拈抗细菌对烟草黑胫病的防治效果研究.doc

拈抗细菌对烟草黑胫病的防治效果研究 李祝，万科，丛铭，张传萍，施渺筱 （贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵阳；贵州省安顺学院农学院，贵州安顺） 摘要：采用温室盆栽试验测试株芽孢杆菌属生防细菌对烟草黑胫病的拮抗作用。结果表明，拮抗细菌芽孢杆菌对苗期烟草黑胫病有较稳定的防治效果，其分泌物还有促进烟株生长的作用，经鉴定菌株为蜡样芽孢杆菌（）。 关键词：拮抗细菌；烟草黑胫病；盆栽试验 ：A：0439114（15）051094-03 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.016 ： 基金项目：贵州省科学技术厅、安顺市人民政府、安顺学院联合科技基金项目（黔科合字号）；毕节市烟草公司项目 作者简介：李祝（），女，贵州毕节人，教授，博士，主要从事农业微生物学研究，（电话）（电子信箱）。 烟草黑胫病.（）俗称烂腰病、黑根病，是一种常见的土传真菌病害。烟草黑胫病在苗床及大田中均可发生，尤其是在高温高湿、多雨年份及低洼地区，该病发展蔓延快，在周内可造成整块烟田毁灭，导致绝收，。随着生物技术的发展和相关研究的深入，生物防治成为烟草黑胫病的研究重点，特别是在利用有益微生物进行病害防治等方面。本研究对筛选出来的株生防细菌进行盆栽防效试验，以研究其对烟草黑胫病的拮抗作用。 材料与方法 材料 烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉（）由贵州大学生命科学院真菌资源研究室提供。拮抗细菌为芽孢杆菌、菌株。烟草品种为毕纳号。 盆栽试验方法 烟草育苗采用漂浮育苗法，育苗前将浮盘和盛水方盘进行消毒，检查盘孔是否堵塞，用松散基质填满孔穴，用手指轻微下压至有实落感，约下压，然后装满刮平露出盘面孔格，每孔播种毕纳1号种子粒，播种后不再盖基质，立即放入盛有适量水的方盘内。待出苗具备片真叶时即可进行间苗，确保每孔内有1株均匀一致的烟苗。在烟苗已具有叶心，苗高时剪叶，剪去超过盘孔的根系控制大苗生长，促使小苗生长。后期剪叶两次，促进茎部的生长，达到炼苗的目的。移栽，每盆株，后进行处理。 烟草疫霉孢子悬浮液的制备利用已分离出的烟草疫霉菌菌株，参照烟草疫霉孢子悬浮液制备方法制备烟草疫霉孢子悬浮液，孢子浓度为个。 拮抗细菌接种物的制备在平板上将分离得到的拮抗菌株、和活化，取两环活化的培养物分别接入盛有培养液的三角瓶中，、培养，得到拮抗菌株悬浮液。 接种方法病原菌接种采用王丽珍的方法，将烟草疫霉孢子悬浮液灌根接种于烟株根部土壤中。拮抗细菌采用灌根接种法，将已经制备好的浓度为个拮抗菌发酵液灌根，接种于烟株根部土壤中。选择长势大小相近，苗龄的烟苗，移栽到盆内，每盆株，移栽后接种，试验设个处理，每个处理株，设次重复。处理组：在烟株移栽后，首先接种拮抗菌发酵液，后再接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（个）；处理组：在烟株移栽后同时接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（个）和拮抗菌发酵液；处理组：在烟株移栽后，首先接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（个），后再接种拮抗菌发酵液；发病对照组：在烟株移栽后只接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（个），不接种拮抗菌；拮抗菌对照组：在烟株移栽后接种拮抗菌发酵液，不接种病原菌；空白对照组：在烟株移栽后接种清水。 小区试验 在贵州省毕节市黔西县进行田间试验，所有试验小区的栽培条件均匀一致，试验期间管理按照常规进行，拮抗菌田间药效试验小区按随机排列的方式进行。 施药方法在烟株移栽前采用拮抗菌发酵液喷洒方式施用到土壤中，移栽后拮抗菌以灌根的方式接种到烟株根部。选用生产中常用的器械，菌种发酵采用泰斯特型培养箱，记录所用器械的类型和操作条件的全部资料。菌种的施用应保证接种量准确，分布均匀。接种量偏差超过的要记录。第一次接种在烟株移栽前，烟株移栽后每隔接种次，共接种次，记录每次接种的日期和作物生育期。分别配置菌悬液浓度为、个的菌株制剂，每株接种。设阳性药对照处理，在烟株移栽前接种甲霜灵锰锌可湿性粉剂（）喷淋茎基部。每处理设次重复，每个小区面积为，随机区组排列，小区间筑埂隔离，以防药液串流。 调查、记录和测量方法接种前调查次，分别在施药后、各调查次。病害分级标准按国家行业标准-规定执行。病情分级标准如下：级，全株无病；级，茎部病斑不超过茎围的或以下，叶轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；级，茎部病斑超过茎围的或以上叶片凋萎；级，茎部病斑环绕茎围或以上叶片凋萎；级，病株全叶凋萎或枯死。目测法调查记录拮抗菌对目标病原菌的拮抗效果，同时记录对作物有益的影响（如加速成熟、增加活力等）。药效按公式（）和（）计算。 式中，对照病指为空白对照区接菌后的病情指数；处理病指为拮抗试验区接种拮抗菌后的病情指数。 拮抗细菌对烟株生长的影响以烟株生长后期为观测样本，每处理随机选择株，分别测量其株高、节距、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数等指标。对各处理的促生效果采用数据处理系统进行检验。 结果与分析 拮抗细菌盆栽防效的筛选 通过盆栽试验，接种后，分别对各个处理进行调查。空白对照、拮抗菌对照和处理组均未发病，而发病对照、处理组和处理组中的烟株已陆续发病，处理组中的有些烟株发病级数也从级达到了级。 烟苗移栽时，拮抗菌对照长势良好（表）；处理组中发病指数都相对较低，各菌株的防效都达到了.00以上，尤其菌株相对防效达到了；处理组中、菌株处理的烟株发病指数相对较高，而经和菌株处理的烟苗生长良好，尤其菌株相对防效达到了；处理组中发病指数相对较高，、菌株处理的烟株相对防效在.00以下，只有菌株的相对防效达到了。由此可见，菌株对病原菌不仅有预防效果，还有较好的治疗和钝化作用。因此，选取菌株进行浓度筛选试验。 菌株的小区试验 为了更充分地说明菌株对烟草黑胫病的防效及掌握菌株的施用量，以甲霜灵锰锌可湿性粉剂为阳性对照药，将菌株设计了个菌悬液浓度梯度，采用随机区组排列方法，进行了药筛试验，结果见表。防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加，当菌悬液浓度达到个时，相对防效就达到了，优于化学药剂甲霜灵锰锌的防效（），当菌悬液浓度达到个时，田间相对防效达到了。可见菌株对于烟草黑胫病的防治效果是稳定的。 菌株对烟草植株生长的影响 小区试验中观察菌株不同菌悬液浓度对烟草植株的生长情况（表）表明，与对照相比，不同浓度的菌悬液对烟草植株的生长均有不同程度的影响，其中当菌株菌悬液浓度达到个时，表现尤为突出，与对照药甲霜灵锰锌可湿性粉剂相比，株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了、；而与对照相比，株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了、。由此可见，菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。 菌株的种类鉴定 将菌株接种在普通琼脂平板上，培养，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，直径达，边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素，为革兰氏阳性细菌，杆状，成链，具有运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显，能耐受，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考伯杰细菌鉴定手册（第八版）、常见细菌系统鉴定手册和芽孢杆菌属，初步鉴定为芽孢杆菌属。将菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，、培养，离心收集菌体。采用上海生工生物工程股份有限公司生产的柱式基因组抽提试剂盒（细菌）提取基因组。以提取到的为模板，用正向引物（）和反向引物（）对菌株的基因进行扩增。扩增条件为：；，个循环；终延伸，停止。产物送上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为。测序结果在中与相似性为。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌（）。 小结与讨论 本试验在对筛选出来的、株生防细菌进行盆栽防效试验的过程中，发现菌株对烟草黑胫病具有较稳定的防治效果，防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加。且菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。经鉴定菌株为蜡样芽孢杆菌（）。对于菌株抑制烟草黑胫病的生理机制，尚待进一步研究。 参考文献： 王万能，肖崇刚烟草黑胫病的综合防治及其研究进展广西农业科学，（）： 王静，孔凡玉烟草黑胫病综合防治技术烟草科技，（）： 王万能，全学军，肖崇刚烟草内生细菌对烟草病害的拮抗和防治作用烟草科技，（）： 王万能，全学军，肖崇刚烟草内生细菌防治烟草黑胫病及促生作用研究植物学通报，（）： 赵蕾，梁元存，刘延荣壳聚糖对烟草抗