酶的化学修饰基本原理及修饰酶的基本性质.doc

酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点【摘要】 酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。1 酶的化学修饰的基本原理酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。1. 1功能基团的修饰 酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶解度和分散度。Ken，chiMogi和Milsatoshi Nakajima发现表面活性剂HLB值和脂肪酸功能团部都显著影响酶的活性和产物的量。在有机溶剂中表面活性剂的疏水基团数目越多时对酶的修饰效果越好1.3酶分子内和分子间的交联双功能试剂如二异硫氰酸脂、戊二醛可与酶分子中或分子间肽链的两个游离氨基分别发生反应使它们交联起来，增加酶的稳定性和活性回收率。1.4酶与高分子化合物结合某些高分子化合物如蛋白质、多糖、聚乙二烯(PEG)等可以与酶结合，增加酶的稳定性，如淀粉酶在65时半衰期为25min，当与葡萄糖结合后，半寿期延长至63 min1.5用化学衍生法修饰酶随着分子生物学的进展，目前已能用多种方法随机突变产酶基因DNA，再与合适的载体(细菌)进行表达，并且构建了突变基因库来改进传统的筛选方法(将所有的细菌分别从琼脂板上取出再移至含营养液的板上培养繁殖，产生大量酶后再进行催化实验)。Pleltner等引用组台法制备并筛选化学衍生化的枯草溶菌RL酶。利用该酶与硫甲磺酸试剂(MTS)反应的定量、快速以及几乎不发生变性的特点，将酶中的3个关键活性位点分别与7种MTS试剂在96孔平板上分别进行组合衍生化，并按标准酶活力测定方法快速测定它们作为脂肪酸计酰胺酶的催化活性，初步得到分别具有最佳脂酶及酰胺酶的改良催化剂2 修饰酶的性质特点2.1 增强酶的稳定性尹亮等利用PEG6000修饰SOD、发现修饰酶在70下保温3h后活性残余率比天然SOD高37.2%。Gomez等利用壳聚糖修饰酵母蔗糖酶，发现修饰酶在65、0.05mol发现修饰酶在65、0.05 molL的pH50HAcNaAc缓冲液中的半衰期为5 h而人然酶在相同条什下的半哀期为5 min；同时，修饰酶蛋白变性剂的抵抗能力也有所提高在30、0 05 mol/l到6 molI尿素的pH5. 0 HA-NaAc缓冲液中保温120 min后，大部分酶基本上已经没有活力，而修饰酶还有50的活力，化学修饰酶稳定性提高的原因，可能是由于修饰剂共价连接于酶分子后，使酶天然构象产牛一定的刚性，不易伸展失活，并减少丁酶分子内部基团的热振动从而使酶的热稳定性得到提高。2.2 降低甚至消除酶的免疫原性Hafsat等利用右旋糖汁修饰L-天门冬酰胺酶发现修饰酶对用天门冬酰胺酶免疫活性的兔抗血清的结合能力明显弱于天然酶。舒薇等利用mPEG修饰木瓜凝乳蛋白酶，发现随着酶的修饰程度的上升术瓜凝乳蛋白酶的免疫原性逐渐下降甚生完全消除。目前认为，蛋白质的免疫原性是由于其分子上的抗原决定簇决定的，而抗原决定簇大多数有亲水氨基酸组成。用线性亲水性高分子物质(如右旋糖苷m-PEG等)与蛋白质表面的非必要基团共价偶连形成一种屏蔽，将暴媒的抗原决定簇部分或全部屏蔽起来而不被识别，从而可降低甚至消除其免疫原性。2.3 延长酶在生物体内的半衰期尹亮等利用PEG6000修饰SOD，发现在人工胃液和人工肠液中保温3 h后，修饰酶活性残余率分别比天然酶高32.1和17.4。Sherwood等利用右旋糖苷修饰羧肽酶G和精氨酸酶发现羧肽酶G在正常小鼠体内的半衰期从3.5 h延长到17 h，精氮酸酶从1.4 h延长到12 h；在发病的小鼠体内两者的半哀期分别从7 h和12.5 h延长副18 h雨J17h。由于免疫原性的解除，药用酶注人体内后不会通过免疫反应而被清除；偶联大分子长链在蛋白质分于表面产生空间位阻，减弱各种水解酶对其的降解，从而可有效延长在体内循环系统中的保存时间。3.4 提高酶的活力Jene等用mPEG修饰的过氧化氢酶在有机溶剂内溶解性提高，在二氯乙烷中，其酶活性是天然酶的200倍；在水溶液中，其酶活是天然酶的15-20倍，而几mPEG修饰的酶比PEG修饰的酶活力更高。酶化学修饰后活力提高的原因可能是亲水大分子的引入与蛋白质分子的氨基酸基团形成氧健，使维持蛋白质高级结构的氢键受到部分破坏，亚基肽链结构趋于松散，使底物分子容易进入活性中心，反应的活性能进一步降低，从而导敛酶活性的提高。参考文献：1 伍志权、黄卓烈、金昂丹 酶分子化学修饰研究进展J 华南农业大学，生命科学学院 2007,