步说明z n f 3 0 7 对p 5 3 和p 2 1 的转录 t 抑制作用 而通对z n f 3 0 7 各个结构域的转录活性分析发现 s c a n 和 k r a b 结构域能不同程度的抑制转录 关键词 p 5 3 p 2 1 m a p k z n f 3 0 7 r n a i s c a n k r a b u a b s t r a c t a p o p t o s i si s a ni n d i s p e n s a b l y p h y s i o l o g i c a lp r o c e s si n li f ea n dac o m p l e xp r o c e s sw h i c hi sr e g u l a t e db yas e r i e sg e n e s t h e r eh a v eb e e nr e p o r t e dt h a tm a n yd is e a s ei n c l u d i n gc a n c e rc a n b ei n d u c e di fs i g n a lp a t h w a y so fa p o p t o s i sa r ed e s t r o y e d t h e r e s e a r c ho fg e n ea n dm o l e c u l a rp a t h w a yi na p o p t o s i sp a t h w a y w i l l h e l pu n d e r s t a n dc e l la p o p t o s i sa n dm e c h a n i s mo fc a n c e r p 5 3a n dp 21sig n a lp a t h w a y sa r ek n o w np a t h w a y st h a ta r er e l a t e d t oa p o p t o s i s i no r d e rt os t u d yn o v e lg e n e st h a tr e g u l a t e a p o p t o s isa n dc a n c e r w ea n a l y sisan o v e lg e n ez n f 3 0 7t h a tis c l o n e df r o mah e a r tc d n al i b r a r y z n f 3 0 7m a p st oc h r o m o s o m e6 n o r t h e r nb l o ti n d i c a t e dt h a tt h ez n f 3 0 7g e n ei se x p r e s s e di n h e a r t b r a i n p l a c e n t a l u n ga n dk i d n e yi na d u l t a n di t is e x p r e s s e di nli v e r s k e l e t a lm u s c l e b r a i n h e a r ta n di n t e s t i n e i na d d i t i o n p e g f p z n f 3 0 7f u s i o nm a m m a i i a ne x p r e s s i o np r o t e i n w a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e di n t ot h ec o s 一7c el ls o b s e r v a ti o nu n d e rt h ef l u o r e s c e n tm ic r o s c o p ys h o w e dt h a t p e g f p z n f 3 0 7w a se x p r e s s e da n de x i s t e di nt h en u c l e a r a n d d i s p e r s e d i nd o tw i t h v a r i a b l es i z ei nt h en u c l e a r p e g f p z n f 3 0 7 d z n fw a se x p r e s s e da n de x i s t e di nt h ec y t o p l a s m l i i t h ef u s i o np r o t ei nw it h o u ts c a nb o xe g f p z n f 3 0 7 d s c a niss tii i e x i s t e di nt h en u c l e a ra n dd i s t r i b u t ee q u a l l y o v e r e x p r e s s i o n o fz n f 3 0 7i nt h ec o s 一7c e ll si n h i b i t st h et r a n s c r i p ti o n a l a c t i v i t i e so fs r e p 5 3a n dp 2 1 s u g g e s t i n gt h a tz n f 3 0 7i sa n e g a t i v er e g u l a t o ri nm a p ks i g n a li n gp a t h w a y i nh e k 一2 9 3 a f t e r sile n c ez n f 3 0 7 b yr n a i t h es u p p r e s s e dt r a n s c r i p ti o n a l a c t i v i t yo fp 5 3a n dp 2 1u p r e g u l a t e t h i sr e s u l tc o n f i r m st h a t z n f 3 0 7s u p p r e s st h et r a n s c r i p ti o n a la c t i v i t yo fp 5 3a n dp 2 1 w ea l s of i n dt h a ts c a na n dk i 认bm o t i fc a ns u p p r e s s t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yb yt r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y a n a l y s i s k e yw o r d s p 5 3 p 2 1 m a p k z n f 3 0 7 r n a i s c a n k r a b i v 目录 中文摘要 i 英文摘要 0 0 0000 第一章研究背景及文献综述 1 1 肿瘤发生 1 1 2 锌指蛋白 3 1 2 1 锌指蛋白基因家族 3 1 2 2 锌指蛋白基因的结构 0 00000000 6 1 2 3 与c 2 h 2 型锌指相关的结构域 7 1 2 4 锌指蛋白基因在细胞凋亡过程中的功能 1 1 1 3p 5 3 信号途径调控的研究 1 4 1 4 1p 5 3 的结构特点 1 4 1 4 2p 5 3 的上游事件 1 5 1 4 3p 5 3 的下游事件 对活性p 5 3 的应答 1 7 1 4p 2 1 信号途径的调控研究 2 2 1 4 1p 2 1 的发现 2 3 1 4 2p 2 1 的作用机制 2 3 1 4 3p 2 1 调节功能的研究 2 4 1 5m a p k 信号途径调控的研究 2 7 1 5 1m a p k 家族 2 7 1 5 2m a p k 的特异性激活机制 3 0 1 5 3m a p k 信号途径的功能 3 1 第二章新基因z n f 3 0 7 的功能分析 2 1 前言 3 5 2 2 材料与方法 4 6 2 2 1 材料 0 0 0 000 4 6 2 2 2 方法 4 9 2 3 结果与讨论 5 9 2 3 1z n f 3 0 7 蛋白的亚细胞定位分析 5 9 2 3 2z n f 3 0 7 蛋白的转录活性分析 6 3 2 3 3 本论文有待进一步研究的问题 7 7 结语 7 9 参考文献 0 00000 000000060 8 5 英文缩写词简表 附录攻读学位期间发表的学术论文 致谢 第一章研究背景及文献综述 1 1 肿瘤发生 人类基因组中有约3 0 0 0 0 个基因 其中有4 2 的基因尚不知道 功能 我们称之为新基因 发现并了解这些新基因的功能在生物学上 具有重要的意义 2 0 0 0 年世界癌症发病1 0 0 6 万人 死亡6 2 1 万人 癌症的发生涉及很多基因 现在已经发现一些基因参与癌症的发生 但是这一过程仍不清楚 因此 完善癌症相关信号途径具有十分重要 的意义 肿瘤的发生都是由于一些肿瘤相关基因的改变而产生 为了使癌 变细胞能逃避机体免疫机制的控制 最终发展成肿瘤 通常需要积聚 5 9 次基因改变 这些基因的改变通常发生于细胞发育 细胞增殖 细胞分化 细胞存活 细胞休止以及遗传学修复有关的基因中 其中 一些涉及细胞生长正调节的基因通常称之为癌基因 而涉及细胞负调 节的基因则称之为抑癌基因 一旦癌基因与抑癌基因之间的平衡被打 破 控制细胞增殖的癌基因持续或过高表达 同时抑癌基因不表达或 失活 会导致各种人类肿瘤的形成和发展 常见的抗癌基因有p 5 3 p 2 1 等 其中p 5 3 基因最受瞩目 这是因为在人类恶性肿瘤中至少有 5 0 发生了p 5 3 基因的变化 对于肿瘤治疗 大多数化疗和放疗手段均是通过诱导肿瘤细胞凋 亡机制进行 许多肿瘤内在地抵抗化疗可能与其不能激活其细胞凋亡 机制有关 现有的研究表明 在肿瘤的发生和对化疗的耐受过程中 有几种 蛋白参与对肿瘤凋亡的抑制 其中p 5 3 肿瘤抑制基因的突变不仅与许 多肿瘤的不良预后有关 而且与肿瘤化疗和放疗产生耐受及肿瘤复发 有关n 5 l 已经证实b c l 一2 和b c l x l 原癌基因可使肿瘤细胞对大多数 化疗药物产生耐受阳 1 引 这样的药物诱导细胞凋亡或下调 b c l 2 b c l x l 将对癌症治疗非常有用 从t n f 相关细胞凋亡诱导配体 t n f r e l a t e da p o p t o s i s i n d u c i n gl i g a n d t r a i l 的发现以来 大量研究表明 肿瘤细胞 较正常细胞对t r a i l 诱导的细胞凋亡更具易感性n 劓 t r a i l 是一种细 胞毒性蛋白 其可诱导许多转化细胞凋亡但不影响正常细胞和组织 即使t r a i l 的死亡域包含的受体 d 甩 t r a i lr 或d r t r a i lr 通 常可在正常与转化细胞两种细胞上表达 最近资料表明 正常细胞而 不是转化细胞含至少一种假靶受体 d e c o yr e c e p t o r t r i d d c r t r u n d d d c r n 可与t r a i l 结合并减弱t r a i l 的诱导效应 而且 t r a i l 可介导多种血液系统的肿瘤细胞凋亡 这样 通过很好研究 t r a i l 和t r a i l 受体可对选择性杀伤肿瘤细胞提供新的途径 很显然 同一基因缺陷可促使肿瘤细胞的生长与存活 同时也可以增加肿瘤对 各种抗原治疗的耐受性 加强细胞凋亡分子机制的研究将为揭示更多 更有用和潜在的靶向抗癌治疗并能对肿瘤细胞进行选择与特异性的 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 凋亡诱导 1 2 锌指蛋白 1 2 1 锌指蛋白基因家族 d na 结合蛋白在生物体内有着重要的功能 在染色体复制 转 录 基因激活和dna 修复中发挥作用 其中具备转录作用的dna 结合蛋白称为转录因子 它们往往具有结合dna 的特定的基序 如 螺旋一转折一螺旋 h e l i xt u r nh e l i x 螺旋一环一螺旋 h e l i xl o o p h e li x 和锌指 z i n cf i n g e r 等 而锌指蛋白 z i n cf i n g e rp r o t e i n z fp 是真核细胞中最普遍存在的一类dn a 结合蛋白n 根据这 些zfp 锌指结构上的特征 可以将锌指蛋白分为6 个类别 1 c2 h 2 型 2 c2 2 型 3 c4 型 4 c6 型 5 指环型 r i n g f i n g e r s 6 l i m 型 吨叫 c2 h 2 型锌指蛋白含有最为典型的锌指模体结构 一般由2 8 一 3 0 个氨基酸构成 其基本序列为 cx cx fx lx hx h 其 中x 为任意氨基酸 相邻的锌指模体间的序列往往都是保守的ch 连接肽 h cl ink tgekpy k 不同的锌指蛋白中所含有 的锌指模体的数目相差很大 从1 个到3 7 个不等 c2h2 型zf p 构成最大的转录因子家族 在人类基因组中其编码基因约含有70o 个心1 2 引 c2h2 型锌指蛋白中的锌指模体以线性重复的排列方式 存在于蛋白质的c 末端 然而除了锌指模体外 1 3 的c2h2 型锌指 蛋白的n 末端有7 5 个氨基酸高度保守 被命名为k r t l p p e l 相关性保守 盒 k r u p p e la s s o c i a t e db o x e s 简称k r a b 心叫 k r a b 往往含有两个 相连的保守区k r a b a 和k r a b b 但也有锌指蛋白仅含有k r a b a 没有 k r a b b 目前研究表明 k r a b 特别是k r a b a 具有和其他因子相互作用 而介导转录抑制的功能 其余2 3 的c2 h 2 型锌指蛋白n 末端可能 存在一些其他的高度保守区域 如指形相关盒 f i n g e ra s s o c i a t e d b o x e s f a x f a r f i n g e ra s s o c i a t e dr e p e a t s z i n z i n cf i n g e r n t e r m i n a lm o t i f 痘病毒锌指 p o xv i r u sz i n cf i n g e r p o z s c a n l e r 取4 个典型的含有此保守区域的基因s r e z b p c t f i n 5 1 a w i 和z n f 2 0 的首字母命名 b t b 取3 个典型的含有 此保守区域的基因的首字母命名 2 3 2 s 但这些保守区的功能都尚未 完全明确 c2h 2 型锌指蛋白家族很大 它包括7 0 0 个以上的不同 成员 c2h2 型锌指结构域是真核生物中最普遍的d n a 结合 序列 也是人类基因组中编码得第二多的蛋白结构域 人类 基因大概有3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 个 其中有大约2 的基因编 码的是c2h2 型锌指结构基因 这说明c2h2 型转录因子 代表了人类基因组中一个重要而且多样的部分心引 很多含有c2h2 型锌指结构的转录因子在生物发育过 程中充当持家基因或调节因子的角色 也有很多c2h2 型锌 指蛋白在人类早期胚胎发育过程中起着重要的作用 并且与 细胞凋亡的发生有关口 3 5 1 据报道 z a c 是一个c 2 h 2 型锌指 蛋白 它通过d n a 结合和转录激活调控凋亡和细胞周期捕及 4 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 在肿瘤发生和对有丝分裂活化的应答中 z a c 基因表达以甲 基化敏感的形式下调 引 另外 z a s 也是c 2 h 2 型锌指 它联 合t n f 受体相关因子抑制n f k a p p a b 和j n k s a p k 介导的t n f q 信号 这些数据表明z a s 在控制细胞生长 凋亡和发炎是非常重要 的跚 c s h c t 锌指结构域也称为环指结构域 r i n gf i n g e r 是l o v e r i n g 等于1 9 9 4 定义的一种蛋白结构域 首先在人的r i n g 基因中得到描 述 胡 随后陆续在病毒 酵母 动植物蛋白中被发现 具有各种功能 如肿瘤形成 信号传导 过氧化物酶的产生 病毒感染 发育 转录 调节以及泛蛋白化等 7 3 钔 富含半胱氨酸 由4 0 一6 0 个氨基酸残基 构成 它能结合两个锌离子 锌离子被4 个半胱氨酸或3 个半胱氨酸 及 1个组氨酸四分子螯合 它的通式为 c 2 2 c x 9 3 9 c x 1 3 h 从2 3 c 2 2 c x 4 4 8 c 2 2 c 其中x 为任意 氨基酸 可表示为c 3 h c 4 其中的半胱氨酸和组氨酸高度保守 c 3 h 和c 4 分别结合一个锌离子 形成对称的空间结构 在环指结构中两 个锌离子结合域之间的距离很近 空间上不能形成两个独立的锌指结 构 而是以一个整体与d n a 或其它蛋白质结合 它不同于其他的锌指 蛋白 这种区域在结合2 个锌离子的保守范围内显示出独特的跨膜排 列口9 删 环指有两种变异 一种是出现于t r a f 4 和t r a f 5 的c 3 h c 3 d 序列 即基序的最后一个半胱氨酸由天门冬氨酸代替 由于天门冬氨 酸也可以与锌离子结合 所以这种替换不影响环指空间结构的形成 另外一种变异c 2 t h c 4 出现在p 5 3 相关癌蛋白m d m 2 环指家族的成员 主要是一些核内调节蛋白 参与基因转录调控 d n a 修复和重组 细 胞转化 肿瘤抑制 m d m 2 就是环指家族的成员参与细胞凋亡的一个 典型例子 有报道m d m 2 的环锌指在行使t g f b 的抵抗作用时有重要 的作用 4 u 1 2 2 锌指蛋白基因的结构 遗传信息的实现过程离不开基因表达的调控 至今为止发现的转 录调控因子中有很多含有锌指模体 z i n cf i n g e rm o t i f 结构 锌指 蛋白是指含有通过结合zn2 稳定的短的可以自我折叠形成 手指 结构的一类蛋白质 由于其自身的结构特点 可以选择性的结合特异 的靶结构 使锌指蛋白在基因的表达调控 细胞分化 胚胎发育等生 命过程中发挥重要作用 锌指结构最早由m i l l e r 等在1 9 8 5 年发现的 他们发现在非洲爪蟾转录因子t f i i i a 分子中含有7 1 1 个锌原子和9 个重复单位 每个重复单位约有3 0 个氨基酸残基h 剔 t f iii a 锌指序 列为c y s 一 x a a 2 4 一c y s 一 x a a 一p h e 一 x a a 一l e u 一 x a a 2 一h i s 一 x a a 3 h i x a a 代表非保守氨基酸 构成一个调节识别 结构域 此类锌指为c 2 h 2 型 即锌原子与2 个保守的c y s 和两个保 守的h i s 残基形成配位键 其中1 个芳香族氨基酸和1 个l e u 残基高 度保守 此后 人们发现多种蛋白质序列中也存在这种结合锌的结构 并将此结构命名为锌指 生物体中 基因转录调控因子发挥作用时 主要有4 种空间模式 螺旋一转角一螺旋 h e l i x t u r n h e l i x h t h 碱性一亮氨酸拉链 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 b a si cl e u c i n ez i p p e r b z i p 锌指 z i n cf i n g e r 和螺旋一 环一螺旋 h e li x l o o p h e li x h l h 在细胞分化和发育中 这 些结构域参与结合到同源d n a 识别位点 激活或抑制基因的表达 而 锌指蛋白是在真核生物中最普通存在的一类核酸结合蛋白 目前为止 已在5 6 0 多种蛋白中发现了4 1 0 0 多种不同的锌指序列 使得锌指元件 成为dna 结合蛋白中最庞大的一个家族h 3 人类基因组上有如此之 多的锌指蛋白 其原因可能有几点 第一 锌指蛋白独特的作用分子 结构 包括锌指和锌指之间 锌指和与它相连的框之间 第二 锌指 中的氨基酸残基赋予了其结构识别序列的特异性m 朝 第三 它们翻 译的蛋白质对转录抑制的方式也决定了其数目的巨大 锌指类结构根 据锌的配位和结构域的性质可分为锌指 z i n cf i n g e r 锌纽 z i n c t w i s t 锌带 z i n cr i b b o n 和锌簇 z i n cc l u s t e r 它们的特征氨基 酸序列 中心金属配位性质 结构域构象以及与dna 作用的方式均 有所不同 1 2 3 与c 2 h 2 型锌指相关的结构域 一些k r u p p l e 型锌指蛋白的氨基端包含有多种高度保守的 结构域 这些结构域通过调控转录因子与转录因子之间或者与 其他的细胞成分相互作用从而调控亚细胞定位 d n a 结合和基因 表达 如p o z p o x v i r u sa n dz i n cf i n g e r h 引 又称为b t b b r o a d c o m p l e x t r a m t r a c k a n db r i c a b r a c k r a b k r u p p e 卜a s s o c i a t e db o x f a x 和s c a n 或l e r 硕士学位论文 这些结构域在转录调控过程中起不同的作用 1 2 3 1p o z 结构域 p o z 结构域由12 0 个氨基酸组成 是进化上保守的蛋白质一 蛋白质相互作用结构域 在含有c h 锌指的蛋白质的氨基端 大约5 1 0 含有该结构域h 引 拥有p o z 结构域的蛋白质分子多 数为转录因子 这些转录因子可通过p o z 结构域形成高度紧密 扭曲结合的同源二聚体 这个同源二聚体有一个较大的疏水表 面 每个单体有1 4 的表面用于二聚体的分子间作用 这种构 象特别适合于同源二聚体的形成 二聚体的表面是由保守氨基 酸残基构成的沟 用于和其它蛋白质分子作用h 5 1 3 在 p l z f p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i az i n cf i n g e r 蛋白中 p l z f 可 通过该结构域形成同源二聚体 其中心架构是一组q 螺旋 而 分子的头尾由短的1 3 折叠封住临引 p o z 结构域可以和组蛋白去 乙酰化酶复合体作用从而发挥转录抑制活性 在急性早幼粒细 胞白血病 a p l 中由t 11 17 染色体易位引起的p l z f r a rq 蛋 白 不但形成同源二聚体 还可以通过p o z 结构域与 p m l p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a 蛋白形成异源二聚体 影响p m l 的正常亚细胞定位陷3 5 引 在b c l 一6 蛋白中 其氨基端的p o z 结 构域可以和共抑制因子n c o r n u c l e a rr e c e p t o rc o r e p r e s s o r 或s m r t s il e n c i n g m e d i a t o ro fr e t i n o i da n d t h y r o i d r e c e p t o r 作用 体外研究发现来自不同蛋白质的p o z 结构域 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 包括p l z f 以及一种疫苗病毒蛋白 均可以和n c o r 及s m r t 发 生亲和力不同的作用汹喝 1 2 3 2k r a b 结构域 在脊椎动物中大约有1 3 的c 2 h 2 型锌指蛋白含有 k r a b k r t l p p l e a s s o cia te d 框 k r a b 框参与了蛋白质与蛋 白质之间的相互作用 k r a b 框大约由7 5 个氨基酸残基构成 该结构域富含带电残基 一般由两个外显子编码而成 分为a 和b 两个亚框 可形成两个仅一螺旋 k r a b 框的a 框和b 框被 不同长度的片断分隔开 很多的k r a b 蛋白只有a 框h 引 当k r a b a 框单独结合到d n a 上时 它是一个强的转录抑制因子 而 k r a b b 框则没有这种功能 不过当k r a b a 框和k r a b b 框同时 存在时 k r a b b 框可以增强k r a b a 框的转录抑制效应 k r a b 框可以形成一个双极性螺旋 此螺旋可以介导转录因子或其 他细胞蛋白成分的相互作用 基因失活 s i l e n c i n g 需要k r a b 框结合到k a p 1 t i f l 一 b 抑制子的r b c c 框上 在k a p 1 结合到异染色质蛋白h p l 上时 与k r a b 型锌指蛋白结合的靶基因可能失活并进入异染色质 在 人类基因组中 k r a b 型锌指蛋白很可能是最大的转录因子基因 家族之一陷引 尽管k r a b 型锌指蛋白的功能还不很了解 但它们 在细胞分化和发育中起重要作用 硕士学位论文 1 2 3 3s c a n 结构域 s c a n l e r 框是在c2h2 型锌指蛋白家族中发现的一段保守单 元 一般出现在核苷酸的n 端 该结构域因为其富含亮氨酸也叫l e r 框 s c a n l e r 框是以最早发现的具有该同源框的前四个蛋白质 s r e z b p c t f i n 5 1 a 胪1 z n f l 7 4 和n u m b e r1 8e d n a 或者z n f 2 0 的第一个字母而命名的陌引 s c a n l e r 框富含亮氨酸 氨基酸序列 分析预测整个结构域分成三段 每段都预示着将形成一个a 一 螺旋 叫 而q 一螺旋可能参与蛋白与蛋白之间的相互作用 且 s c a n l e r 框富含氢键 在其核心的l x 6 l 结构有多个负电残 基 核心的侧面围绕有a e l m h 和c 等残基 这些残基 经常在q 一螺旋中发现 s c a n l e r 框还包含较多的谷氨酸残 基 表明它是一个带负电的酸性结构 这往往是转录因子的一 个共同特点 目前为止 在脊椎动物中发现大约有6 0 几个基因具有 s c a n l e r 框 如z n f l7 4 碰 萨只f p m 3 1 5 z n f 2 1 3 和z n f 3 2 3 等等 文献表明 只有在脊椎动物才具有s c a n l e r 框的基因 特别是在哺 乳动物中所含此类基因的比较多 s c a n l e r 全长大约有8 0 个残基 并且其中氨基酸的三分之二都高度保守 一般都有8 0 一1 0 0 的一 致 s c a n l e r 框的功能到目前为止还不是很清楚 通过对蛋白质的 结构进行分析 猜测s c a n l e r 框可形成2 到3 个仅螺旋 可能参与 了蛋白质之间的相互作用晦引 w i l l i a m s 等将s c a n l e r 框重组进入 g a l 4 的d n a 结合结构域 发现s c a n l e r 框没有将d n a 结合的转录活 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 性或转录抑制作用 表明s c a n l e r 框不是一个单独能进行转录调控 的结构域 t a r al 等则认为s c a n l e r 框有可能是共转录调控结构单 元 根据s c a n l e r 框亚家族的结构不同 可以把s c a n l e r 框分成 四种类型 大多数s c a n l e r 框亚家族的成员在c 端都有一个或多个 c2h 2 型锌指结构 s c a n l e r 一 c h 如锌指蛋白z n f i 膨5 引 m z f i b n 1 3 3 和z j p r o i 及本实验室扩增出的新基因z n f 3 2 j 6 剔 第二种是指仅仅具有单独的一个s c a n l e r 框的一类蛋白 包括小鼠 中的p g c f f 4 5 6 们 第三种是指不仅具有c2 h 2 型锌指结构 在其n 端还有一个k r a b 框的锌指蛋白 即为s c a n l e r 一k r a b 一 c2h2 x x 意为数目不等的c2h 2 型锌指结构 如人类锌指蛋白z n f 2 0 眵6 4 3 和 z n f 3 9 4 都为该类型 最后一种为k r a b s c a n l e r 一k r a b 一 c2h 2 型 这种锌指蛋白的类型比较少 代表是小鼠中的彻 6 引 s c a n l e r 框是最近在c2h2 型锌指蛋白中发现的一类 亚家族 目前对它的结构功能还不是很清楚 与k r a b 框不 同的是 在这6 0 几个s c a n l e r 框基因中发现只有鼠类和人 类具有s c a n l e r 框 果蝇和线虫中还没有发现s c a n l e r 框 了解该同源框有可能对生物中脊椎动物的发育及调控有 着重要的作用 1 2 4 锌指蛋白基因在细胞凋亡过程中的功能 细胞凋亡是一个非常复杂的过程 需要精确的表达调控 任何调 硕士学位论文 控的缺陷都会导致发育的缺陷 造成很多疾病 如癌症 精确的表达 调控分几个方面 转录水平的调控 转录后调控 翻译水平的调控和 翻译后调控等 而其中转录水平的调控是很重要的一部分 转录调 控因子通过介导d n a 和蛋白质的相互作用而控制转录 有一 类重要的转录调控因子是d n a 结合蛋白 d n a 结合蛋白有广 泛的活性 它最重要的功能是调节基因组的表达 所有的d n a 结合蛋白都有一个共同点 即它们与d n a 相结合 而蛋白质 与d n a 的结合只有有限的几种方式 包括螺旋一转角一螺旋 亮氨酸拉链 锌指蛋白和b 带 而锌指蛋白是真核生物中最 普遍存在的一类d n a 结合蛋白 锌指结构是很多转录因子用 来接触d n a 的一种结构 很多属于锌指蛋白家族成员是重要的细胞调控因子 这 些锌指蛋白基因家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用 包 括p l z f s lu g 和f a z f 等 p l z f t h ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i az i n cf i n g e r 影响骨髓细 胞的生长 分化和凋亡 引 s l u g 是一个锌指转录抑制子 它具有抗 凋亡的功能哺 f a z f 是b t b p o z 转录抑制蛋白家族的成员 同样也 影响凋亡汹1 上述几类锌指蛋白在细胞凋亡过程中有重要调节作用 锌指蛋白 与d n a 的作用机制还没有完全揭示出来 但一般认为它们的基因调节 功能的作用机制是通过识别并结合于某基因上特定的d n a 序列 启动 或激活该基因的转录而实现的 也有观点认为锌指蛋白是以脱锌的形 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 式夺取结合于d n a 特定结构域的z n 2 离子 并结合于该部位 从而引 起d n a 构型变化及激活基因的转录 目前尚无确凿的证据证明何种结 合机理正确 但有一点是公认的 即大多数锌指蛋白是通过与d n a 结 合来发挥其生物功能的 含有锌指元件的蛋白都会以一种序列特异 性的方式与dna 相互作用 通常情况下锌指与dna 作用是通过q 螺旋伸入dna 的大槽 实现的 其仪螺旋以外的其它部分氨基酸序列与d n a 磷酸骨架的接触 锌指之间的连接序列以及dna 的结构 尤其是局部构象 如扭曲等 都与识别作用有关 序列依赖的dna 构象对特异性识别有影响 尤 其是对两者结合的亲和力有较大作用 有时锌指蛋白与dna 的结 合 会明显改变dna 的结构 使之发生一定的弯曲 这样 大槽变 得更适于锌指的结合 连接相邻锌指的连接序列对于识别特异性虽然 贡献不大 但是由于它具有很好的可变性 柔韧性 在使单独锌指以 正确的方向与dna 的大槽结合以及保持一个完整 合适的包装间隔 方面发挥了作用 在一个多指蛋白中 单个锌指的识别特异性可能还受其所在位置 的影响 而同一锌指内部 氨基酸之间的作用可能也会间接地影响氨 基酸一碱基间的特异性的识别 另外即便对于同一个蛋白 在其识别 位点中不同碱基对于特异性识别的影响也不同 而且 锌指蛋白具有 相当的可塑性 同一个锌指蛋白可识别一套不同的 相关的dna 序 列 但锌指蛋白对特定顺式调节性dna 元件序列的改变却具有相当 的稳定性 不同的锌指又可识别同一序列 但亲和性不同 们 此外 硕士学位论文 锌指蛋白中锌的地位是不可替代的 只有锌指蛋白才具有选择结合核 酸的能力 脱锌或用f e c u m n c o n i 等金属离子置换锌离子都 将可能导致锌指蛋白丧失其功能 这可能与锌在生物条件下缺乏氧化 还原性有关 总的来讲 有关锌指蛋白的作用机制虽然进行了相当深 入的研究 但是还是有许多问题没有得到解决 例如锌指的核酸识别 涉及特异性和亲和性两方面 而目前的研究工作还仅仅集中在特异性 方面 对亲和性研究甚少 但事实上只有特异性和亲和性之间达到一 种平衡 锌指蛋白才能够在体内有效发挥作用 此外 锌指与d n a 结 合的动态变化过程以及作用特点等等都有待于进一步研究 1 3p 5 3 信号途径调控的研究 1 3 1p 5 3 的结构特点 p 5 3 蛋白是一个转录调节因子 现已知有6 或7 个基因的转录受 其促进 如p 2 1 m d m 2 b a x 等 而在细胞中至少这些基因中的部分 使得p 5 3 依赖的功能得以实现 人类p 5 3 蛋白含3 9 3 个氨基酸 结构 和功能上分为4 个区 n 末端的前4 2 个氨基酸构成转录活化区 这 个区以基本转录机制正性调节基因的表达 其中氨基酸1 2 2 3 在不同 物种中是相同的 体内试验表明p 5 3 蛋白链中氨基酸f 1 9 l 2 2 和 w 2 3 口0 7 对转录活化作用是必须的 这几个氨基酸在体外与t a t a 结合 因子t a f 7 0 和t a f 3 1 这两个t a d 的亚基结合 p 5 3 的转录活化作 用可被腺病毒e 1 b 5 5 k d 蛋白和人类m d m 2 蛋白结合抑制口2 7 副 p 5 3 蛋 白上的第2 2 和2 3 氨基酸残基在对e 1 b 5 5 k d 或m d m 2 的结合中起了关 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 键作用 以上结果都清楚的表明p 5 3 利用其n 末端的亲水界面发挥其 细胞转录调节作用以及与对其进行负性调节的蛋白相互作用 p 5 3 的 d n a 专一序列结合活性必须的z n 离子 在这个结构域内有4 条链状 的折叠和5 条反向平行的1 3 折叠结构 紧跟着是一个由两个q 螺旋形 成的支架结构 这个结构直接与d n a 相互作用 p 5 3 以四聚体的形式 结合一段由四个5 p u p u c a t 3 重复序列组成的d n a 这四个重复 序列的排列方式是两对两个反式重复形成样的结构 p 5 3 上k 1 2 0 r 2 4 1 r 2 7 3 c 2 7 6 和r 2 8 3 与d n a 磷酸骨干的主槽相接 同时k 1 2 0 c 2 7 7 和r 2 8 0 通过氢键与d n a 碱基相互作用 而r 2 4 8 通过多重氢键 与d n a 螺旋的次槽相接 p 5 3 中9 0 以上的无义突变发生在d n a 专一 序列结合区 这些突变分为两类 第一类突变发生在能导致不能与 d n a 结合并失去转录因子功能的氨基酸残基上 如r 2 4 8 和r 2 7 3 的突 变为最常见的基团改变口4 7 引 第二类突变破坏p 5 3 三维结构中组成支 架结构的螺旋和折叠基础 这种结构性的突变改变了p 5 3 蛋白的构 象 从而产生一种新的蛋白形式 如种突变产生的蛋白新形式能与单 抗p a b 2 4 0 反应 而野生型的蛋白结构中抗原的表位 残基2 1 2 2 2 1 不能结合这种单抗豳 4 0 以上的无意突变发生在基团r 1 7 5 g 2 4 5 r 2 4 8 r 2 4 9 r 2 7 3 和r 2 8 2 训 这些基团对其o n a 结合功能区的结构 完整性起重要作用 1 3 2p 5 3 的上游事件 通常p 5 3 蛋白在细胞内迅速降解 t 2 约为3 0 分钟 因而其蛋 硕士学位论文 白浓度很低 是否蛋白酶对此起作用还不是很清楚 但一些证据表明 其降解可能是泛素 u b i q u i t i n 一依赖的蛋白水解作用发挥了作用 8 t 8 3 另外有些细胞中p 5 3 也可能以不具转录因子活性的休眠形式存 在 这种情况下 p 5 3 必须接到上游的一个信号或产生变化被激活后 才具有功能 上游事件或信号传到p 5 3 是几种应激情况介导的 它们 是几种类型的d n a 损伤包括y 射线照射引起的d n a 双链断裂和紫外线 照射后d n a 修复中间物的存在或化学试剂对d n a 的损伤 都能导致细 胞中p 5 3 水平的迅速增高和作为转录因子的激活随4 埘1 p 5 3 水平的增 高可能是由于蛋白的半衰期延长 也可能是由于细胞中p 5 3 的m r n a 转录的速率提高 p 5 3 水平的增高是与d n a 损伤的程度成比例的 但 p 5 3 水平增高的程度和增高的动力学因不同类型的辐射损伤而有所不 同 细胞使用不同的功能和蛋白识别不同的类别的d n a 损伤并用不同 的酶系统来修复它们 细胞中识别d n a 损伤的蛋白可能与p 5 3 交流并 激活它 例如 缺失了a t m 基因的体外培养细胞对等离子辐射只有一 个延迟和减弱的p 5 3 应答 表明a t m 可能是识别d n a 损伤并包含蛋白 激酶功能区的蛋白 它可将d n a 受到损伤的信号传递给p 5 3 另外 当三磷酸核苷储备下降到一个阈值以下时 第三种激活 p 5 3 蛋白的信号就产生了陷8 l 显然细胞需要一个正常的三磷酸核苷储 备水平以维持d n a 复制和细胞周期的正常进行 这一过程受到监督并 随时报告给p 5 3 但这一途径和所涉及的蛋白还不清楚 还有报道指 出 识别出生缺陷以应答致畸胎剂是p 5 3 的另一个可能的作用 例如 在m d m 2 这个p 5 3 负调节因子不存在的情况下 小鼠胚胎以p 5 3 依赖 人类新基因z n f 3 0 7 的功能研究 的方式在刚着床后即流产 也许着床可启动应激信号 p 5 3 对其作出 应答而m d m 2 则对p 5 3 的作用作出适当的调节 另外p 5 3 还对自身的转录活性有负调节作用 这是通过诱导m d m 2 基因表达构成一个负反馈圈来完成的嘲1 虽然p 5 3 对于正常的有丝分 裂和减数分裂周期来说并不是必须的 但p 5 3 蛋白的活性和稳定性总 是以细胞周期相关的方式而变化 1 3 3p 5 3 的下游事件 对活性p 5 3 的应答 1 3 3 1p 53 对细胞周期的调节 p 1 6 一c y c l i nd 1 一c d k 4 r b 途径是细胞由g 1 过渡到s 期的调节点 也是理解人类癌症发生的关键环节 最近在每种癌症的检查中发现这 四个基因中至少总有一个发生改变或突变 p 1 6 是c y c l i nd l c d k 4 的一个负性调节因子 这个基因在有些癌症中处于关闭状态 严重甲 基化 在有些癌症中是突变的 c y c l i nd 1 在许多癌症中 约1 6 的乳腺癌 基因扩增和过表达 c d k 4 基因突变 不再对p 1 6 敏感 和扩增在一些肿瘤中已有所发现 r b 是c y c li nd l c d k 4 调节细胞周 期的主要作用靶子 r b 在许多肿瘤如小细胞肺癌和骨癌中以突变形 式存在 r b 蛋白调节e 2 f d p 转录因子复合体 e 2 f 1 2 3 和d p 一1 一2 一3 9 0 9 1 1 这些转录因子进而又调节细胞周期s 期起始和继续所 必需的基因 包括编码c y c l i ne c y c l i na 二氢叶酸还原酶和细 胞增殖核抗原p c n a c y c l i nd 1 一c d k 4 将r b 磷酸化 使e 2 f d p 蛋白 从与r b 的复合体中释放出来 促进细胞周期进行所需基因的转录 r b 作为细胞周期 继续进行 的信号去调节细胞周期的限制点或起 始点 细胞周期对不同的外源生长因子的作用通过以上组分的调节变 得很敏感 对某些d n a 损伤的应答 p 5 3 被激活去影响其下游一个称 为p 2 1 基因的转录四引 p 2 1 可与c y c l i nd 1 一c d k 4 c y c l i ne c d k 2 和 c y c li na c d c 2 这些c y c li n s c d k s 复合体结合嘞删 每个复合体结合 一个分子的p 2 1 并不影响激酶的活性 当每个复合体结合两个分子的 p 2 1 并不影