（外科学专业论文）前列腺癌中nfκb、cox2和vegf的表达及意义的实验研究.pdf

弋8 【：【i l 1 目录 中文摘要1 英文摘要一3 研究论文前列腺癌中n f kb 、c o x - 2 和v e g f 的表达及意义的 实验研究 前言6丹l j 舌 材料与方法一9 结果1 3 附图”1 4 附表16 讨 念18 结论2 5 参考文献2 5 综述核转录因子kb 在前列腺癌中的研究进展3 2 致谢4 0 个人简历“4 1 中文摘要 前列腺癌中n f k b 、c o x 2 和v e g f 的表达及意义的实验研究 摘要 目的：检测核转录因子1 出( n f 心) 、环氧化酶2 ( c o x 2 ) 和血 管内皮生长因子( v e g f ) 在前列腺癌及良性前列腺增生组织中的表达， 并分析其相关性、临床病理特征关系及愈后情况，探讨在前列腺癌的发生 发展过程中可能存在的信号传导调控机制。 方法：收集河北大学医学院附属医院和河北省保定市解放军2 5 2 医院 2 0 0 0 年1 月- - - 2 0 0 7 年1 2 月收治的前列腺癌患者的经会阴穿刺标本4 7 例。 并选择同期收治的前列腺增生患者的经尿道前列腺汽化电切标本2 0 例。 采用免疫组织化学方法检测，n f r , b p 6 5 、c o x 2 和v e g f 在前列腺癌组 织和良性前列腺增生组织中的表达。 结果：n f 1 c b 、c o x 2 和v e g f 在前列腺癌组织中的表达阳性率分 别为5 9 5 7 、5 5 3 2 和8 2 9 8 ，和前列腺增生组织中表达差异具有统计 学显著性( p o 0 5 ) 。n f r , b p 6 5 和c o x 2 的表达分别同v e g f 表达呈显 著正相关( p 均 o 0 5 ) 。 1n f r , _ b p 6 5 在前列腺增生组织和前列腺癌组织中的表达及临床病 理特征：n f r , b p 6 5 表达主要定位于前列腺上皮细胞核内，呈棕黄色至棕 褐色颗粒。2 0 例前列腺增生组织中仅5 例呈阳性表达，阳性率仅为 2 5 o o ，而4 7 例前列腺癌组织中2 8 例标本呈阳性表达，并以中强阳性 为主，阳性率为5 9 5 7 。两者差异有显著意义( 穿= 6 7 1 0 ，p = - 0 0 1 0 ) 。p c a 患者中n f r , r b p 6 5 的阳性表达率与前列腺癌组织分化程度无显著相关性 舻- 0 0 3 4 ，p = 0 8 0 3 ) 。 2c o x 2 在前列腺增生组织和前列腺癌组织中的表达及临床病理 特征：c o x 2 蛋白的表达主要定位于前列腺上皮细胞浆，2 0 例前列腺增 生组织中仅3 例呈阳性表达，阳性率仅为1 5 0 0 ，而4 7 例前列腺癌组织 中2 6 例标本呈阳性表达，并以中强阳性为主，阳性率为5 5 3 2 。两者差 异有显著意义( 穿= 9 2 9 1 ，p = 0 0 0 2 ) 。p c a 患者中n f 1 ( b p 6 5 的阳性表达 率与前列腺癌组织分化程度无显著相关性( f 0 11 0 ，p = - 0 4 1 2 ) 。 中文摘要 3v e g f 在前列腺增生组织和前列腺癌组织中的表达及临床病理特 征：v e g f 蛋白的表达主要定位于前列腺上皮细胞浆，2 0 例前列腺增生 组织中仅4 例呈阳性表达，阳性率仅为2 0 0 0 ，而4 7 例前列腺癌组织中 3 9 例标本呈阳性表达，并以中强阳性为主，阳性率为8 2 9 8 。两者差异 有显著意义( 穿- 2 3 6 1 2 ，p = 0 0 0 0 ) 。p c a 患者中n f r , _ b p 6 5 的阳性表达率 与前列腺癌组织分化程度无显著相关性( f 0 0 0 8 ，p = - 0 9 5 4 ) 。 4n f 1 c b p 6 5 和c o x 2 、v e g f 在p c a 中表达的相关性：统计结果 显示n f r , b p 6 5 ( r = 0 2 7 0 ，p = 0 0 4 3 ) 、c o x 2 ( r = 0 2 9 5 ，p = 0 0 2 5 ) 的表达水平 与v e g f 表达水平具有高度相关性，而c o x 2 和n f 1 ：b p 6 5 的表达则无 相关性( f 一0 1 4 6 ，p = 0 2 7 5 ) 。 结论：1n f 心、c o x 2 和v e g f 在前列腺癌中的表达明显高于良 性前列腺增生，三者在前列腺癌发生发展全程中起重要作用。 2n f r , b 和c o x 2 的表达水平分别与v e g f 的表达水平呈正相关， n f 。r , b 是c o x 2 和v e g f 表达的重要调控因素之一，同时c o x 一2 和 v e g f 表达之间具有显著相关性。 3n f 心的异常表达与前列腺癌的生物学行为密切相关，可能通过 c o x 2 和v e g f 途径促进肿瘤血管新生在前列腺癌的发生发展过程中发 挥重要作用。 关键词：前列腺肿瘤；核转录因子1 ；环氧化酶2 ；血管内皮细胞 生长因子 英文摘要 t h e s t u d yo ft h ee x p r e s s i o no fn f - k b ，c o x 一2 ，a n dv e g f i np r o s t a t ec a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo fn f k b ， c o x 一2a n dv e g fi nt h ep r o s t a t ec a n c e ra n dt h eb e n i g np r o s t a t eh y p e r p l a s i c o r g a n i z a t i o n ；t oa n a l y z et h ec o r r e l a t i o n ，t h er e l a t i o n s h i po fc l i n i c a lp a t h o l o g y f e a t u r e sa n dt h ec o n d i t i o na f t e rr e c o v e r y ；t od i s c u s st h es i g n a lt r a n s m i ta n d c o n t r o ls y s t e m ，w h i c hm a ye x i s td u r i n gt h ep r o c e s s e so ft h ea p p e a r a n c ea n d d e v e l o p m e n to f t h ec a n c e r m e t h o d s ：4 7c a s e so fp r o s t a t ec a n c e ra n d2 0c a s e so fb e n i g np r o s t a t e h y p e r p l a s i aw e r ei n v o l v e di nt h i sr e s e a r c h ( a c c e p t e df r o ma d d i t i o n a lh o s p i t i a l o fh e b e iu n i v e r s i t ya n dt h e2 5 2h o s p i t a lo ft h ep e o p l e sl i b e r a t i o na m a r y ) s a m p l e so fp r o s t a t e c a n c e ro b t a i n e df r o mb i o p s y , a n ds a m p l e so fb e n i g n p r o s t a t i ch y p e r p l a s i ao b t a i n e df r o mt u r s i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o dw a s u s e dt od e t e c tn f r , b p 6 5 ，c o x - 2 ，a n dv e g f ce x p r e s s i o ni nt i s s u e so f p r o s t a t ec a n c e ra n db e n i g np r o s t a t eh y p e r p l a s i a r e s u l t s ：t h e p o s i t i v ee x p r e s s i o n r a t e so fn f - k b p 6 5 ，c o x - 2a n d v e g f - cw e r e5 9 5 7 ，5 5 3 2 a n d8 2 9 8 ，w h i c hi sn o t i c e a b l ei ns t a t i s t i c s w h e nc o m p a r e dw i t ht h ee x p r e s s i o n d i s p a r i t yi nt h ep r o s t a t eh y p e r p l a s i c o r g a n i z a t i o n ( p o 0 5 ) b o t ht h ee x p r e s s i o n so fn f k b p 6 5a n dc o x 2s h o w p o s i t i v ec o r r e l a t i o nt ov e g fr e s p e c t i v e l y 1t h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a lp a t h o l o g yf e a t u r e so fn f k b p 6 5i nt h e o r g a n i z a t i o n s o ft h ep r o s t a t e h y p e r p l a s i a a n dt h ep r o s t a t ec a n c e r ：t h e e x p r e s s i o n so fn f - k v p 6 5i sm a i n l yl o c a t e di nt h ec e l lc o r eo ft h ep r o s t a t e c a n c e re p i t h e l i a ，w h i c hs h o w sc l a y b a n kt oc h o c o l a t e b r o w np e l l e t s t h e r ea r e m e r e5 c a s e si nt h e2 0c a s e ss h o w i n gt h ep o s i t i v ee x p r e s s i o n s ，w h i c hi s o n l y 2 5 o fa 1 1 w h i l e ，t h e r ea r e2 8s a m p l e ss h o w i n gp o s i t i v ee x p r e s s i o n si nt h e4 7 c a s e s ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo fw h i c hi s5 9 5 7 ，a n dt h e ya r em a i n l y n e u t r a le v e ns t r o n gi np o s i t i v ee x p r e s s i o n t h e r ei sm a r k e ds i g n i f i c a n c eo ft h e 3 英文摘要 d i s p a r i t yb e t w e e nt h et w o ( x 2 = 6 710 ，p = 0 0 10 ) ，y e tt h e r ei sn om a r k e d c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h en f k b p 6 5 s p o s i t i v ee x p r e s s i o n r a t ea n dt h e d i f f e r e n t i a t i n gd e g r e ea m o n gt h ep c a p a t i e n t s ( r = 一0 0 3 4 ，p - - 0 8 0 3 ) 2t h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a lp a t h o l o g yf e a t u r e so fc o x - 2i nt h e o r g a n i z a t i o n s o ft h ep r o s t a t e h y p e r p l a s i aa n dt h ep r o s t a t ec a n c e r ：t h e e x p r e s s i o no fc o x 一2p r o t e i ni sm a i n l yl o c a t e do nt h ee p i t h e l i ac y t o l y m p ho f t h ep r o s t a t e t h e r ea r eo n l y3 c a s e ss h o w i n gp o s i t i v ee x p r e s s i o na m o n gt h e2 0 c a s e so fp r o s t a t eh y p e r p l a s i co r g a n i z a t i o n ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo f w h i c hi s o n l y 15 0 0 ，h o w e v e r , t h e r ea r e2 6s a m p l e ss h o w i n gp o s i t i v e e x p r e s s i o na m o n gt h e 4 7c a s e so fp r o s t a t ec a n c e ro r g a n i z a t i o n ，a l a r g e m e m b e r so fw h o ma r en e u t r a lo rs t r o n gi np o s i t i v ee x p r e s s i o n ，o fw h i c hi s 5 5 3 2 t h e r ei sm a r k e d s i g n i f i c a n c e o ft h e d i s p a r i t y b e t w e e nt h e t w o ( x 2 = 9 2 9 1 ，p = 0 0 0 2 ) a n da m o n gt h ep c ap a t i e n t s ，t h e r ei sn om a r k e d c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h en f k b p 6 5 sp o s i t i v er a t ea n dt h e d i f f e r e n t i a t i n g d e g r e eo f t h ep r o s t a t ec a n c e ro r g a n i z a t i o n ( 产- 0 110 ，p = 0 412 ) 3t h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a l p a t h o l o g yf e a t u r e s o fv e g fi nt h e o r g a n i z a t i o n s o ft h e p r o s t a t eh y p e r p l a s i aa n dt h ep r o s t a t ec a n c e r t h e e x p r e s s i o no fv e g fp r o t e i ni sm a i n l yl o c a t e do nt h ee p i t h e l i ac y t o l y m p ho f t h ep r o s t a t e t h e r ea r eo n l y4 c a s e ss h o w i n g p o s i t i v ee x p r e s s i o na m o n gt h e2 0 c a s e so fp r o s t a t e h y p e r p l a s i co r g a n i z a t i o n ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo f w h i c hi s o n l y2 0 o o ；h o w e v e r , t h e r ea r e39 s a m p l e ss h o w i n gp o s i t i v e e x p r e s s i o na m o n gt h e4 7c a s e so fp r o s t a t ec a n c e ro r g a n i z a t i o n ，al a r g e m e m b e r so fw h o ma r en e u t r a lo rs t r o n gi np o s i t i v ee x p r e s s i o n ，o fw h i c hi s 8 2 9 8 t h e r ei sm a r k e d s i g n i f i c a n c e o ft h e d i s p a r i t yb e t w e e nt h e t w o ( x 2 = 2 3 6 1 2 ，p = o o o o ) a n da m o n gt h ep c ap a t i e n t s ，t h e r ei sn om a r k e d c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h en f k b p 6 5 sp o s i t i v er a t ea n dt h ed i f f e r e n t i a t i n g d e g r e eo f t h ep r o s t a t ec a n c e ro r g a n i z a t i o n ( f o 0 0 8 ，p = o 9 5 4 ) 4t h ec o r r e l a t i o n a m o n gt h ee x p r e s s i o n so fn f - k b p 6 5 ，c o x 2a n d v e g fi np c a ：t h es t a t i s t i c sr e s u l t ss h o wt h a tt h e r ei s h i g h l yc o r r e l a t i o n b e t w e e nt h e e x p r e s s i o n l e v e lo f n f - k b p 6 5 ( r = 0 2 7 0 ，p = 0 0 4 3 ) ， 4 英文摘要 ( c o x - 2 ( r - - - 0 2 9 5 ，p = 0 0 2 5 ) a n d t h a to fv e g f ；y e tt h e r ei sn oc o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ee x p r e s s i o n sc o x - 2a n d n f - k b p 6 5 ( r = 一0 14 6 ，p = 0 2 7 5 ) c o n c l u s i o n ： 1t h ee x p r e s s i o n so ft h en f k b ，c o x 一2a n dv e g fi np r o s t a t ec a n c e r a r em a r k e dh i g h e rt h a nt h a to ft h eb e n i g np r o s t a t eh y p e r p l a s i a ，a l lo ft h e m p l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ep r o c e s s e so ft h ea p p e a r a n c ea n dd e v e l o p m e n to f t h ep r o s t a t ec a n c e r 2b o t ht h e e x p r e s s i o n l e v e l so fn f k ba n dc o x - 2s h o wp o s i t i v e c o r r e l a t i o nt ot h a to fv e g fr e s p e c t i v e l y n f - k bi so n eo ft h ei m p o r t a n t r e g u l a t ef a c t o r si nt h ee x p r e s s i o n so fc o x - 2a n dv e g f m e a n w h i l e ，t h e r ei s m a r k e dc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o n so fc o x 一2a n dv e g f 3t h ea b e r r a n te x p r e s s i o no fn f - k bk e e p sac l o s er e l a t i o n s h i pw i t ht h e b i o l o g yb e h a v i o ro ft h ep r o s t a t ec a n c e r , w h i c hm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n p r o m o t i n gt h er e b i r t ho f t h et u m o rb l o o dv e s s e lb yt h ea c c e s so fc o x 一2a n d v e g fd u r i n gt h ep r o c e s so ft h ea p p e a r a n c ea n dd e v e l o p m e n to ft h ep r o s t a t e c a n c e r k e yw o r d s ：p r o s t a t i cn e o p l a s m s ；n f r , b p 6 5 ；c o x - 2 ；v e g f - c 5 研究论文 前列腺癌中n f k b 、c o x - 2 和v e g f 的表达 及意义的实验研究 前言 前列腺癌( p c a ) 是欧美国家中男性发病率最高的恶性肿瘤，病死率仅 次于肺癌【l 】。我国作为世界人口最多的发展中国家，近年来随着人均寿命 延长，生活模式西方化，特别是高热量饮食以及缺乏运动，p c a 的发病 率也日趋上升【2 3 】。早期p c a 适宜行前列腺癌根治术或放射治疗【4 5 】，而且 对雄激素阻断治疗敏感，患者预后良好。但是大多数患者确诊p c a 的时 候己经达到进展期或者晚期【6 】，失去手术机会，并且最终转变为雄激素非 依赖性p c a ，而目前临床上对于雄激素非依赖性p c a 尚缺乏有效的治疗 手段，患者预后不佳。因此，从分子机制深入了解前列腺癌的发生发展， 对于前列腺癌的早期的诊断和预防、病程监测、探索对前列腺癌的药物治 疗以及评估预后有着重要的意义。 核转录因子r d 3 ( n u c l e a rf a c t o ro fk a p p ab ，n f 1 出) 是一种重要的转录 因子，是一种能与免疫球蛋白k 轻链基因的增强子v , b 序列 ( g g g a c t t c c ) 特异性的核蛋白因子，广泛存在于几乎所有的组织细 胞质中，并具有多向性调节作用：参与基因基因活化及致癌作用：n f 出及i v , b 家族蛋白与癌的发生、发展相关。h r a s 癌基因诱导的非正常细 胞增生及致癌作用依赖n f r , 3 。n f r , b 还可激活c m y c 基因的表达。n f 1 ( b 可上调c y c l i n d i 基因的表达，促进细胞的生长和增殖【卜9 】。抑制肿 瘤细胞凋亡：t n f 扒电离辐射、化学物质等能诱发正常细胞和肿瘤细胞 发生凋亡，同时激活了n f r , b 的活性。它通过调控下游基因如细胞因子、 b c l - 2 家族、t r a f 和i a p 等的表达参与细胞凋亡的调控。n f r j 3 可以调 控i l 6 、i l 8 、g m c s f 、i l 1 1 3 、t n f a 等细胞因子，而这些细胞因子又 在细胞凋亡中发挥着抗凋亡的作用。n f 1 ( b 能够通过激活b c l 一2 家族中 的a 1 b f - 1 而抵制由t n f a 引起的细胞凋亡。c d 4 0 抑制细胞凋亡的作用 也是通过心的上调b c l x 和a 1 b f l 1 来实现的【l o 】。n f r j 3 在基因和蛋白 表达两个水平上控制了t r a f 1 、t r a f 2 、c i a p l 和c i a p 2 的表达，从 而抑制了凋亡蛋白c a s p a s e 8 的活化。c a s p a s e 8 是介导死亡受体相关信号 研究论文 必须的凋亡蛋白酶1 。参与炎症反应机体炎症反应有多种因子参与， 炎症介质之间相互形成了错综复杂的调控网络。n f r , b 对多种细胞因子 都有调控作用，从而对这一复杂的网络产生影响。n f r b 可以与多种基 因启动子中的n f kb 序列结合，参与炎症介质( n 师眠i l 1 、i l 2 、 i l 6 、i l 8 ) 、粘附分子( v c a m 1 ，i c j 蝴1 ，e 一选择素) 以n o 合酶等基 因的转录，从而可以活化内皮细胞、单核巨噬细胞、各种白细胞，与起 d i c 组织细胞坏死等。研究表明，适度激活n f r , b 能诱导许多抗凋亡基 因的表达，对机体起保护作用，而过度激活则可导致炎症反应。 前列腺素( p g s ) 在正常细胞和畸形细胞的生长和增殖过程中扮演者重 要的角色。环氧化酶( c o x ) 作为花生四烯酸转变为p g g 2 及p g g 2 转变为 p g h 2 的限速酶，其异构体c o x 1 和c o x 2 ，它们在不同的组织中有不 同的表达，并扮演不同的生理功能。人的c o x 2 基因定位于第1 号染色 体l q 2 5 2 2 5 3 ，长约8 3 k b ，由5 端o 8 k b 的转录起始位点上游区6 k b 的蛋白质编码区，以及1 5 k b 的3 端非编码区组成，其m r n a 约4 5 k b e l 2 】。 c o x 1 属于结构性酶，其基因序列被认为是“看家基因”，在正常的组织 和细胞中持续表达，属于持续性表达，定位于内质网，促进生理性前列腺 素( p g s ) 的合成，维持和调节组织细胞正常的生理活动；c o x 2 属于诱导性 酶，其基因序列被认为是“早期即刻基因 ，在正常生理状态下虽然有些 组织如脑、肾、妊娠后期的胎盘表达c o x 2 ，但多数组织内检测不到， 只有当细胞受到刺激才能迅速诱导表达c o x 2 。目前发现在某些细胞中， 特别是在人类癌细胞及细胞系中有强烈表达，主要定位于胞膜，c o x 2 产生的p g s 产物可进入核内，调节靶细胞基因的转录，c o x 2 有促炎症 作用并且可以被生长因子、细胞因子、各种肿瘤因子诱导产生【13 1 。关于 c o x 2 在前列腺组织中的表达有很多学者用不同的方法做了大量的研 究。k i t s c h e n b a u m 用免疫组化的方法测定了胎儿与成人生殖系统中的 c o x 1 和c o x 2 表达，发现在胎儿的前列腺样本中没有c o x 1 和c o x 2 的表达；在青春期的前列腺样本中，c o x 2 只微量表达在前列腺过渡带平 滑肌细胞中：在成人前列腺增生的样本中c o x 2 在平滑肌细胞中有很强的 表达，在管腔上皮细胞中却没有表达【1 4 1 。k i r s c h e n b a u m a f l 5 】等人用鼠的单 克隆抗体来测定3 l 例前列腺癌( c a p ) 及1 0 例前列腺增生( b p h ) 样本中 c o x 1 和c o x 2 表达，发现：c o x 。1 主要表达在b p h 的基底细胞上皮 研究论文 ( 9 0 的阳性染色) ，在管腔上皮细胞中只有微量表达( 1 0 的阳性染色) ； c o x 2 在前列腺癌组织中表达强烈，但同肿瘤的分期、分级无关。而 m a d a a ns t l 6 】等人用免疫组化和免疫印迹的方法研究了c o x 2 在前列腺癌 中的形态分布及表达水平以及其与前列腺癌g l e a s o n 分级的联系，c o x 2 在b p h 及前列腺癌组织中表达有明显的差异，c o x 2 的表达同g l e a s o n 分级明显相关。近几年来国外学者认为c o x 2 与n f r , b 关系密切。在 c o x 2 的启动子上含有2 个能与n f r d 3 相结合的位点，可被之激活 1 7 , 1 8 1 ， 通过t x a 2 途径促进血管内皮细胞迁移和血管形成，在c o x 2 过表达的 同时，可引起或伴有相应的血管生长因子，如v e g f 等的表达上调，促 进血管新生【1 9 1 。 肿瘤血管的形成受大量因子的调节，而在所有的调节因子中，血管内 皮生长因子( v e g f ) 是比较重要的，它调控血管形成作用强，特异性高【2 0 1 。 血管形成是侵袭性肿瘤的典型特征，常常与v e g f 产物的增加有关【2 。 人体许多组织可检测到低水平v e g f 表达，而在肿瘤组织中v e g f 无论 是在m r n a 水平还是在蛋白质水平均有过量表达瞄】。在许多人类和动物 肿瘤包括膀胱、前列腺和睾丸肿瘤中都检测到了v e g f 的高表达 2 3 - 2 6 】。 v e g f 在肿瘤的血管生成、肿瘤微血管密度( m v d ) 、刺激肿瘤细胞增殖中 的作用及其与临床病理参数之间的关系已经有很多的实验 2 7 】，但涉及泌 尿生殖系肿瘤发生、进展、复发和血管生成的因素很多，且v e g f 的临 床价值目前还不完全明确。h a r p e r 掣2 8 】对4 5 例前列腺癌和1 0 例前列腺 增生组织进行的检测，发现绝大多数组织标本v e g f 表达呈阳性，v e g f 主要分布于腺上皮细胞的胞浆，且肿瘤细胞分化越差，v e g f 表达越强。 随后美国泌尿科学杂志同时发表了观点各异两份独立的研究报告【2 9 1 。 j a c k s o n 等【3 0 1 采用免疫组织化学技术研究发现，v e g f 广泛分布于前列腺 癌和前列腺增生组织的上皮细胞、基质细胞和血管壁及其周围组织细胞， v e g f 的分布及表达强度与肿瘤细胞的分化程度无关：f e r r e r 等【”】采用同 样方法研究则发现2 5 例前列腺癌标本中有2 0 例v e g f 表达呈阳性，而 1 1 例b p h 标本仅有2 例表达呈阳性，阳性标本中v e g f 分布广泛，但以 前列腺癌上皮细胞的顶端或腔面表达最强：该研究还发现肿瘤细胞分化较 好者v e g f 的表达强于分化较差者。l e v i n e 等【3 2 】在最近的一份研究中显 示，v e g f 在前列腺癌和前列腺增生组织中均有表达，但b p h 组织中 研究论文 v e g f 的表达限于基质细胞，腺上皮细胞无明显表达，而肿瘤组织间质、 上皮细胞和平滑肌细胞均有表达，以上皮细胞表达最强。c h e v a l i e r t 3 3 】在一 篇专题评论中认为，根据现有的研究难以推断v e g f 在前列腺癌和前列 腺增生发病过程中的作用及其机理，有必要采用更直接的方法对前列腺上 皮细胞上的v e g f 受体及其亚型进行研究，以进一步明确v e g f 在前列 腺组织血管形成过程中的作用及其与前列腺癌发生发展的关系。尽管如 此，血管生成对于探求新的预后指标和治疗措施来说仍是一个值得继续研 究的领域。 本实验拟采用免疫组织化学方法检测n f r d 3 、c o x 2 、v e g f 在前 列腺癌中表达的情况，分析其在前列腺癌的发生发展过程中所起的作用， 为前列腺癌的治疗提供新的思路。 材料与方法 1 材料 1 1 研究对象 收集河北大学医学院附属医院和河北省保定市解放军2 5 2 医院2 0 0 0 年1 月一2 0 0 7 年1 2 月收治的前列腺癌患者的经会阴穿刺标本4 7 例，年龄 5 3 8 7 岁，平均6 5 岁。前列腺癌组织学分级采用g l e a s o n 评分，2 - 6 分6 例( 高分化) ，7 分1 6 例( 中分化) ，8 1 0 分2 5 例( 低分化) 。并选择 同期收治的前列腺增生患者的经尿道前列腺汽化电切标本2 0 例，年龄 5 9 8 6 岁，平均6 7 岁，术前未应用非那雄胺等50 【还原酶抑制剂。全部标 本均经福尔马林固定后石蜡包埋，并做4 1 x r n 的连续组织切片占 1 2 主要试剂及来源 1 鼠抗人n f r _ b 6 5m c a b北京中杉金桥生物技术有限公司 2 鼠抗人c o x 2m c a b北京中杉金桥生物技术有限公司 3 兔抗人v e g f 多克隆抗体北京中杉金桥生物技术有限公司 4p v 9 0 0 0 免疫组化试剂盒( 通用型) 北京中杉金桥生物技术有限公司 5d a b 显色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司 6e d t a 抗原修复缓冲液和柠檬酸抗原修复缓冲液自行配制 7 多聚甲醛莱阳经济开发区精细化工厂 研究论文 8 无水乙醇莱阳经济开发区精细化工厂 9 中性树胶北京中山生物技术有限公司 1 0 二甲苯( 分析纯)莱阳经济开发区精细化工厂 1 3 实验常规溶液的配制 lp b sf p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，磷酸盐酸缓冲液) 液： 磷酸二氢钠( n a h z p 0 4 2 1 4 2 0 ) 9 9 磷酸氢二钠( n a h p 0 4 - 1 2 h 2 0 ) 6 4 5 4 9 氯化钠16 0 9 加蒸馏水2 0 0 0 m l 配成p h 应在7 2 0 7 4 0 之间 2 枸椽酸盐缓冲液的配制 0 1 m 枸椽酸溶液： 称取2 1 0 1 克枸椽酸( c 6 h 8 0 h 2 0 ) 溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 3 防脱片制备： 将玻片放入硫酸盒中，2 4 小时后取出水冲洗，放入温箱q b ( 3 7 0 。c ， 2 4 h ) ，放入a p e s 和丙酮混合液中( 1 ：5 0 ) l m i n ，放入丙酮液中5 s ，然后 晾干。 1 4 主要仪器设备 1l e i c ar m 2 2 4 5 型石蜡切片机德国l e i c a 公司 2t “t k 摊片烤片机孝感市泰康医疗设备有限公司 3 电热恒温烤箱d h 6 4 型上海医疗仪器厂 4o l p u s 2 1 3 型双目光学显微镜o l 心u s 公司 52 0 2 型电热恒温干燥箱北京永光明医疗仪器公司 6b m 型生物组织冷冻包埋机孝感市电子仪器厂 7 抗原热修复盒、湿盒福州迈新生物技术开发公司 8 微量移液器上海求生化化仪器有限公司 9 不锈钢压力锅福州迈新生物技术开发公司 1 0s c 3 2 9 g a 型冰箱海尔公司 1 1t s 1 2 n 生物组织自动脱水机孝感市宏业医用仪器有限公司 1 2t k d r s a 生物组织智能染色机孝感泰康达医疗设备有限公司 13w m k 0 8 型电热恒温培养箱山东潍坊医疗器械厂 1 4w s 2 1 3 3 7 5 电热恒温水浴锅山西文水医疗器械厂 研究论文 2 实验方法 n f r b 、c o x 2 和v e g f 染色均采用免疫组织化学s p 法，其中c o x 2 和v e g f 采用高压热修复抗原，n f r b p 6 5 采用微波修复抗原。 2 1n f 1 出p 6 5 免疫组织化学染色流程 l 常规石蜡包埋，4 k t m 连续切片，切片置于烘片机3 0 - 4 0 m i n ，后置 6 0 7 2 烤箱中烤片1 2 小时。 2 石蜡切片脱蜡水化：将切片依次放入二甲苯1 0 m i n ，梯度酒精1 0 0 、 1 0 0 、9 0 、7 0 各2 m i n ，3 过氧化氢1 5 m i n ，后置蒸馏水中1 0 m i n 。 3p b s ( p h = 7 4 0 ) 缓冲液冲洗3 次，每次3 m i n 。 4 抗原修复，置切片于枸椽酸钠缓冲液中，微波炉中高档1 5m i n ，室 温下自然冷却后，p b s 冲洗3 m i n 3 次。 5p b s 冲洗3 次，每次3 m i n 。 6 滴加一抗：n f r d 3 p 6 5m c a b 工作浓度为1 ：1 5 0 。将组织切片放入 湿盒，置4 。c 冰箱孵育过夜。 7 取出组织切片，室温下复温3 0 m i n ，p b s 冲洗3 m i n 3 次。 8 每张组织切片滴j j n - 抗p v 9 0 0 0 ，放入3 7 恒温烤箱中孵育3 0 m i n 。 9p b s 冲洗3 m i n 3 次。 1 0 每张组织切片滴加1 滴新鲜配制的显色剂d a b ，显微镜下观察结 果，蒸馏水终止显色反应。 1 1 自来水充分冲洗1 0 1 5 m i n 。 1 2 苏木素轻度复染，o 1 盐酸酒精分化，氨水返蓝。 1 3 梯度酒精7 0 、9 0 、1 0 0 、1 0 0 各1 0 m i n ，二甲苯透明1 0 m i n ， 中性树胶封片。 2 2c o x 2 和v e g f 免疫组织化学染色流程 l 常规石蜡包埋，4 1 a m 连续切片，切片置于烘片机3 0 4 0 m i n ，后置 6 0 7 2 烤箱中烤片1 2 小时。 2 石蜡切片脱蜡水化：将切片依次放入二甲苯1 0 m i n ，梯度酒精1 0 0 、 10 0 、9 0 、7 0 各2 m i n ，3 过氧化氢15 m i n ，后置蒸馏水中1 0 m i n 。 3p b s ( p h = 7 4 0 ) 缓冲液冲洗3 次，每次3 m i n 。 4 抗原修复，枸椽酸钠缓冲液( p h = 6 0 ) 2 0 0 0 m l 置于高压锅内，电磁灶 研究论文 加热至沸腾，将脱蜡水化组织切片于枸椽酸钠缓冲液中，盖好高压锅盖， 并加盖高压阀门，高压阀门剧烈摆动2m i n 后将高压锅端离热源，自然冷 却至室温。 5p b s 冲洗3 次，每次3 m i n 。 6 滴加一抗：c o x 2m c a b 工作浓度为l ：5 0 ，v e g f 多克隆抗体工作 浓度为l ：1 2 0 。将组织切片放入湿盒，置4 。c 冰箱孵育过夜。 7 取出组织切片，室温下复温3 0 m i n ，p b s 冲洗3 m i n 3 次。 8 每张组织切片滴a n - 抗p v 9 0 0 0 ，放入3 7 恒温烤箱中孵育3 0 m i n 。 9p b s 冲洗3 m i n 3 次。 1 0 每张组织切片滴加1 滴新鲜配制的显色剂d a b ，显微镜下观察结 果，蒸馏水终止显色反应。 11 自来水充分冲洗1 0 1 5 m i n 。 1 2 苏木素轻度复染，o 1 盐酸酒精分化，氨水返蓝。 1 3 梯度酒精7 0 、9 0 、1 0 0 、1 0 0 各1 0 m i n ，二甲苯透明1 0 m i n ， 中性树胶封片。 2 3 免疫组织化学染色结果判定： n f r d 3 p 6 5 阳性染色多位于细胞核内，胞浆内也可见到，呈棕黄色颗 粒或团块，弥漫分布。c o x