不同产地重楼的HPLC指纹图谱研究.doc

不同产地重楼的HPLC指纹图谱研究 宋九华，成英，刘凡，万东海，谢孔平，刘素君 （乐山师范学院化学学院/峨眉山生物资源实验室，四川乐山614004） 摘要：采用SepaxGpC18（150mm46mm，5m）色谱柱，以乙腈005磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速10mL/min，柱温30，检测波长210nm，以此测试条件分别测定了云南、四川、贵州、甘肃省出产的10批重楼（RhizomaParidis）药材样品HPLC色谱图，以重楼HPLC7号色谱峰为参照物，按照重楼HPLC指纹图谱共有模式，建立了4个不同省产地10批重楼的HPLC指纹图谱。通过相似度分析、聚类分析和主成分分析方法，对不同产地重楼进行鉴别研究。结果表明，10批重楼可以分为两大类，甘肃省的重楼单独为一类，其他3个省产地的重楼聚为另一类。同时该HPLC指纹图谱检测方法简便快捷、重现性好，可用于重楼质量控制，能够实现对重楼产地的初步鉴别。 关键词：重楼（rhizomaparidis）；hplc指纹图谱；相似度分析；聚类分析；主成分分析 ：Q94971823；R2841；O21：A：04398114（xx）061407-05 DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.06.032 HPLCFingerprintsofRhizomaParidisfromDifferentHabitats SONGJiuhua，CHENGYing，LIUFan，WANDonghai，XIEKongping，LIUSujun （SchoolofChemistry/MountEmeiBiologicalResourcesLaboratory，LeshanNormalCollege，Leshan614004，Sichuan，China） Abstract：SepaxGpC18（150mm46mm，5m）columnwasusedtoestablishHPLCfingerprintsoftenbatchesofRhizomaParidisfromfourdifferenthabitats.Themobilephasewasacetonitrile-phosphoricacidwithgradientelutionataflowrateof10mL/minThecolumntemperaturewassetat30.Detectionwavelengthwas210nmAordingtoHPLCfingerprintpatternsoftheRhizomaParidis，No7peakwaschosenastheinternalreferencepeak，Hierarchicalclusteranalysis，similarityanalysisandprincipalponentanalysiswereusedtoidentifyRhizomaParidisfromdifferentregionsResultsshowedthat10batchesofRhizomaParidisweredividedintotwocategoriesincludingRhizomaParidisfromGansuprovinceandtheotherthreeoriginofRhizomaParidisTheHPLCfingerprintwassimple，reproducibleandcanbeusedforcontrollingpolyphyllaqualityanddetermingtheoriginofRhizomaParidis Keywords：RhizomaParidis；HPLCfingerprint；similarityanalysis；hierarchicalclusteranalysis；principalponentanalysis ：xx0924 基金项目：乐山市科学研究计划项目（13NZD101） 作者简介：宋九华（1974），女，四川仁寿人，在读博士研究生，研究方向为药用植物资源评价及次生代谢产物，（电话电子信箱） songjh12163；通信作者，刘素君，教授，从事天然产物研究，（电子信箱）zhouliuruixx163。 重楼（RhizomaParidis）为百合科（Liliaceae）重楼属（ParisL）植物云南重楼PpolyphyllaSmithvaryunnanensis（Franch）HandMazz或七叶一枝花PpolyphyllaSmithvarchinensis（Franch）Hara等植物的干燥根1。重楼属植物种类繁多，我国有19种、10个变种，其根茎均可入药，主产于云南、贵州、四川、广西等省（自治区）2。重楼属是多年生草本植物，根状茎肉质，呈团块状圆柱形；作为中药材，其药用在中国有着悠久的历史，自古以来就有许多关于它的记载。重楼性微寒，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等病症3，是著名中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁等的主要组分。现代药理研究结果表明，重楼具有抗肿瘤35、免疫调节、止血、治疗心血管疾病等广泛的药理活性6，7，因而极具研发价值，并受到广泛关注。 近年来随着对重楼需求量的急剧增加，野生重楼基源植物被大肆采挖，使得重楼资源日渐枯竭，逐渐成为濒临消亡的珍稀物种；同时市场上假重楼也不断出现。为了扩大重楼药用基源，试验采用HPLC指纹图谱法，对国内4个不同省产区的10批重楼进行质量分析，通过指纹图谱相似度比较和聚类分析等方法区分不同产区重楼，从而更科学地全面评价不同地重楼药材的质量及其真伪，为重楼的深入研究及其应用提供样品鉴定和指纹信息，并为其质量控制和扩大药用基源提供客观依据。 1材料与方法 11材料 111中药材料试验共选取了云南、四川、甘肃及贵州省出产的共10批重楼药材样品，其样品编号、地见表1。将不同产地的重楼药材清洗干净，于35烘干，粉碎后过60目筛，制成重楼药材粉末，备用。 112试剂乙醇、甲醇和乙腈为色谱纯；磷酸等其他试剂均为分析纯；水为超纯水（自制）。 113仪器主要有LCxxA型高效液相色谱仪配紫外检测器、四元泵溶剂淋洗系统和CLASSVP色谱工作站（日本岛津公司）；MettlerAE200型电子分析天平梅特勒托利多（上海）有限公司；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 12试验条件选择 121提取溶剂称取S1重楼药材粉末05g，取4份，各置于具塞锥形瓶中，分别加入25mL的乙醇、甲醇、70甲醇、70乙醇，都各自称定重量（W），浸泡12h后超声提取60min，放冷后再次称重量，分别用乙醇、甲醇、70甲醇、70乙醇对应补足减少的重量至W，过滤，将滤液水浴挥干，用甲醇溶解，并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，用045m的微孔滤膜过滤。然后用210nm作为测定波长；色谱条件是色谱柱：SepaxGpC18（150mm46mm，5m），流动相：乙腈（A）和005磷酸（B）；洗脱程序：020min，2A；2040min，25A；4080min，521A；流速1mL/min，柱温30，进样量20L；通过色谱分析确定提取溶剂类型。 122提取方法以往重楼药材中活性成分的提取方法主要有加热回流提取法和超声提取法，试验参照文献8，9分别设置了加热回流提取、直接超声提取和浸泡12h后超声提取3种提取方法，即在加入提取溶剂后，用这3种方法分别提取、再进行“121”的后续试验，通过色谱分析比较各方法的适合与否。 123色谱分析的波长分别在203、210、220、240nm波长处对S1样品进行测定，比较各处理波长对色谱分析结果的影响，从而确定试验的测定波长参数。 124色谱流动相分别考察甲醇水，乙腈水，乙腈005磷酸溶液，甲醇乙腈水各流动相系统对色谱分析结果的影响，从而确定试验的流动相取舍。 13供试品溶液制备 称取各重楼药材样品粉末05g，都置具塞锥形瓶中，加入25mL70乙醇，称定重量（W1），浸泡12h后超声提取60min，放冷后再次称重量，用乙醇补足减少的重量至W1，过滤，将滤液水浴挥干，用甲醇溶解，并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，用045m的微孔滤膜过滤，即作为供试品溶液。 14色谱条件 色谱柱：SepaxGpC18（150mm46mm，5m）；流动相：乙腈（A）和005磷酸（B）；洗脱程序：020min，2A；2040min，25A；4080min，521A；流速1mL/min，柱温30，进样量20L，检测波长210nm。 15方法学考察 151稳定性试验取S1样品供试溶液，在24h内每4h测定1次，重复6次；以峰值最高的峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD），以考察试验方法的稳定性能。 152精密度试验取S1样品供试溶液，连续进样6次，记录100min内的图谱。以峰值最高的峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD），以考察试验方法的精密程度。 153重复性试验取S1样品，按供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，再测定指纹图谱，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD），以考察试验方法的重复性能。 16指纹图谱的数据处理 161相似度分析分别将10批重楼样品的色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（xxA国家药典委员会）软件里，以生成的特征指纹图谱共有模式为对照，计算各批次样品的相似度，考察色谱峰的一致性。 162系统聚类分析聚类分析能够揭示样品之间的关系，继而对样品进行分类，从而能提供的图谱信息比较多，可作为中药指纹图谱应用于质量控制的补充，这将在中药材质量控制及综合评价分析中发挥作用。试验采用SPSS190统计软件，以相对峰面积为变量，对不同产地的10批重楼药材做聚类谱系图，进行聚类分析。 163主成分分析采用SIMCAP110软件，以10批重楼中7个共有峰为变量进行主成分分析，其中前两个主成分的权重分别占总变异量的552和345（共计897），取前2个主成分绘制主成分二维图，以第一主成分值为横坐标、第二主成分值为纵坐标作散点图。 2结果与分析 21试验条件的确定 211提取溶剂在乙醇、甲醇、70甲醇、70乙醇4个溶剂的色谱分析结果中，以采用70乙醇提取的色谱峰数目较多，效果较好，所以试验采用70乙醇作为试验的提取溶剂。 212提取方法在加热回流提取，直接超声提取和浸泡12h后超声提取3种提取方法的色谱分析结果中，发现加热回流提取和浸泡12h后超声提取方法能够取得相同的效果，而且浸泡后超声提取法更方便、安全。故选择浸泡12h后超声提取法作为试验的提取方法。 213色谱分析的波长在203、210、220、240nm4个波长的色谱分析比较试验里，发现波长在203nm处的基线漂移较严重；在210nm处的基线稍稳定，色谱峰较多，峰信号较强；而在220、240nm处的基线虽然更平稳，但峰个数较少，峰信号较弱。故确定210nm作为试验的测定波长。 214色谱流动相在甲醇水，乙腈水，乙腈005磷酸溶液，甲醇乙腈水3个流动相的色谱分析比较试验里，发现乙腈005磷酸溶液作为流动相的各峰达到分离效果，色谱峰形较好，并且经过多次反复试验得出了较理想的二元梯度洗脱条件，所以选择乙腈005磷酸溶液作为试验的流动相。 22重楼指纹图谱的建立 分别取不同产地的重楼样品S1S10制成供试品溶液，按选定的测试条件，测定所有供试品的HPLC色谱图（指纹图谱），结果见图1。从图1可见，HPLC色谱图得到了若干个色谱峰，其中7号峰为重楼的主要指标成分，因其在重楼中的含量较高且相对稳定，故将其作为参比峰。将各色谱峰保留时间与同一图谱中参比峰保留时间的比值作为各色谱峰的相对保留时间；以相对保留时间定性，得到7个共有峰，共有峰的相对保留时间统计结果见表2，共有峰的相对峰面积统计结果见表3。从图1、表2、表3可知，不同产地的重楼指纹图谱存在较大的差异，其共有峰相对保留时间基本一致，但相对峰面积存在很大的不同，表明不同产地的重楼质量之间存在相当的差异，这与文献报道的结果一致10。 23方法学评价 231稳定性在试验条件下按稳定性试验评价方法测定重楼样品S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果S1各色谱峰相对保留时间的RSD均小于319、相对峰面积的RSD均小于401，S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD都小于5，说明供试品在测定的24h内保持稳定，显示出试验采用的方法使样品的稳定性良好。 232精密度在试验条件下按精密度试验评价方法测定重楼样品S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果S1各色谱峰相对保留时间的RSD均小于303、相对峰面积的RSD均小于399，S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD都小于5，说明试验采用的供试品进样精密度良好。 233重复性在试验条件下按重复性试验评价方法测定重楼样品S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果S1各色谱峰相对保留时间的RSD均小于255、相对峰面积的RSD均小于407，S1的色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD都小于5，表明试验采用的方法其重复性较好。 以上结果表明，试验得到的重楼HPLC指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研究的技术要求。 24指纹图谱的数据分析 241相似度分析在中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件中计算10批重楼样品的相似度，结果显示，S1的相似度为0968、S2为0922、S3为0589、S4为0887、S5为0836、S6为0876、S7为0564、S8为0823、S9为0678、S10为0808。这个结果表明，10个不同产地的重楼总体上相似度较高，只有甘肃省的兰州市、天水市重楼样品（S3、S7）的相似度较低，说明兰州市、天水市所产重楼在特征指纹色谱峰的相对大小及非共有峰上与其他产地之间还存在明显差别，也反映出不同产地的重楼受当地土壤、气候和生态环境等的影响较大。 242系统聚类分析10批重楼样品的聚类谱系图见图2。从图2可见，10批重楼可分为两大类，甘肃省的2个重楼样品（S3、S7）可聚为一类，其他3省（云南、四川、贵州省）的8个重楼样品可聚为另一大类。并且同一产地的重楼其样品间的距离比较近，如贵州省的S5和S6、甘肃省的S3和S7其样品间的距离都非常接近，云南省的S1、S4、S8、S104个样品间的距离比较近，说明贵州、甘肃、云南省的重楼质量比较稳定；而四川省的S2、S9样品间距离偏远，说明四川省的重楼间质量差异较大，没有明显的地域特征。在不同产地方面，甘肃省所产重楼与其他产地的重楼距离最远，说明甘肃省的重楼与其他产地的重楼具有明显的区别，在化学成分上差异较大。贵州省的重楼（S5、S6）与云南省的重楼距离较近，但也能够区分开，说明聚类分析的结果能够实现对重楼产地的初步判断。 243主成分分析采用SIMCAP110软件进行主成分分析得到的结果见图3。由图3可知，10批重楼根据距离远近可分为2个大区域，甘肃省的重楼S3和S7分布在第一主成分轴的靠左边，与其他产地（云南，四川和贵州省）的重楼偏离较远，可视为一类；其他3个产地的重楼之间相距较近，可视为另一大类，这与前面聚类分析的结果是一致的。 3讨论 通过对云南、四川、贵州、甘肃4省10批的重楼HPLC色谱图进行比较研究，发现不同产地的重楼整体色谱峰峰形相似、相似度较高。但一些样品在特征指纹色谱峰的相对大小及非共有峰上还存在明显差异，说明不同产地的重楼受产地、气候和生态环境等的影响较大；因此，为了保证中药材、中药生产中间体、中药制剂等质量