（生物化学与分子生物学专业论文）铜胁迫下微紫青霉菌菌株gxcr代谢谱分析.pdf

广西大学学位论姗惟声明和使脓权嬲嬲必 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 2 四年7 月日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 击口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：溯巳纽 导师签名： 呵年7 月f 日 巍去 i 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 摘要 重金属胁迫是限制微生物生长的重要因素之一。微生物对重金属胁迫 响应的研究多采用转录组学和蛋白质组学的方法，然而转录组学和蛋白质 组学技术并不能完整诠释生化反应的代谢网络。因此，复杂的胁迫响应途 径还有待确定，尤其是代谢水平。 本课题研究了在铜胁迫下，微紫青霉菌菌株g x c r 的时间过程代谢 谱差异。利用气质联用技术( g c m s ) ，分析了在5m m 硫酸铜胁迫处理下 2 4 ，4 8 ，7 2 和恢复7 2 小时的微紫青霉菌菌株g x c r 胞内的极性代谢产物， 共鉴定出4 1 种极性代谢产物，其中包括氨基酸，有机酸，糖类和糖醇。 将气相色谱原始积分数据转化成数据矩阵集，用于随后的包括t 检验， 聚类分析( h c a ) 和主成分分析( p c a ) 的数据分析。数据分析结果表明对照 和处理之间代谢物水平存在明显差异。t 检验结果表明，有多种代谢物对 铜胁迫有响应，例如果糖、葡萄糖、赤藓糖醇、肌醇、亚油酸和肌醇五磷 酸。 关键词：代谢谱分析微紫青霉菌铜胁迫g c m s a b s t r a c t h e a v ym e t a l s t r e s si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r s l i m i t i n g m i c r o o r g a n i s mc u l t i v a t i o n m a n yi n v e s t i g a t i o n so fm i c r o o r g a n i s mr e s p o n s et o h e a v ym e t a l c o n t a i n i n ge n v i r o n m e n th a v eb e e np e r f o r m e du s i n gc o n v e n t i o n a l t r a n s c r i p t o m i c sa n dp r o t e o m i c sa p p r o a c h e s h o w e v e r ，t r a n s c r i p t o m i c sa n d p r o t e o m i c st e c h n i q u e sa r en o ta l l e n c o m p a s s i n gm e t h o d st h a t c a na c h i e v e e x c l u s i v ei n s i g h t si n t ot h em e t a b o l i t en e t w o r k sc o n t r i b u t i n gt ob i o c h e m i c a l r e a c t i o n s h e n c e ，t h ef u n c t i o n so ft h ec o m p l e xs t r e s sr e s p o n s ep a t h w a y sa r e y e tt ob ed e t e r m i n e d ，e s p e c i a l l ya tt h em e t a b o l i cl e v e l at i m e - c o u r s em e t a b o l i t ep r o f i l i n go fp e n i c i l l i u mj a n t h i n e l l u ms t r a i n g x c ru n d e rt h ec o p p e r a d d e dc o n d i t i o n si sr e p o r t e di nt h i ss t u d y a n a l y s e s o fi n t r a c e l l u l a r p o l a rm e t a b o l i t e so fp j a n t h i n e l l u ms t r a i ng x c rw a s p e r f o r m e db yg a sc h r o m a t o g r a p h yc o u p l e dt om a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) a t 2 4 ，4 8 ，7 2a n dr e c o v e r y7 2 ha f t e rac o p p e rs t r e s st r e a t m e n tw i t h5m mc u s 0 4 b e i n gt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n ，a n d4 4p o l a rm e t a b o l i t e sc o u l db ei d e n t i f i e d l i ， s u c ha sa m i n o a c i d s ，o r g a n i ca c i d s ，s u g a r s a n d p o l y o l s t h e g a s c h r o m a t o g r a p h i cd a t a w e r ec o n v e n e di n t om a t r i xd a t as e t s ，w h i c hw e r e s u b je c t e dt o d a t am i n i n gp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gs t u d e n tt - t e s t ，h i e r a r c h i c a l c l u s t e ra n a l y s i s ( h c a ) a n dp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) t h em i n i n g r e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e r ei sas i g n i f i c a n td i f f e r e n to ft h em e t a b o l i t el e v e l b e t w e e nt h ec o n t r o la n dt h et r e a t m e n t t h es t u d e n tt - t e s tr e s u l t si n d i c a t et h a t t h e r ea les om a n ym e t a b o l i t e sw h i c hc a nr e s p o n dt oc o p p e rs t r e s s ，s u c ha s f r u c t o s e ， g l u c o s e ，e r y t h r i t o l ，m y o i n o s i t o l ，l i n o l e i c a c i da n d m y o i n o s i t o l - 5 - p h o s p h a t e k e yw o r d ：m e t a b o l i t e p r o f i l i n g ；p e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m ；c o p p e rs t r e s s ； g c m s i i i 目录 第一章前言1 1 1 微生物与重金属间的相互作用1 1 1 1 重金属与微生物的生长代谢1 1 1 2 重金属对微生物的毒害性1 1 2 微生物对重金属的抗性机制2 1 2 1 生物吸附、胞外络合和沉淀作用2 1 2 2 细胞膜通透性及金属的胞内运输3 1 2 3 细胞内隔绝作用和解毒作用3 1 2 4 金属的转化作用4 1 3 代谢组学及其在微生物领域的应用4 1 3 1 代谢组学与代谢谱分析4 1 3 2 代谢组学的分析流程6 1 3 3 样品的制备6 1 3 4 代谢组学研究的技术平台7 1 3 4 1 气相色谱和质谱联用技术8 1 3 4 2 液相色谱和质谱联用技术8 1 3 4 3 核磁共振技术9 1 3 5 数据的分析与解释9 1 3 5 1 原始数据的预处理9 1 3 5 2 非监督方法1 0 1 3 5 3 有监督方法1 1 1 3 5 4 网上数据库1 1 1 3 6 代谢组学在微生物领域的应用1 1 1 3 6 1 微生物分类及功能基因研究1 2 1 3 6 2 代谢工程和发酵工艺的优化：1 2 1 3 6 3 环境微生物研究13 1 3 7 代谢组学与微生物重金属抗性机制研究1 3 1 4 本研究的目的和意义1 4 第二章材料与方法15 2 1 材料15 2 1 1 菌株15 2 1 2 培养基15 i v 2 1 3 使用的试剂15 2 1 4 仪器与设备- 1 6 2 1 5 试剂配制一1 6 2 2 方法一1 7 - 2 2 1 微紫青霉菌菌株g x c r 的铜胁迫处理1 7 2 2 1 1 真菌孢子悬液的制备1 7 2 2 1 2 菌丝体的培养1 7 2 2 1 3 菌丝体的收集1 7 2 2 2 极性代谢物的提取18 2 2 3 提取物的衍生化18 2 2 4 气相色谱和质谱联用检测1 8 2 2 4 1 色谱条件18 2 2 4 2 质谱条件1 9 2 2 5 代谢物鉴定1 9 2 2 6 数据分析1 9 第三章结果与分析2 0 3 1 代谢物鉴定2 0 3 2 微紫青霉菌菌株g x c r 铜胁迫下代谢谱分析2 卜 3 3 系统聚类分析2 3 3 4 主成分分析2 5 第四章讨论与结论2 8 4 1 样品制备及数据采集2 8 4 2 与铜胁迫重要相关代谢物2 9 4 2 1 糖类2 9 4 2 2 亚油酸3 0 4 2 3 肌醇和肌醇五磷酸3 0 4 3 结论3 2 参考文献3 3 致谢4 4 攻读学位期间论文发表情况4 5 v 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 第一章前言 1 1 微生物与重金属问的相互作用 1 1 1 重金属与微生物的生长代谢 重金属指密度超过s g e m 3 的金属元素，另外过渡元素( 如a s 、z r 、s b 、l a 、p o 等) ， 稀土元素和锕族元素也被划分到重金属的范畴中，自然界中存在的9 0 种元素，有5 3 种 属于重金属【l l 。 重金属在微生物生命活动中扮演着重要角色，c o 、c r 、c u 、f e 、m n 、n i 和z n 等 重金属是微生物生长过程中的必需微量元素，在其痕量水平下可促进微生物的生长， 并通过多种调控机制维持所需重金属在菌体内的动态平衡【2 捌。这些必需重金属元素的 生物功能在于它们是生化反应的催化剂；可以稳定蛋白质结构和细胞壁结构。例如， c u 、f e 、n i 具有电子传递性质，参与呼吸作用和光合作用；c u 是许多金属酶( 如超氧 化物歧化酶，细胞色素c 氧化酶等) 催化的辅因子；z n 是许多酶类的催化中心、蛋白 质结构和d n a 的重要组分h , 5 】。 1 1 2 重金属对微生物的毒害性 高浓度的重金属会对微生物产生毒害作用，它们会抑制微生物生长，甚至导致其 死亡。过量的重金属会置换含硫化合物和氧结合位点上的必要金属，导致核酸和蛋白 质结构的改变，干扰氧化磷酸化和渗透压平衡【6 1 。例如，高浓度的c u 会与细胞的核酸 和酶活性位点结合，造成这些生物大分子的损伤；促进细胞膜脂质过氧化，从而破坏 细胞膜的完整性，导致细胞溶质的泄漏和细胞死亡；并在生物体内产生活性氧簇，改 变微生物细胞内巯基与钙离子的动态平衡【7 1 。又如c d 、h g 、p b 和a s 等非必需重金属元 素，在低浓度条件下就具有很大的毒性，它们可导致d n a 链的断裂，因此对细胞有致 铜胁迫下微舅亭青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 突变的效果，并且抑制蛋白质和核酸等大分子物质的合成，使细胞分裂停止，抑制生 物氧化，还可破坏细胞膜结构，扰乱营养物质的正常运输【引。 1 2 微生物对重金属的抗性机制 重金属环境的选择压力可以导致微生物对重金属的毒害产生抗性系统【9 1 ，重金属 抗性系统可以保护敏感的细胞组分，限制重金属进入和改变细胞组分，降低它们对重 金属的敏感性。目前，对微生物重金属抗性机制有六种假说。不同类型的抗性机制可以 单独或联合发生，对某一种重金属不同的抗性机制可以发生于同种微生物中。 1 2 1 生物吸附、胞外络合和沉淀作用 生物吸附是指微生物利用细胞表面络合结构吸收重金属，研究证明如假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、柠檬酸菌属( c i t r o b a c t e r ) 、黑曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 和酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 等许多微生物都具有吸附重金属的能力【1 0 1 。 生物吸附可分为依赖代谢和不依赖代谢两种形式的生物吸附。微生物通过细胞膜 将重金属运输至细胞内积累，这就依赖与细胞的代谢作用，只发生在活细胞中。不依 赖于代谢作用的生物吸附主要是通过细胞表面的官能团与重金属间的物理化学相互 作用达到吸收重金属的目的。微生物细胞表面的主要成分多糖、蛋白质和脂类等具有 丰富的重金属结合基团，如羧基、羟基、氨基和磷酰基【1 1 】，因此，大多数微生物的表 面携带的都是负电荷，这类型的生物吸附是基于静电相互作用、离子交换和重金属离 子的螯合和络合作用【l2 1 ，不依赖于细胞的代谢作用，并且是相对快速和可逆的。另外， 沉淀作用是微生物利用细胞表面固定重金属，若环境中存在有毒重金属，微生物会通 过代谢产物参与重金属的沉淀过程。有研究表明s t r e p t o m y c e sp i l o s u s 细胞壁肽聚糖的 羧基在结合c u 的过程中起到重要的作用【1 3 】。微生物可以产生有机酸( 如柠檬酸、草 酸、富马酸、乳酸和苹果酸等) ，螯合重金属形成重金属一有机分子。又如，酵母和 柠檬酸细菌属细菌可以产生磷酸盐来固定重金属。酵母等多种微生物可以通过产生硫 化氢等代谢产物固定重金属【6 】。 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 这些抗性机制的结果是通过化合物将有毒重金属固定在细胞表面，以及阻止重金 属离子进入细胞。 1 2 2 细胞膜通透性及金属的胞内运输 重金属对微生物质膜的破坏机制是改变细胞酶系并抑制物质合成位点，从而使菌 体原生质膜发生成分与通透性的改变。有研究者分别通过在培养基中添加不饱和脂肪 酸，以研究酿酒酵母( & c e r m e ) 细胞膜脂肪酸成分与重金属抗性之间的关系，发现 c u 和c d 两种重金属均会导致细胞膜多不饱和脂肪酸成分( 如亚油酸) 的增加，细胞膜 的通透性也随之增大，并伴随着细胞内大量k + 的流出，菌体对这些重金属的敏感性也 因此倍增，由此证明细胞膜成分的变化可改变微生物对重金属的敏感性【1 4 1 。细胞膜多 不饱和脂肪酸的增加所导致的重金属敏感性的改变，是由于细胞脂质过氧化水平提高 所造成的【1 5 】。随后的研究发现，当爱c e r 晰m e 细胞膜的亚油酸增加时，s p 在细胞内 的富集增加，流出量减少u6 1 。 主动运输和排泄系统是重金属抗性系统中一个很大的范畴，微生物对重金属的吸 收与运输分为两种形式，第一种是快速且是底物非特异性的，通过化学渗透梯度使重金 属穿过细胞膜进入细胞内；第二种是较慢的，具有极高底物特异性，且依赖于a t p 的水 解作为能量来源，因此，重金属的胞内运输需依赖于能量和代谢的调控。通常，微生 物在摄取k 、m g 和n a 等必要营养元素的同时，非必要重金属也会一同被吸收，但很快 通过主动运输机制将有毒金属从细胞质中排出【1 7 1 。 1 2 3 细胞内隔绝作用和解毒作用 许多真核微生物细胞可通过“区室化作用 把进入细胞内的重金属离子积累于某 些特殊的细胞器中，并将其转化为低毒的化合物，细胞内隔绝机制对重金属的动态平 衡起着重要作用。& c e r 嘶m e 可将胞内9 0 的m n 2 + 、7 0 的s p 、和6 0 的z n 2 + 积累在 液泡中【l 引。另外研究表明，sc e r 叫b m e 会将过量的z n 累积在液泡中，并结合于多聚磷 酸盐上【1 9 】。 另外，许多微生物可以通过金属硫蛋白和重金属螯和肽等蛋白质( 肽) 催化螯合 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 重金属离子，从而起到降低它们毒害的作用。其中，金属硫蛋白广泛存在于各种生物 体中，具有维持细胞内金属动态平衡和重金属解毒作用的双重机制。研究发现，金属 硫蛋白首先与细胞内的必需重金属元素z n 、c u 等结合，可促进生物体内金属酶的合成， 并通过调节它们在细胞内的浓度，达到维持其在细胞内动态平衡的作用；其次，重金 属进入细胞后可诱导金属硫蛋白的表达，之后，金属硫蛋白会与有毒重金属相结合， 保护敏感的细胞器免受重金属的毒害【2 0 】。 1 2 4 金属的转化作用 某些微生物还可通过氧化、还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属，以改变它 们的价态，从而影响到这些重金属的溶解性、移动性以及生态毒性。如硫一铁杆菌类 ( t h i o b a c i l l u sf e r r o b a c i l l u s ) 等一些自养细菌能使c u + 、f e 2 + 、a s 3 + 和m 0 4 + 等发生氧化， 假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 能氧化f e 2 + 、m n 2 + 和a s 3 + 【2 1 1 。抗汞机制可谓是微生物对重 金属转化最典型的例子之一，这种机制在革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌中都有报 道。有机汞化合物被有机汞裂解酶催化反应生成为h 9 2 + ，随后由细胞质汞还原酶催化， 将汞离子还原成金属汞【2 2 2 3 1 ，反应过程如下所示： i m g x + h + + x 一寻r h + h g x 2 h g ( s r ) 2 + n a d p h + h + = h g ( 0 ) + n a d p + 2 r s h 1 3 代谢组学及其在微生物领域的应用 1 3 1 代谢组学与代谢谱分析 代谢组学( m e t a b o l o m i c s ) 从其定义的提出到发展至今也只有1 0 年的时间【2 4 】，但其 相关研究最早源于上世纪7 0 年代初的基于气相色谱和质谱联用( g c m s ) 技术的综合定 量分析代谢产物，即代谢谱分析( m e t a b o l i t ep r o f i l i n g ) t 2 5 1 。在此后的1 0 年里，代谢谱分 析研究主要集中于对疾病的临床诊断2 每2 9 1 。到8 0 年代，高效液相色谱( h p l c ) 和核磁共 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 振技术( n m r ) 等技术也开始被应用于代谢谱分析研究中。9 0 年代以后，代谢谱分析技 术继续平稳发展，生物体内的药物代谢等方面成为研究的主要内割3 0 】。 近年来，随着拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 等生物的基因组测序完成后，生命科学 的研究重点集中于基因功能和几个“组学 ( o m i t s ) 研究，其中包括研究特定组织或 细胞内转录水平上基因表达差异的转录组学( t r a n s c r i p t o m i c s ) ，研究基因组表达过程中 产生的所有蛋白质及其功能的蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 。综合应用这些组学资源进行生 物学的研究就要求拥有强大的表型平台，其中就包括系统分析生物组织内所有代谢组 分【3 1 1 ，在此背景下，代谢组学研究应运而生【3 2 】。2 0 0 0 年，f i e h n 等以拟南芥叶片提取 物为研究对象，进行了基于气质联用( g c m s ) 的代谢组学分析，其结果表明代谢组学 可成为功能基因组研究的一个强有力研究方法【3 3 1 。现在，代谢组学已成为系统生物 学研究不可分割的一部分【3 4 1 ，并在今后的研究工作中发挥重要的作用【3 5 1 。 目前，根据具体研究对象和目的的不同，可将代谢物分析分为四个水平，它们分别是代谢物 靶标分析、代谢谱分析、代谢组学和代谢指纹分析3 3 3 6 翮。 ( 1 ) 靶标分析( t a r g e ta n a l y s i s ) 靶标分析是代谢组学种发展最为完善的方法，用于有限个数已知代谢物的精确定 量。靶标分析是真正的定量测定方法，对于已知代谢物可以达到很低的检测限【3 8 】。因 此，可直接研究某遗传变化所带来的主要影响，也可以用于构建依赖于某靶标代谢物 的高通量模型。实施靶标分析时必须明确靶标代谢物的化学结构，要求改进分析方法 以适于对样品浓度进行检测，并且对待测定得靶标化合物可以有效纯化，以上的要求 也为靶标分析提出了不小的挑战。目前仍有许多代谢物是现有的分析技术所无法鉴定 的，未来随着技术的发展，会有越来越多的代谢物被鉴定和纯化，这就有利于它们的 定量分析，靶标分析将日益成为为研究生物整体代谢变化提供定量数据的有效手段。 ( 2 ) 代谢谱分析( m e t a b o l i t ep r o f i l i n g ) 代谢谱分析是检测生物样品代谢物水平的方法，其操作可对数种预设的靶标的进 行定性定量分析，如一类结构性质相关的化合物( 糖类、氨基酸、有机酸) ，或某一 代谢途径中的所有产物或多条代谢途径的标志性代谢物，但现在其数量可达到几百 种，甚至是潜在的几千种。它可阐明一条代谢途径或多条相交代谢途径的功能，且不 需要考虑某一遗传变化在所有代谢分支上的影响。样品的预处理和检测可针对一类预 设靶标化合物的化学性质，利用相应的技术来完成。代谢谱分析被应用于生物液( 如 尿液) 的常规检测，以对疾病进行筛选和临床诊断，最近，研究人员更加关注于代谢 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 谱分析在功能基因组学上的应用。 ( 3 ) 代谢组学( m e t a b o l o m i c s ) 表面上不相关的生物化学途径的代谢物水平因多效应而改变，为了解这些效应就 要求无偏差、全面定性和定量分析生物系统中所有代谢物，用于阐明生物系统代谢物 组的方法就是代谢组学。进行代谢组学研究时，样品的预处理和检测技术必须满足对 所有的代谢组分具有高灵敏度、高选择性、高通量、广泛的适用性和基体干扰小的要 求。代谢组学所产生的数据集相当复杂，因此需要强有力的工具进行处理，储存，标 准化和评估获得的数据，以便于描述生物系统的系统性响应。另外，真正的代谢组学 方法还包括对未知代谢物的鉴定，对应分析结果提出代谢网络理论模型。 ( 4 ) 代谢指纹分析( m e t a b o l i cf i n g e r p r i n t i n g ) 代谢指纹分析并不是尝试对样品中所有代谢物进行精确定量，而是对特殊生物组 织样品粗提代谢物进行高通量快速分类。模式识别工具可用于分类鉴定特殊指纹的特 征。代谢指纹分析可应用于生物标记的发现和疾病的临床快速诊断。 1 3 2 代谢组学的分析流程 完整的代谢组学分析流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析等步骤，样 品的制备主要是对生物样品进行收集、生物反应灭活和预处理，接着，通过相应的分 析技术对样品中的代谢物进行综合广泛的分离分析，以上步骤的最终结果是产生原始 代谢组数据。数据分析是通过生物统计学方法和生物信息学对所获得的数据进行降维 和生物信息的挖掘，以揭示生物体对遗传、环境改变的系统响应，甚至可以获得到新 的代谢物和代谢途径，并结合数据分析结果构建代谢网络模型。 1 3 3 样品的制备 取样、匀浆、提取和保存等是生物代谢物样品制备的基本步骤。对代谢物的提取 有以下要求，首先是对细胞内代谢产物提取与制备应尽可能遵循非选择性和综合广泛 的原则，其次是在提取过程中可以持续停止酶的活性以防止代谢物的降解。 取样要求对生物样品内的生物反应进行快速灭活，可采用冷冻压制、液氮冷冻和 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 使用高氯酸或硝酸进行酸处理等方法【3 9 1 ，且在取样及样品制备过程中所使用的设备也 需进行低温处理【4 0 。4 2 。生物反应灭活方法直接影响着代谢物的提取率，有报道指出， 使用5 8 、6 0 的甲醇对多种细菌进行灭活，可导致过半的代谢物流失【4 3 】。此外， 由于真核和原核生物的细胞壁和膜结构存在差异，真核生物灭活过程中，由有机溶剂 引起的代谢产物泄漏不及原核生物严重m 4 5 1 。近期研究发现，使用冷甘油与氯化钠的 混合溶液进行猝灭处理的效果比常用的甲醇与水的混合溶液更为理想4 6 1 。 常用的匀浆化方法有：将样品用液氮在研钵中磨成粉末，用预冷的球磨机研磨【4 7 1 ， 或使用分散机将样品与提取溶剂一同匀浆【4 引。匀浆化后就可进行代谢物的提取，代谢 物通常用水或有机溶剂甲醇、氯仿等分提取，以分别获得极性和非极性代谢物，以便 分别进行分析。通过实验证明，甲醇无疑是到目前为止微生物代谢组学分析中最佳的 有机提取溶剂 4 9 , 5 0 ，4 8 、6 0 的冷甲醇溶液既是最适当的生物反应灭活剂，也是 最佳提取溶剂【5 1 , 5 2 】。近年来，如超声波辅助萃酬5 3 1 、超临界流体萃取【5 钔、固相萃取【5 5 】 和固相微萃取【5 6 】等一些比较新的萃取技术，在微生物代谢物的研究中也有开始得到应 用。另外，当样品中含有少数高浓度代谢物时，有必要将微量代谢物与其分离，以便 排除它们对这些微量代谢物分析的干扰【5 7 , 5 8 】。由于代谢组学分析的样品较多，若无法 在短时间内完成样品的采集，应将待测样品置于8 0 条件下保存。 由于某种提取条件往往对于某些化合物是合适的，但对于另外一些化合物的稳定 性却不利，因此至今仍然没有一种方法可对样品内所有代谢物进行提取，而样品制备 的质量与提取条件和研究人员的技术水平和实验经验等因素有着直接关系。 1 3 4 代谢组学研究的技术平台 许多分析技术可以用于代谢物的检测，如气相色谱和质谱联用( g c m s ) 、液相色 谱和质谱联用( l c m s ) 、核磁共振( n m r ) 、毛细管电泳质谱联用( c e m s ) 5 9 巧1 】以及傅 里叶变换红外光谱质谱联用( f t i r - m s ) 6 2 , 6 3 1 等。针对样品特性和研究目的，在使用这 些分析手段是应考虑到它们对代谢物组的最低检测限，包括它们的综合性、选择性和 灵敏性。目前，没有一种单一的方法可以检测出细胞中成百上千的代谢物，因此综合 多种分离分析手段的联用技术有助于我们研究那些极性和分子量范围不同的多数代 谢物。 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 1 3 4 1 气相色谱和质谱联用技术 气相色谱和质谱联用系统( g c m s ) 中，气相色谱利用样品中各组分在气相和固定 液液相间的分配系数不同的原理，将待测样品中的组分彼此分离。因此g c m s 分析时， 首先需对样品进行衍生化处理，它起到增加样品稳定性和挥发性的作用，有利于用的 气相色谱仪进行分离。衍生化处理所用到化学试剂包括烷化试剂、酰化试剂和硅烷化 试剂等【删。 质谱技术是通过对被测样品离子的质荷l 匕( n v z ) 的测定来进行分析。待分析样品首 先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动的行为差异，把离子按质荷比分 开而得到质谱图，每个化合物的分子结构可以通过其碎片峰的类型和质荷比结合有关 质谱数据库来进行定性。 g c m s 作为一种常规技术被广泛应用于揭示植物或微生物功能基因组研究中目 前已知或迄今为止未发现的代谢表型【6 5 7 5 1 。其中，j a n ab 6 m e r 等利用g c m s 对谷氨酸 棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 进行高通量代谢物分析，同时分离至u l o o o 个以 上的峰，对6 5 0 个峰进行了定量，其中大约1 5 0 个代谢物得到定性。由于具有高分辨率 和高灵敏度，g c m s 是代谢组学研究平台中发展最为迅速的技术，随着g c g c m s 技 术闱和g c 与飞行时间质谱( t o f m s ) 联用技术 7 7 1 的出现，代谢物的分离效率得到了 很大的提高。但是g c m s 限于分析挥发性的物质，无法对如膜脂等热不稳定性的物质 和分子量较大的化合物进行分析。 1 3 4 2 液相色谱和质谱联用技术 液相色谱和质谱联用( l c m s ) 技术由于其高灵敏度和对代谢物极性及分子量具有 较广的分析范围，在代谢组学研究中的地位变得日益重要。液相色谱和高效液相色谱 ( h p l c ) 技术已相当成熟，并具有高分辨率和高分析灵活性，可分析特定的代谢物和一 类化合物，也可以同时分析不同类的化合物。l c m s 避免了g c m s 分析中复杂的样品 前处理过程，适合分析不易挥发性的、极性的和热不稳定化合物以及大分子量化合物 ( 包括蛋白、多肤、多聚物等) ，在代谢物分析上的潜力弥补了g c m s 技术的缺陷。随 着l c m s 技术的发展，电喷射离子陷阱( e s i ) 技术的出现使质谱技术更为精益求精。最 近，超高效液相色谱质谱联用( u p l c m s ) 和毛细管电泳质谱联用( c e m s ) 等新技术 的出现使代谢组学研究中代谢产物检测灵敏度和通量进一步提耐7 引。但l c m s 分析所 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 需的时间相对较长，且没有商品化的谱库可对比查询，代谢物鉴定需依赖于标准参照 物，这就大大限制了它在无靶标代谢物分析中的应用。近年来，l c m s 技术有了极大 发展，并为越来越多的研究者应用于于代谢组学的研究【7 9 彤】。 1 3 4 3 核磁共振技术 核磁共振【n m r ) 作为当前代谢组学研究中的主要技术之一，最初被用于病理生理 学和药理毒理学方面8 4 1 ，但目前也广泛用于植物和微生物代谢组学研究【8 5 州1 。n m r 是一种非选择性，非破坏性的分析方法，可在合适的温度和缓冲液范围条件下，实现 对生物样品接近子生理条件下的实时动态检测，因此，n m r 技术被常规应用于生物样 品中结构复杂的代谢组分和活体代谢水平| 9 2 , 9 3 1 以及阐明复杂代谢通量【9 4 1 。但与色谱 与质谱联用技术相比，n m r 存在低灵敏度和易形成信号重叠的缺点，且对样品的制备 有相当高的要求。另外，由于动态范围的限制，很难对生物系统中复杂混合代谢物进 行同时分析测定，且提供的信息主要是非定量【9 5 j 0 0 1 。虽然这些缺点限制了n m r 在代 谢组学中的应用，但对确定代谢物结构是非常重要的。 1 3 5 数据的分析与解释 和其他功能基因组学研究一样，代谢组学研究会产生大量的数据，对这些数据的 处理与分析对于研究者是一个不小的挑战，这就要求应用专业的数学、统计学和生物 信息学方法对数据进行降维和分类，从中挖掘出有价值的生物学信息。数据分析的步 骤为：首先，需要对原始数据进行预处理( d a t ap r e p r o c e s s i n g ) 排除多余干扰因素， 然后利用非监督方法( u n s u p e r v i s e dm e t h o d ) 或有监督方法( s u p e r v i s e dm e t h o d ) 算法提取 生物学信息，并采用可视化技术直观表达出来。 1 3 5 1 原始数据的预处理 原始数据的预处理一般包括基线校j e ( b a s e l i n ec o r r e c t i o n ) 、修匀( s m o o t h i n g ) 、归一 化( n o r m a l i z a t i o n ) 和缺失值估计( m i s s i n gv a l u ee s t i m a t i o n ) 等过程。基线校正和修匀可以 减少由基线飘移和设备飘移造成的技术误差。归化可以移除数据中的非生物变异， 并将数据转化成正态分布已达到统计学检验的要求1 0 1 1 。极端值( o u t l i e r s ) 去除、样品测 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 量的不一致性以及某些物质浓度低于测量极限等原因都可造成缺失值的出现。因此， 对缺失值须谨慎对待，增加或去除可能对分析结果有重大的影响【1 0 2 1 。 1 3 5 2 非监督方法 非监督方法由于不需要样品的相关背景信息，因此可用于探索完全未知的数据特 征。此方法是依据样本特性对原始数据或经过预处理后的数据进行归类，并将具有相 似特征的目标数据归于同一类中，并采用可视化技术进行描述。非监督方法对原始信 息和分类信息进行比较后，可建立代谢产物与原始信息之间的联系，筛选获得相关标 志性组分作为生物标记，从而考察其中的代谢途径【1 0 3 1 。非监督方法的主要算法有聚 类分析( h i e r a r c h i c a lc l u s t e ra n a l y s i s ，h c a ) 和主成分分析( p r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i s ， p c a ) 等。 h c a 是根据物以类聚的原理分析事物的相似性的统计学方法，分类对象被置于一 个多维空间中，根据事物的特性进行识别，把性质相近的归为一类，被划分在同一类 的事物具有极高的相似性。聚类分析步骤为：首先对样品数据及相应的变量进行，而 后，通过对数据的转换产生相似矩阵，接下来，需要决定目标总体细分的类数及其相 应的定义，最后实施聚类分析并产生结果。由于在聚类分析结果中，被归为同一类的 个体有较大的相似性，因此，具体到代谢组学研究中，可认为同源类中的代谢物具有 相似的生物化学特性和生物学功能，这样，就可通过同类中研究较为透彻的代谢物来 推断该类中其他物相对较为陌生的物质的生物学功能作用【l 洲。 p c a 是目前应用最为广泛的多维分析方法之一，其特点是将分散在一组变量上的 信息集中到某几个综合指标，即主成分( p r i n c i p a lc o m p o n e n t ，p c ) 上，利用这些主成分 来描述数据集内部结构，实际上也起着为数据降维的作用。主成分分析法可将一组给 定的相关原始变量通过线性转换成为另一组不相关的新变量。这些新的变量按照方差 依次递减的顺序排列，在数学变换中保持变量的总方差不变，使第一变量具有数据集 的最大方差，称为第一主成分：第二变量的方差次之，称为第二主成分，且它和第一 主成分互不相关，依此类推。通过这些数据集在前两个或三个主成分上的等分作投影 图，就能将结果所反映出的生物化学变化很好的表现出来【1 0 5 1 。 铜胁迫下微紫青霉菌菌株g x c r 代谢谱分析 1 3 5 3 有监督方法 有监督方法用于建立样品类别间的数学模型，使各类样品间达到最大分离，并基 于所建立的多参数模型对完全未知数据进行识别、分类和预测。这类统计学方法中， 所建立的参数模型时拥有训练样本可供学习利用，所以称为有监督学习。有监督方法 中常被应用的算法有线性判别分( 1 i n e a rd i s c r i m i n a t i o na n a l y s i s ) 、偏最小二乘法显著性 分析( p l s 。d i s c r i m i n a t i o na n a l y s i s ) 和人工神经元网络( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ， a n n ) 1 0 6 1 。 1 3 5 4 网上数据库 代谢组学数据的标准化及存储也是一个重要方面，相关数据库的建立也将代谢组 学研究与其他组学研究联系在一起，为系统生物学研究提供了一个平台，未来的发展 方向是建立综合基因组、蛋白组及代谢组等信息的大型数据库。现在主要的数据库有 k e g g ，e c o c y e ，b r e n d a ，m e t a c y c ，li g a n d ，e m p ，i r i s ，a r a c y c ，p a t h d b ， e x p a s y 、m a p m a n 和p u b c h e m 等等【1 0 l 1 2 1 1 。 1 3 6 代谢组学在微生物领域的应用 代谢组学研究在生物学、农业、医药等许多领域都得到了广泛的应用，并表现出 巨大的发展潜力。在生物学研究领域，代谢组学研究为实现基因功能的鉴定做出了重 要的贡献，例如，以模式生物拟南芥及一些转基因作物为研究对象的植物功能基因组 研究【3 0 , 1 2 2 】。代谢组学在促进植物基因功能研究的同时，也带动了它在农业、食品领域 的应用。通过比较突变体、转基因品种及其野生型营养物质或代谢产物水