（物理电子学专业论文）微流路医学诊断芯片的制作及研究.pdf

中文摘要 中文摘要 微全分析系统( u t a s ) 研究是目前医用仪器发展的重要方向和前沿领域， 在疾病检测、环境监测、药物筛选等方面有着重要的意义。尤其是在医学诊断方 面，微全分析系统可有效的降低污染，减小试剂消耗，降低成本，实现自动化。 目前，关于微全分析系统在医学疾病诊断方面的研究刚刚起步，本论文旨在对微 全分析系统在医学诊断方面的应用进行探究。 用于医学诊断的微全分析系统主要可分为三个部分：样品前处理，产物扩增 检测( 包括电泳或杂交检测) 。其主要技术是制作微流路的生物芯片 ( m i c r o f l u i d i cb i o c h i p ) ，针对这些，本文主要的研究内容如下： 1 制作了两类基于s p e ( s o l i dp h a s ep x t r a c t i o n ) 法的d n a 提取芯片一硅 芯片和磁珠吸附的p d m s 芯片。经实验证明：这两种方法都可有效的对p c r 产物 中的d n a 进行回收，同时还利用硅芯片进行了酵母菌的d n a 提取，取得了较好的 结果。 2 对本室制作的p c r 芯片进行了验证，主要是进行荧光p c r 检测，建立了 一套适宜做荧光p c r 的方法和系统，为实时荧光检测研究创造了条件。 3 制作并研究了芯片上的免疫反应实验。在p d m s 芯片上使用磁珠介导，成 功的完成了人i g g 在磁珠上的固定、人i g g 和荧光标记的羊抗人i g g 在芯片上 的免疫反应。 4 制作并研究了p d m s 芯片上的d n a 分子杂交反应。针对p d i s 新型材料， 试验了两种d n a 分子的固定方法。确定了生物素一亲和素介导的d n a 分子固定化 方法，并使用此芯片和固定方法进行了芯片上的d n a 杂交反应。同时摸索出消除 非特异性信号，提高反应特异性的方法，取得了较好的实验结果。 关键词：p d m s 磁珠样品处理p c r d n a 免疫杂交 a b s t r a c t d e s i g n a n df a b r i c a t i o no fm i c r o f l u i d i c d i a g n o s t i cs y s t e m s c h e n x i a n g ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) ( d i r e c t e db yp r o f e s s o rd a f uc u d a b s t r a c t t h ea r e ao fm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，a l s oc a l l e d “l a bo nac h i p ”，o rm i n i a t u r i z e d a n a l y s i ss y s t e m s ，i sg r o w i n gr a p i d l y ，e s p e c i a l l yi nt h ef i e l do f c l i n i c a ld i a g n o s t i c s t h e p r i n c i p a l ea d v a n d a g e sa s s o c i a t e dw i t hu - t a si n c l u d es a v i n gt i m ea n dc o s t ，s e v e r a l a n a l y s e sc a r lb ec o m p l e t e ds i m u l t a n e o u s l ya n da u t o m a t i c a l l y t h em i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m sa r eb a s e do nt h em i c r o f l u i d i c si n t e r g r a t e dc h e m i c a l p r o c e s s i n ga n da n a l y s i s ，t h o u g hs t i l li nm a n yw a y s j ni t sj n f a n c y i n t e r e s ti nt h i sf i e l d h a sg r o w ne x p l o s i v e l yo v e rt h el a s t d e c a d e s t y p i c a lm i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s u s e df o rc l i n i c a ld i a g n o s t i c sa r eo f t e nc o m p o s e do ft h r e ep a r t s ：s a m p l ep r e p a r a t i o n ； c h e m i c a la m p l i f i c a t i o na n dd e t e c t i o n ( i n c l u d i n ge l e c t r o p h o r e s i sa n dh y b r i d i z a t i o n ) t h i sd i s s e r t a t i o nm a i n l yf o c u s e so n s t u d y i n gt h e s et h r e ep a r t s 1 t w oi y p e so fd n a p u r i f i c a t i o nc h i p sb a s e do nt h em e t h o do fs p e ( s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ) h a v eb e e nf a b r i c a t e da n ds t u d i e d o n ew a sf a b r i c a t e db ys i l i c o nu s i n g m e m s ( m i c r o - e l e c t r om e c h a n i c a ls y s t e m ) t e c h n o l o g y ；t h eo t h e rw a sf a b r i c a t e db v p d m s ( p o l y d e m e t h y l s i l o x a n e ) t h r o u g hs o f tl i t h o g r a p h y u s i n gm a g n e t i cb e a d st o p u r l f yd n a b o t hc h i p sw e r eu s e d t op u r i f yt h ed n af r o mp c r p r o d u c t s t h es i l i c o n c h i pw a s a l s ou s e dt op u n f yd n af r o my e a s tb a c t e r i a 2 b i o l o g i c a le x p e r i m e n t sh a v eb e e nc o n d u c t e dt ot e s tt h ep c r c h i pa n d af l u o r e s c e n t m e t h o dh a sb e e n d e v e l o p e d 3 ，a ni m m t m o c h i pw a sf a b r i c a t e db yp d m su s i n gs o f tl i t h o g r a p h y m e t h o d sw e - e d e v e l o p e d t oi m m o b i l i z eh u m a n i g g o nt h es u r f a c eo f m a g e n e t i cb e a d s t h ei m m u n o r e a c t i o nw a ss u c c e s s f u l l yp e r f o r m e db e t w e e nt h eh u m a ni g oi m m o b i l i z a e do nt h e m a g n e t i cb e a d sa n df f f cl a b e l e ds h e e pa n t ih u m a n 垃gi nt h ec h a n n e l 4 p d m s g l a s sm i c r o c h i pu s e df o rp e r f o r m i n gd n a h y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n h a sb e e n f a b r i c a t e da n ds t u d i e d b i o t i n - a v i t i n s y s t e r a ( b a s ) w a su s e dt oi m m o b i l i z ed n a o n t h ep d m sc h a n n e lc o m p a r e dt ot h ed i r e c ti m m o b i l i z a t i o nm e t h d s t h e h y b r i d i z a t i o n r e a c t i o na l s oh a sb e e ne x a m i n e db e t w e e ni m m o b i l i z e d p r o b e a n d t a r g e td n a k e yw o r d s ：p d m s d n a s a m p l e p r e p a r a t i o n p c r a n t i b o d y h y b r i d i z a t i o n 第1 章绪论 1 1 微流路医学诊断芯片简介 1 1 1 诊断芯片研究的内容 第1 章绪论 诊断芯片研究的内容是使用医学诊断学技术，在微芯片上进行疾病检测，以 达到预防和诊断治疗的目的。 在发展中国家，近一半的死亡病例由传染病所导致，发展中国家现有的很多 诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷。聚合酶链式反应、单克隆抗体等分 子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传 染病诊断的水平，使死亡率降低。 医学诊断学包括基因诊断、免疫学诊断和细胞学诊断等多方面。目前用于医 学诊断的微流路芯片主要是基于分子学诊断的，即基因芯片和免疫芯片，所以在 这里简单介绍基因诊断和免疫学诊断。 基因诊断 除了朊病毒( 如疯牛病病毒) 等生物以外，几乎所有的生物，从病毒、单细 胞的细菌到人类自身的细胞，都含有遗传物质核酸，核酸带有所有生命体的基因 信息。所以不同物种之间的d n a 有其独特性。近三、四十年由于各种观念韵突破 及研究方法的推出，配合计算机技术的发展，分子生物的技术已被广泛应用于临 床医学各领域。 现代化的医学中心将有分子生物实验室的设立，备有d n a 提取设备，d n a 扩增， 电泳或杂交检测，同时结合数据快速检测仪和生物数据信号处理仪所组成的计算 机化处理系统。对于基因缺陷的遗传疾病可经由“缺失”、“过多”、“点突变一等 特性进行诊断，亦可进行家族连锁分析。 如使用致癌基因的探针，可进行恶性肿瘤的诊断及研究。利用聚合镑链反应 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术，可将小量d n a 于短时间内大量复制， 除了可检测细胞内基因形态的变化，也可由末稍血液或骨髓找出极少量的癌细 第1 章绪论 胞，故可用于癌症复发或转移的早期诊断。 人类的遗传标记各有其特异性，只要少量的血液、尿液、痰液、唾液等，甚 至是一根毛发，配合p c r 技术即可得到足量d n a 分析其遗传特征。除了可用于器官 移植方面，对于法医学的刑事鉴定上也有着重要的意义。 分子生物技术亦可应用于病原微生物( 如后天性免疫不全病毒，及其它一些 常见病毒、细菌、真菌等) 的侦测，检定其毒性、分型或测其对于抗生索的抗药 性等，不仅可增加疾病的诊断率且可以缩短诊断时间，亦可解决一些病原菌不易 培养的问题。另外早期侦测出抗药性菌种可提供医生选择最佳的治疗方法及作为 治疗成效的评估。 d n a 诊断法具有准确、快速、高灵敏度等特点，使得此种技术广为应用于临 床医学检验上。分子检验的大量运用是未来检验的新趋势。 免疫学诊断 免疫学检测技术是感染病原检测的主要方法。免疫学实验的原理是：外来致 病微生物的特异性蛋白为抗原，人体针对这种抗原的特异性免疫球蛋白为抗体。 抗原、抗体在体内会发生对应的免疫反应。实验室可以用严格的实验条件，在体 外模拟这种免疫反应。如果抗原、抗体中一种是已知的，就可以检测另一种是否 存在。比如，可以在体外用乙型肝炎病毒特异抗体检测病人血清，如果发生了免 疫反应，便可以通过指示反应指示出来，最终说明病人受到了乙肝病毒感染。 常用的两个免疫实验是免疫荧光实验( i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y ，i f a ) 和酶 联免疫吸附实验( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b a n t a s s a y ，e l i s a ) 。免疫荧光实验 和酶联免疫吸附实验的区别只是指示反应不同。免疫荧光实验用荧光素来指示， 而酶联免疫吸附实验用过氧化物酶交联色原显色。两种反应的灵敏度很好，特异 性也非常高。 分子医学诊断学有着极其重要的意义，而开发快速、准确、简便、成本低 廉的医学诊断芯片对于我们这个人口众多，医疗水平还不发达的国家尤其有着重 要的现实意义。以s a r s ( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ) 病毒为例。其病 毒刚出现时，病毒感染的机理和治疗措旅尚不明确，因此对s a r s 病毒进行p c r 检测及免疫学检测是控制疾病流行的主要措施，由于s a r s 病毒感染性极强。检 第1 章绪论 测结果污染性较大，成本也较高，因此开发快速、准确、一次性使用的微流控微 全分析诊断芯片极有必要。虽然现在国内外尚没有较成熟的基于医学诊断的微流 控芯片，但这是医学诊断学的发展趋势，必将对人类的生活产生深远的意义。 1 。1 。2 徽流路医学诊断芯片妁简介及意义 微流路医学诊断芯片是生物芯片一个新的发展方向。生物芯片是近十年来 迅速发展起来的一种崭新的微器件或微系统，它将在2 1 世纪给生物、化学分析 和医学诊断技术带来一场革命。 目前，生物芯片已出现多种类型和结构，制造生物芯片也有多种技术。最 有代表性的是二维微阵列结构生物芯片，这种芯片采用微电子集成电路( i c ) 制 造工艺技术或点样印刷、喷墨技术来制造。用i c 技术可制作高、中、低不同d n a 探针密度的芯片；而点样印刷和喷墨技术主要制作廉价的中低密度d n a 探针点 阵芯片。另外一种类型芯片是三维微结构芯片，是采用微电子机械系统( m e m s ) 技术制造的带有微流路的生物芯片。这种生物芯片可以具有单一功能，也可以是 集成化多功能的微系统。 生物芯片技可进行生命科学与医学中的各种生物化学反应，实现对基因、 配体、抗原等生物活性物质高效、快捷的测试和分析。它的出现将给生命科学、 医学、化学、新药开发、生物化武器、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带 来巨大的影响。 目前，生物芯片在疾病诊断方面的研究和应用刚开始，与常规的生物检测 手段相比，生物芯片技术有许多优点：由于尺寸的缩小，意味着更少的试剂消耗； 可以同时进行多个样品的处理，而且每个样品处理的时间更快，缩短了整个检测 所需的时间：生物芯片的集成化也减小了试验的不确定因素；而由于自动化程度 的提高和整合，对专业技术人员的要求会降低；在整个过程中减少了对试剂的接 触，因此增强了安全性，减少了污染。另外就是体积小。携带方便。因此生物芯 片在临床应用上有着相当大的优势。目前在临床诊断上应用的生物芯片主要可以 分为两类： ( 1 ) 微阵列的生物芯片( m i c r o a r r a yc h i p ) 。此类芯片是将d n a 或蛋白质等 第l 章绪论 固定在芯片上，利用杂交反应对生物样品进行检测，从功能上分有两类。 序列芯片( s e q u e n c ec h i p ) ：各类文献中讨论最多的基因芯片就是此类 芯片。最早是h y s c q 和a f f y m e t f i x 公司制作这种芯片。其原理是：将通常为 2 0 个碱基的d n a 片断分子固定在微芯片上，靶d n a 导入到芯片里，迸行 杂交反应，通过杂交结果确定靶d n a 的序列。用从正常人基因组中分离出 的d n a 与d n a 芯片杂交就可以得出标准图谱。用从病人基因组中分离出的 d n a 与d n a 芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱， 就可以得出病变的d n a 信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏 感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如， a f f y m e t r i x 公司，把p 5 3 基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制 成p 5 3 基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，h e l l e r 等构建了9 6 个基因的e d n a 微阵，用于检测分析风湿性关节炎( r a ) 相关的基因，以 探讨d n a 芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯 片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊 断芯片逐步开始进入市场。 表达苍片( e x p r e s s i o nc h i p ) ：它的原理是通过检测某一特定基因产生的 m r n a 的数量来确定此基因的表达水平。此类芯片对诊断和治疗与基因相关 的疾病很有用处，特别是一些癌症。具有代表性的是v y s i s 和s y n t c n i ( f r 锄o n t ，c a ) 两家公司的表达芯片产品和配套设施。 ( 2 ) 微流控生物芯片( m i c r o f l n i d i e b a s e db i c r o c h i p ) ：d n a 或蛋白质在芯片内流 动，反应。并通过电泳或杂交等方法被检测。近年来，在这方面的研究发展 很快，如检测g l u c o s e ，l a c t i ca c i d 和a s c o r b i ca c i d 的芯片【”，在疾病诊断 方面，此类芯片有很广阔的应用前景，如检测致病因子等方面。其发展趋势 是在芯片上集成多种功能，使其能串行或并行处理多种生物反应。如微流体 d n a 分析芯片常整合生物医学样品处理，生化反应，如：p c r 反应，d n a 酶消化 反应和d n a 检测等多种功能在一个芯片上。 4 第l 章绪论 图1 1 芯片结构示意图 如图1 1 所示，为此类苍片的典型结构。目前，此类芯片已经取得了很大的 发展，使常规的试剂用量降到微升级，纳升级甚至是皮升级，样品和试剂的消耗 都大大的减少，反应速度加快，并且展示了向自动化和并行处理多个样品的可 能性。基于微流路的生物芯片正朝着通用性和高效性发展，各种各样的芯片正在 被研制，而微流控芯片技术的发展，对药物研制开发，临床医学诊断，药物释放， 组织工程学和生物武器等领域都有极大的推动作用。无疑将带来分离检测技术的 一场革命。 微流控芯片的加工技术，材料以及流体控制方式也引起了越来越多的关注。 如对材料的选择上，除了传统的硅，玻璃等材料外，近年来塑性材料制作的微流 控系统也得到了很大的发展，而加工技术除了传统的微机械加工技术外，还有注 射成型，注模成型法，激光融合法等。目前有许多公司和研究单位从事微流控系 统的研究，比较有代表性的如a c l a r a 、a g i l e n t 、c a l i p e r 以及c e p h e i d 等公司。 图1 _ 2a g l l e n t2 1 0 0 生物分析仪 第1 章绪论 1 2 微流路诊断芯片的工艺制作 微流控芯片的加工技术以m e m s ( m i c r oe l e c t r o - m e c h a n i c a ls y s t e m s ) 加工技 术为主。m e m s 加工技术是在微电子器件制造技术( 也称集成电路i c 技术) 基础 上进一步融入微机械加工技术，并把两者结合起来的微制造技术。i t e m s 具有微 小化、可批量生产( b a t c hp r o d u c t i o n ) 及降低成本等优点，可广泛的应用与医 学、生化、光电、航空等的研究。 传统的i c z 艺包括光刻、氧化、掺杂、扩散、蒸发、溅射，湿法刻、离子刻 蚀等工艺，材料主要是硅、氧化硅、氮化硅、铝等；而脏船工艺除了i c 传统工艺 外，还增加有各相异性腐蚀单晶硅、深刻蚀、x 一射线光刻、电镀、厚膜( s u 一8 ) 、 l i g a 、硅玻璃及硅一硅键合等工艺，加工对象也增加了压电材料、磁性材料、 塑性材料、铂、金、玻璃等材料。 1 2 1 玻璃的微加工技术 硅及玻璃的微加工技术仍然是制作微流控生物芯片的主要工艺技术，这是因 为其工艺比较成熟，重复性较好，可以得到很好的纵深比，而且加工后的芯片易 于键合，有利于芯片的封装。 典型的硅微加工工艺制作微流控芯片的流程是：首先在硅片上甩正胶或负 胶，然后在高分辨率的掩膜下进行紫外曝光，去胶后进行湿法刻蚀，如果需要管 壁垂直或一定的深度。则通常使用深离子刻蚀( d e e pr e a c t i v ei o ne t c h i n g ) ， 玻璃钻孔以便进样和出样并与硅片进行键合。硅片上的好处是有利于和微电极进 行整合；也有在玻璃上刻蚀沟道的做法，其典型工艺如图卜3 所示。这类芯片具 有很好的硬度，便于保持芯片的形状而不至于变形。 第1 章绪论 1 2 2l i g 工艺 图1 3 玻璃加工工艺 德国为代表的l i g a ( l i g a 是德文l i t h o g r a p i e - - 光刻、g a l v a n o f o r m u u g - - 电铸和a b f o r m u n g - - 铸塑三个词的缩写) 技术，它是利用x 射线光刻技术，通过 电铸成型和铸塑形成深层微结构的方法。其中第二种方法与传统i c 工艺兼容， 可以实现微机械和微电子的系统集成，而且该方法适合于批量生产，已经成为目 前m e m s 的主流技术。由于利用l i g a 技术可以加工各种金属、塑料和陶瓷等 材料，而且利用该技术可以得到高深宽比的精细结构，它的加工深度可以达到几 百微米，因此l i g a 技术也是一种比较重要的m e m s 加工技术。l i g a 技术自八 十年代中期由德国开发出来以后得到了迅速发展，利用该技术已经开发和制造出 了微齿轮、微马达、微加速度计、微射流计等。第一种加工方法，则可以用于加 工一些在特殊场合应用的微机械装置，如微型机器人、微型手术台等。 1 2 3 塑性材料加工工艺 使用玻璃、硅基材料加工微流控芯片虽然工艺技术成熟，但是存在着加工成 本高的问题，使用塑性材料加工微流控芯片则具有很大的成本优势，有利与芯片 降低成本，一次性使用以避免污染，因此近几年来，利用塑性材料制各芯片的报 导越来越多。 第1 章绪论 塑性微流控芯片的加工方法包括激光消融法( l a s e ra b l a t i o n ) ，铸模法 ( m o l d i n g ) 等，简单介绍如下： 激光消融法是通过吸收短波长的激光脉冲来打破长链聚合物的共价键，形成 分解的聚合物片断。然后再根据掩板的设计，通过x y 方向控制激光的位置，得 到不同形状尺寸的微孔穴和微通道。最后所得到的微流控芯片结构特点是：受热 破坏小，通道壁垂直，得到通道的深度是确定的。 铸模的方法很多，根据使用的材料的不同。有喷射模塑法( i n j e c t i o n m o l d i n g ) ，压缩模塑法( c o m p r e s s i o n m 0 1 d i n g ) ，热压纹法( h o te m b o s s i n g ) ， 软印法( s o f tl i t h o g r a p h y ) 等。常用的加工塑性微流控芯片的材料有聚碳酸酯 p o l y c a r b o n a t e 、聚甲基丙烯酸甲酯p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) 、聚苯 乙烯p o l y s t y r e n e 、硝化纤维n i t r o c e l l u l o s e 、聚乙烯p o l y ( e t h y l e n e ) 、聚四 氟乙烯p o l y ( t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ) ( t e f l o n ) 、聚二甲基硅氧烷p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) 等。一般加工塑性微流控芯片的流程为：首先是 利用传统的光刻工艺加工微流控芯片的模具，然后用铸模法得到沟道未封闭的微 流控芯片，最后进行封装得到微流控芯片。 使用铸模法加工微流控芯片的方法一般包括两个步骤，首先是加工模具，然 后将沟道模式从模板转移到聚合物底片上。根据对沟道的尺度和精度的不同要 求，可以使用不同的技术来制造模具。对于加工尺寸较大的模具( 1 0 0 m ) ，利 用计算机数字控帝4 法( c n c ) 加工出的不锈钢模具就足以满足要求了；对于加工 尺寸较小的模具( 1 0 0 “m ) ，可以先在硅片上甩上光刻胶，然后利用光刻技术对 光刻胶进行腐蚀得到所需结构，最后在上面电镀上金属材料( 如镍或镍一钴合金) 制得模具；对于加工具有更精细结构的模具，则需要使用l i g a 技术。l i g a 技术 使用同步加速器产生光刻用的x 射线，然后进行电镀处理得到模具。 可通过喷射模塑法、压缩模塑法、热压纹法、软印法进行复模，得到微流控 芯片。喷射模塑法是将聚合材料融化后喷注在放置于铸模腔中的模具上，5 - i 0 秒后进行脱模，这种方法非常适合大规模的加工低成本的器件【“ 。热压纹法过程 中，先将模具和聚合材料底片分别至于真空中加热至一定的温度，然后将模具与 聚合材料底片表面紧密接触，压出沟道的纹理，这个过程一般要进行相对较长的 时间。软印法不需要对模具和聚合材料进行事先加热处理，而是直接将聚合材料 第1 章绪论 浇铸到模具上。 1 3 目前国内外微流路诊断芯片的发展应用 微流路诊断芯片包含有多个元件，如样品处理芯片、d n a 扩增芯片、毛细管 电泳芯片、微泵、微阀等，必须考虑芯片封装、信号检测等多方面的问题。下面 就国内外微流路芯片相关技术最新的发展做简要介绍。 i 3 1 样品制备芯片 在医学诊断中，样品的来源是多样豹，如全血、血清、尿液或唾液等，两样 品的成分比较复杂，如全血中包含有蛋白、细胞、d n a 等，必须对样品进行初步 的分离。不同的样品处理的方式是不同的。现在，已发展出各种各样的微加工芯 片以对样品进行处理。 1 细胞分离和聚集 对某些样品而言，必须进行细胞分离以降低原始样品的复杂性。而有些样品 中待检测的靶分子很少，则需要对样品进行富集。如假设l m l 血样中有1 0 0 拷贝 的h i v ( 艾滋病毒) ，则至少需要0 5 m l 的血液才可以检测出来。而这0 5 m l 的 血中还包含有2 5 1 0 9 红血球和2 5 5 x1 0 6 的自细胞，在采用扩增技术检测此 微量的病毒前必须去除血细胞并富集病毒颗粒。现在，已有多种微芯片应用在 细胞分离和细胞富集上，主要有以下几种方法。 ( 1 ) 微过滤：现已设计出各种各样的微过滤芯片，如在玻璃和硅片上制作 柱状、弯曲的沟道q 、梳状门或堰状的微过滤器从全血中分离白细胞。微过 滤芯片的好处是不需要特殊的缓冲液，缺点是此方法要求需要的细胞和不需要的 细胞必须有明显的尺寸差异。 ( 2 ) 介电电泳法( d i e l e c t r o p h o r e s i s ) 是另一种常用的分离细胞的方法。 不同的细胞在所加的电场下有不同的反应，因此可以通过改变交变电场频率对细 胞进行分离。介电电泳芯片可以通过光刻法在玻璃或硅片上制作微电极阵列制 得，混合细胞由于对电场的不同反应会聚集在电极的不同地方。由于其简便性， 第1 章绪论 介电电泳法是比较常用的芯片级细胞分离的方法。已有利用这种芯片分离细菌 5 , 6 , 7 , 8 癌症细胞田1 0 干细胞、淋巴细胞等。与过滤方法不同的是，此方法不受 分离的细胞尺寸的限制。同时具有灵活性、易操作性和易于自动化，也不需要标 记。其缺点是介电电泳的分离需要低电导的缓冲液，这意味着原始样品不能直接 进行分离。 ( 3 ) 超声波处理：c o a k l e y 等人报道采用超声波从全血中分离细胞。“还 有一些文献也有相关的报导。“2 川 2 细胞破裂 细胞破裂法常分为机械方法和非机械方法。 机械方法是利用物理方法破碎细胞壁，使细胞内的物质释放出来。如利用高 压，微珠剪切等。 超声波“4 方法是最常用的破碎细胞的机械方法，超声波系统会在液体内产 生声压，在合适的条件下，这会导致微小气泡剧烈的产生和破裂，在封闭的环境 内会产生具有足够能量的冲击波破碎细胞膜。现在芯片上的声波处理器常常是由 锆酸钛制备的压电换能器，谐振频率在1 5 - - 2 5 k h z 。声波方法的好处是可以处理 难处理的样品，如孢子等样品。其缺点是超声波方法容易产生热量和辐射影响生 物分子。 机械方法还存在一些问题。破碎细胞比较彻底，因此给下一步d n a 从蛋白和 细胞裂解物中分离带来困难；并且细胞碎片使得溶液难以澄清。但最大的问题是 机械方法需要的装置复杂，不利于芯片的微型化。 非机械方法：包括化学法、酶法、渗透法、热学法、电法等。 化学方法“5 主要是通过使用化学方法使细胞壁破碎，细胞内的物质释放出 来，常用的化学试剂有酚、氯仿、d m s o 、苯等，近年来比较热的是采取高盐离子 溶液进行d n a 的固相提取。化学方法的缺点是化学试剂不易除掉，而且必须在芯 片中增加储液池的设计以储存化学试剂。 热学法“。易于小型化，但缺点是不适宜于所有的样品处理；电学法。l t t ) 易于小型化，但效率不高。 3 d n a 提取 o 第】章绪论 在疾病诊断中，常常需要提取d n a 进行下一步的反应。d n a 的提取常采用 离子交换法，微珠法，膜法等，这些方法都易于在芯片上实施。 1 3 2p c r 扩增芯片 利用生物芯片诊断疾病，有必要采取d n a 扩增技术对样品制备的d n a 进行扩 增。p c r ( p o l y m e r a s e c h i n r e a c t i o n ) 技术是扩增常用的技术，可以将目的基因 或某一d n a 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。 有三种基本且不同的方法来制作p c r 芯片。一类是n o r t h r u p 等人1 9 9 3 年 曾经发表的一个( b u l k m i c r o m a c h i n e ds i l i c o nc h a m b e r ) p c r 生化反应室“”， 此芯片是在硅片上刻蚀出小池，用耐热玻璃密封，小池背面是多晶硅加热器。 d a n i e l 也曾发表一个加以变形的装置，以增加反应室的热绝缘性。较之前实行 p c r 反应的大型仪器，这些装置都在根本上进行小型化，减少周期反应所需的 时间。如下图所示： 图1 - 4 n o r t h r u p 的p c r 芯片 另一类芯片最早是k o p p 发表的一个连续流芯片( c o n t i n u o u s f l o wd e s i g n ) 。 在此装置内，样品从一个固定温度的区块流动至下一个区块，沿着流道来执行 p c r 周期。 图1 t 5k o p p 的p c r 芯片 第1 章绪论 还有一类芯片的设计类似第二类芯片。所不同的是：在：占片设计中，样品区 恒定不动，三个温区模块不停转动对样品进行加热处理( 6 5 ) o p c rj 占片关键在于芯片材料的选择和加热器的制作。材料表面的性质对p c r 反应的影响较大。有研究表明：p c r 反应在硅和氮化硅表面成功率较低，对硅表 面进行修饰后会提高成功率，而s i o 。是进行p c r 比较好的材料。“9 2 0 ) 0 目前有 报导利用玻璃吨”，塑性材料旺2 等制作p c r 芯片。p c r 反应必需要求较快的升温 和降温速率，因此选择好的加热方式很重要。目前有报导利用p e l t i e r 元件，红 外旺“等做热源。现在利用硅制作的p c r 芯片可以达到1 7 s 每循环，。舢，而反应 体积只需几微升甚至皮升( 2 4 ) 0 p c r 信号检测的方式也很多。有报导采用光纤插入至f j p c r 反应池中收集激发光 来检测p c r 产物的信号，也有采用光电二极管检测p c r 产物旺鄹，但文献报导中最 常见是将p c r 和毛细管电泳( c e ) 相结合。实时p c r 技术( r e a lt i m ep c r ) 也是 常用的p c r 产物检测手段。t a y l o r 等人。郇采用商业化的试剂盒实时监测在硅 片刻蚀出的小池内进行的p c r 反应。而b e l g r a d e r 等人设计的可携式实时p c r 扩增 器。其反应体积为2 5 u i ，检测遗传血色沉着病( h e m o c h r o m a - - t o s i s ) 基因的s n p 约为2 0 分钟“”。 单纯的p c r 芯片由于仍无法避免加样和取样时的污染，故实用的p c r 芯片常常 和别的部分整合在一起，组成多功能芯片。妻h w a t e r s 等人设计的芯片，将细胞 裂解，p c r 扩增和电泳分离结合在一起( 2 勖。在其后续的工作中，还有在一个芯片 上同时进行多个样品的p c r 反应和电泳分离心钟。 c e p h e i d 公司的产品则将样品处理和快速p c r 整合在一起，并利用分子信标 或t a q m a n 的技术实时荧光检测微生物样品。如图0 - 6 。 图 1 - 6c e p h e i d 的整台芯片 在临床检测中，基因检测有着重要的意义，如某些病毒d n a 的检测等。常规 第1 章绪论 的p a r 反应由于污染，对实验设备要求较高等原因，不利于作为临床诊断的依据。 这些芯片由于将样品前处理，p a r 扩增和信号检测集成在一起，减少了污染，使 临床p c r 结果的判断更为可信，在临床诊断上有着广阔的应用前景。 1 3 3 毛细管电泳芯片 最早采用毛细管电泳玻璃芯片快速分离氨基酸的报导是在9 0 年代早期“， 其后有许多研究者研究毛细管芯片电泳并将其用于核酸的分离。最早分离d n a 的 报道是e f f e n h a u s e r 等人( 3 1 利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸。整个分离过程 在4 5 s 以内，而芯片的长度仅为3 8 c m 。其所加的高电压2 3 0 0 v c m 和较小的样 品体积有利于得到较好的分离效果。而传统的毛细管电泳分离d n a 样品通常需要 l o 到3 0 分钟，电压只能加到5 0 0 v c m 。另一个例子是w 0 0 1 e y 等人。2 制作的 用于高速d n a 分离的芯片，芯片在玻璃上刻蚀，有效长度仅为3 5 e m ，分离从7 0 到1 0 0 0 b p 的d n a 片断时间在1 2 0 s 以内。早期关于毛细管芯片电泳较重要的报道 还有将质粒p b r 3 2 2 的消化和电泳分离结合在一起，其芯片是采用注射成型的塑 性材料制作而得q ”。 目前，高速、高通量的芯片毛细管电泳分离已经发展的比较完善。s h i 等人 设计的并行d n a 电泳芯片，在一个芯片上制作有9 6 个毛细电泳阵列，分别和9 6 个样品池相连，呈辐射状。一个旋转的共聚焦的荧光检洌4 系统对信号进行检测。 此系统可以同时对9 6 个不同的样品进行分离，整个分离检测过程在8 分钟以内 心o 。而u e d a 等人用p a 材料制作的毛细电泳芯片，可以对d n a 样品进行高 速分离。”。安捷伦( a g i l e n t ) 公司最早推出了商业化的毛细管电泳芯片及检测 系统a g i l c n t2 1 0 0 ，它集成毛细管电泳芯片和检测系统在一个仪器内。与传统的 电泳相比，时间更短，试剂消耗更少，而操作更简单。可在3 0 m i n 内对1 2 个样 品进行电泳分离，其分辨率相当高，可以达到1 个b p 。 芯片毛细管电泳在芯片d n a 分析上起着重要的作用。事实上，现在微流控 芯片上的d n a 分析除了少数p c r 实时分析d n a 样品外，几乎全部采用毛细电 泳方法进行分析。利用芯片毛细电泳可以进行d n a 长度分析，序列分析和基因 分型等研究。而基因分型在临床检测，尤其在遗传病的诊断和预测中具有重大的 第1 章绪论 意义。 1 3 4 杂交芯片和免疫芯片 杂交反应和电泳是分子生物学中检测的两个基本手段，在疾病诊断中都有着 重要的作用。最常见的杂交芯片是基于m i c r o a r r a y 的d n a 芯片，d n am i c r o a r r a y 在基因分析等方面有着重要的作用；而另一种杂交芯片，基于微流道 ( m i c r o f l u i d i c ) 的杂交芯片在疾病诊断中也有着重要的作用，它可以和样品处 理等部分整合在一起，是芯片实验室( l a bo nac h i p ) 的一部分。 最早关于微流道的d n a 杂交芯片的报道是利用磁珠在微流道内进行d n a 动态 杂交作基因表达分析c 3 6 ) 。微磁珠通过标记p o l y t ，或利用生物素亲和素和不 同的d n a 样品结合，利用磁力固定在芯片内，荧光标记的d n a 探针泵入芯片内进 行杂交，杂交反应后，通过芯片内的加热器移除杂交的探针，再加入另一序列的 d n a 探针进行杂交。和传统的杂交反应相比，此芯片内的杂交反应速度相当快， 只需几秒钟。而另一个报道检测h i v 病毒的芯片将样品处理，杂交等步骤整合在 一起。整个芯片大小和信用卡相当o 。 n a n o g e n e 公司的杂交芯片采用电控方式进行杂交，其具体的做法是在i m m 2 的位点上制作有微电极阵列，其上覆以链亲和素标记的琼脂糖。生物素标记的探 针分子可快速地结合到位于电极上方的琼脂糖上，从而提高了杂交速度。其原理 为：当位于待检位点链亲和素标记的琼脂糖凝胶下方的微电极引入直流正电压 后，溶液中的生物素标记化的探针就可在电场的作用下快速泳动并浓缩结合于该 处。同样的道理，可以使待检的d n a 分子快速浓缩于此，从而有力地杂交反应 迅速进行。杂交完成后，改变电场方向、可将未杂交的样品d n a 从检测位点“洗” 去，选择适当的电场强度就可以使非特异杂交的d n a 与未杂交的探针选择性地 从特定位点分开除去，而保留完全杂交的d n a 分子。由于电场的这种浓缩和选 择特性，使得该方法有很高的灵敏度和特异性，最重要的是它使原来数小时的杂 交反应缩短到1 5 秒。 基于微流道的免疫芯片也有相当的发展，d o d g e 等人将蛋白a 固定在芯片 内检测兔i g gq 鄹。有许多研究报道采用塑性材料制作免疫芯片，塑性材料具有 价格低廉，加工简便等优势，如p d m s ，p m m a 等是常用的塑性材料。e t e s h o l a 1 4 第1 章绪论 等人在p d m s 芯片上研究e l i s a 实验，讨论了固定的方法和封闭的方法。3 乳。s a t o 等人制作多样品处理芯片，可同时处理4 个样品，整个时间在5 0 r a i n 内m 。 1 3 5 微泵 目前，虽然大部分关于芯片的文献报道仍采用传统的注射泵或蠕动泵操纵液 体在微芯片内的流动，但集成化芯片中的微泵研究已有很大的发展，主要有以下 几种类型： 1 ) 机械泵：3 i d h z e n t e 大学用于胰岛素输送的硅微加工的机械泵( 5 6 ) 0 由于硅 加工成本较高，所以近年来也有利用塑性材料制作微机械泵巧”。虽然微机械泵 发展较快，但仍然存在以下的问题：制作工艺复杂，产生的压力较小，体积较大， 消耗的能量较多。不利于芯片的小型化。 2 ) 电渗泵：是微芯片上常用的驱动液体的方式，制作简单，无霈移动的部分。 其原理是样品进入毛细管后，在毛细管两端加高电压，通过电泳和电渗的混和作 用，从而操纵液体的流动。电渗泵一般在1 2 0 0 v c m 时速率为1 m m s ，如j o r g e n s o n 等人报道的电渗泵速率为1 7 m m s ( 5 钔，这可以满足大部分的分析要求。其缺点是 需要高压，在操作时电极直接和液体接触，受毛细管壁所带的电荷，溶液的离子 强度，p h 值等影响很大，因此适用范围较小。 3 ) 其它的泵：如声动泵，常用于微芯片上试剂的混合恬鲫，和电渗泵相比，加工 较复杂，但这种泵受样品的化学性质的影响较小。还有磁力泵循，离心泵嗡 等。 1 3 6微阀 微阀是集成化芯片中控制液体流动和试剂混合的重要元件。近年来也有采用 表面张力或毛细作用制作被动闽( p a s s i v ev a l v e ) 。这种方法有利于微阀在芯片 内的集成。 1 3 7 集成化芯片 上述单独组件在应用中尚不完善，d n a 分析需要这些分立器件相连接集成 第1 壹绪诠 目前尚没有种好的微平台来支撑；另外大部分功能组件需要外部的光学读出装 置，而限制在实验室环境下应用，并且增加了分析费用