REACH法规 第五卷译稿-22.doc

C.14. 幼鱼的生长测定1. 方法这里的毒性测定方法取自经济合作与发展组织(OECD) TG 215 (2000)1.1 引言这一个设计用来进行长期暴露在化学药品下对幼鱼生长的影响的测定。这种方法在欧盟发展出来并经过其检测（1）（2）。为估定在流通条件下的化学药品对幼年的虹鳟鱼 (Oncorynchus mykiss) 的生长效果。其他的被证明良好的种类也可能使用。举例来说，从zebrafish (Danio rerio)2 (3)(4) 和 ricefish (medaka, Oryzias Latipes) (5)(6) 的生长测定已经得到经验 (7)。参见总引言第C部分。1.2 定义最低可观测有效浓度(LOEC)：是某种检测物质和对照组相比可观察到明显作用p0.05的最低浓度。无可观测有效浓度(NOEC)：检测浓度低于LOEC。ECx：在这种检测手段下指与对照组相比使鱼生长变化的x%的检测物质浓度。装载率：单位体积水中鱼的湿重。数密度：单位体积中鱼的条数。单个鱼特定生长率：表示单个鱼相对于原始体重的生长率。整个容器平均特定生长率：在同一浓度下整个鱼缸中鱼群的平均生长率伪特定成长率: 表达个别鱼的生长率与每缸鱼平均初始体重。1.3 检测方法的原理在称重后，将处于指数增长期的幼鱼放入检测室中，暴露在将检测物质溶于水中达到非致死浓度的溶液中，最好是流动相，若不能，就在接近半静态（静态更新）条件下。检测持续28天。期间鱼食物供应很差，按照初始重量投食，可能在14天后重新计算食物供应量。在检测结束后，重新称量鱼的重量。生长率的效果用回归模型来计算生长率变化x的浓度。即：ECx（例如，EC10，EC20，EC30）。2 Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The pHyLogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a modeL system in deveLopmentaL Biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.换句话说，用实验数据与对照组比较来计算LOEC和NOEC。1.4 检测物质的信息一个急性中毒的测定（参见测定方法C.1.）更适宜实现这个测定中物质的选择，应该可以采用。这暗示检测物质的水溶性和蒸汽压是已知的，而且要一个达到已知和报道中的精度和检出限的可靠分析方法用于检测溶液中物质的定量测量。结构公式，物质的纯度，在水中和光照下的稳定性，Pka，Pow以及预备生物降解的结果都是有用的信息。1.5. 检测的有效性为使测定有效，应用下列条件。 对照组的死亡率在测定结束的时候不能超过 10%; 必须充分增加对照组的平均重量，以使增长率的最小检测量比较显著。鉴定测定表明在28天中，虹鳟鱼对照组体重的增长必须至少一半（50）于其初始重量。例如，初始重量1g/条（100），28天后重量：1.5g/条（150%） 整个测定中水中溶解氧的浓度必须至少是空气中饱和值ASV的60。 在测定期间水温变化不能超过1，测定容器的温度浮动在任何时候都须在2范围内，这是物种要求的温度范围。（见附件1）。1.6 测定方法描述1.6.1 仪器使用通常的测定设备，尤其是以下几种： 氧气和pH计； 测定水硬度和碱度的设备； 适当的控温仪器，最好能连续监控； 用化学惰性的材料制成的容器，容积要考虑到装载率和数密度（见1.8.5节和附件1） 适当精度的天平（就是说精确到0.5%）1.6.2 水只要检测鱼的种类能够长期生存并生长的水都可以作为测定用水。它在此测定期间的水质应该是不变的。水的pH值应该在6.5到8.5之间，但是在一个具体的测定中，pH值的浮动不能超过0.5个单位。推荐硬度在140mg/L以上。为了保证稀释液不过度的影响测定结果（例如检测物质中的配合物影响），用于分析的样品水必须间隔采样。重金属元素（如Cu, Pb, Zn, Hg, Cd 和Ni），主要阴阳离子（如Ca, Mg, Na, K, CL 和SO4）,农药（如总有机磷和有机氯农药），总有机碳和固体悬浮颗粒都要作测定，例如，每三个月中稀释液的质量要保持相对恒定。如果能够证明水质在至少一年内无变化，检测可以不必如此频繁，间隔可以扩大（例如每六个月测一次）在附件 2 中列出了一个可接受的稀释液的一些化学的特性。1.6.3 检测溶液选定浓度的检测溶液由储备液稀释制得。储备液必须用化学方法（如搅拌和超声破碎）由检测物质和稀释液用简单的混合、搅拌等方法精确配制。为获得适当浓度的浓缩的储备液可用饱和度柱（溶解度柱）。为了制备合适浓度的储备液，溶剂或分散剂的使用有时有所要求。适当的溶剂例子如丙酮，乙醇，甲醇，二甲亚砜，二甲基甲酰胺，二缩三乙二醇。适当的分散剂如CremopHor RH40, Tween 80, 甲基纤维素0.01 % 和 HCO-40。如果用容易生物降解的物质（如丙酮）或容易挥发的化合物则需要小心照顾，因为这些物质在流动相中可能造成细菌生长的问题。当一种溶液使用时，必须注意它对鱼的生长没有明显的影响而且与只加溶剂的对照组相比对于幼鱼没有明显的不利作用。对于流动测定测定，必须要有一种连续的分配与稀释储备液的系统（如计量泵，比例稀释器，饱和器系统）来向容器传递一系列的浓度的溶液。储备液和稀释液的流动速率要经常核对，最好是每天，在整个测定过程中，变化不能超过10。鉴定测定（2）表明，对于虹鳟鱼，测定中鱼每天的换水频率在6升/g（见1.8.2.2节）。对于半静态（可更新的）测定中，介质更新的频率依赖于检测物质的稳定性，但是推荐每天换水。在初步稳定性测定中(见1.4)，如果检测物质浓度在更新过程中不稳定（变化范围在标定的80-120 %以外，或跌至测过的初始浓度的80以下）时，就要考虑用流动相。1.6.4 种类选择推荐使用虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)，因为在检测（1）（2）中在其上获得的经验最多。当然，其它有良好实证的种类也可以使用，只是测定结果要被转换为提供的适当测定条件。例如，对斑马鱼zebrafish (Danio rerio)(3)(4)和ricefish (medaka, Oryzias Latipes)(5)(6)(7)的经验也是可用的。如果这样，选择鱼的种类和测定方法原理在都需要实验结果报告出来。1.6.5 养鱼测定用鱼要从同一容器中的鱼群中选出，最好是一批卵生的。测定前将此鱼在与测定条件相同的水质和光线中养两周。在整个测定期间喂食量至少使其每天增重2，最好每天4。放置48小时预备期后，按照下列标准记录死亡率，。 若七天中死亡率超过10，不要使用这批鱼。 若七天中死亡率在5到10之间，让鱼再适应7天，如果后七天中仍然超过5，放弃这批鱼。 死亡率在5以下，可以使用这批鱼。鱼在这测定前的两周内和测定中不能接受疾病治疗。1.7 测定设计测定设计与数字的选择和测定浓度的间隔有关，数字是指在每个浓度上的容器的个数和每个容器中的鱼的条数。理想的测定选择应遵循以下规则： 研究目的 使用的统计分析方法 实验原料的可用性和实验花费。如果可能的话，客体的描述要指定一种统计方法，这种方法用来检测变异的给定大小（例如生长率），或者说要求估计ECx的精度（例如x10，20，30，最好不要小于10）。没有这，就不能给出研究规模的严格规定。要指出的是，最优化的统计分析手段设计（资源的最有效利用）并不一定在其他情况下优化。那推荐用于LOEC/ NOEC 的估计值的设计来在回归分析中并不因此同样是适用的。在大多数的情况下，回归分析比方差的分析好, 原因由 StepHan 和Rogers讨论过(8)。 然而, 当没有发现适当的回归模型 (r20.9) 的时候应该用NOEC/ LOEC。1.7.1 回归分析的设计用于回归分析的测定设计应该考虑下列重要条件：有效浓度 (举例来说EC10,20,30) 和涵盖测定物质的影响范围的浓度应该被包含在测定中的浓度范围中。当效应浓度在被测定的浓度范围的中央的时候 , 估计效应浓度的可能做到的精密度可能将会最好。一个初步的范围测定在选择适当的测定浓度方面可能是有帮助的。为了使满意的统计模型可用，测定至少应在一个对照容器和五个附加容器中在不同浓度下进行。在适当处，当使用溶剂时在检测系列之外，一个对照组应使用最高溶剂浓度(见第 1.8.3 节和 1.8.4)。可能要使用适当的几何级数和对数级数（9）（见附件3）检测浓度在对数空间更好。如果超过六个容器是有效的, 加添的容器应该要么用来提供复件要么用来内插在浓度间隔中使其更小。这两种方法都是值得的。1.7.2 NOEC/LOEC的方差分析设计（ANOVA）最好每个浓度都有个备份，而且统计分析应该是在整个容器层次水平上的（10）。如果没有备份缸，就不能得到超越不同鱼之间的不同缸之间的变化。但是经验（11）表明在测定条件下不同缸间的差距比缸中鱼间的差距是非常小的。因此，一个相对可以接受的选择是不同鱼间层次上的的统计分析。按照惯例，在在一个含有不超过3.2的因子的几何级数中至少应使用五个浓度。通常当备份缸做测定时，备份对照缸和其中鱼的数量在每个浓度上都应是两倍，浓度的大小应该是相等的 (12)(13) (14)。相反，如果没有备份组，对照组中鱼的条数每个浓度上应该相等。如果ANOVA是基于容器层面上的而不是单个鱼（这个测定要求每条鱼做标记或者使用第 2.1.2 节中提到的“伪”特定增长率），就需要足够的备份缸来求缸内不同浓度的标准偏差。这意味着方差分析误差的自由度应至少为5（10）。只要对照组是平行测定的实验结果误差变化就可能偏倚, 因为问题中生长率的平均值可能变化。既然随着增加的浓度生长率可能降低，这将导致变化率的过高估计。1.8 测定步骤1.8.1 对测定用鱼的选择和称重在测定前将鱼的体重的个体差异减小到最低限度是十分重要的。不同鱼种间推荐允许的个体大小差异在附件1中给出。测定开始时整批鱼的单个体重差异最好能在平均值的10内，无论如何最多不能超过25。在测定前，最好对鱼的子样品进行称重，从而估计平均重量。在测定前24小时对鱼群停止供应食物。用鱼必需随机选择。用全身麻醉剂（例如，100mg/L的tricaine methane sulphonate ( 甲基偶氮) (MS 222)，用两倍计量的碳酸氢钠中和），每条鱼都要按照附件1称量湿重（用吸水纸洗干），重量在预计范围内的鱼应予以保留，然后随即分配到检测容器中。记录每个容器中鱼的总湿重。麻醉剂的使用和处理操作（如擦干和称重）会对幼鱼产生威胁和伤害，特别是小的的鱼种。因此对幼鱼的处理操作必须最大限度的小心以防止对测定动物的威胁和伤害。在测定中的第28天对鱼再次称重（见1.8.6）。但是，如果认为有必要重新计算食物定额，可以在第14天重称（见1.8.2.3）.其它方法如照相可以用来测定鱼的大小从而调整食物定量。1.8.2 暴露条件1.8.2.1 持续时间测定的持续时间要28天。1.8.2.2 装载率和存储密度适当的装载率和存储密度对检测种类的鱼是非常重要的（见附件1）如果存储密度太高，就会产生过于拥挤的压力使鱼生长速率降低，还有可能使鱼生病。如果太低，会产生领地行为也会影响鱼的生长。装载率必须足够低以使氧气浓度可以在不通气的条件下达到60ASV。检验测定（2）表明对于虹鳟鱼，在40升的缸中放16条35g的鳟鱼是比较合适的。推荐换水频率是6升/克鱼/天。1.8.2.3 喂养必须给予喂养适当的食物（附件1），采用适当的投放率以使获得适当的生长率。小心照顾不要使水中有微生物繁殖和浑浊。对于虹鳟鱼每天4的生长率是可以满足这些条件的（2）（15）（16）（17）。每天的食物定量可以分成两等份，分两次投放，间隔至少5小时。定量时按照测定中每缸鱼的初始总重。如果14天后鱼的重量重称了，则重新计算食物定量。称量前24小时不喂食。对于没有吃掉的食物和排泄物应每天用抽水泵吸容器的底部，小心清理出缸。1.8.2.4 光线和温度光周期和水温应适合鱼种的生长（附件1）。1.8.3 检测浓度通常，即使不考虑测定设计（1.7.2），也需要五组检测物质的浓度。预知检测物质的毒性（如通过急性中毒测定或范围测定研究）有助于选择合适的检测浓度。如果少于五组数据应给出正当理由。最大浓度不能超过检测物质在水中的溶解度。如果在准备储备液时用到辅助溶剂，最终浓度不应高于0.1mL/L而且最好每缸浓度都相同（见1.6.3）。但是，必须尽一切努力避免使用这种物质。1.8.4 对照稀释液对照组的数量依赖测定设计（见1.7-1.7.2节）.如果使用溶剂，那么同样数量的溶剂对照组像稀释液一样也要包含进来。1.8.5 分析测定和测量的频率在测定中，检测物质的浓度应遵循以下规则的间隔。在流动相测定中，稀释液和毒剂储备液的流速要按时检测，最好每天一测，在整个测定中变化不能超过10。检测物质的浓度变化不能超过标定值的20（即80120，见1.6.2和1.6.3），建议至少在测定开始时然后每周一次的定期分析检测物质的最高和最低浓度。如果在测定中检测物质的浓度不能保证保持在标定值的20以内（有赖于检测物质的稳定性数据），就有必要把每个检测浓度都要作测定，但是注意要遵循同样方法。在检测物质的浓度能够保持在20标定值内的半静态（可更新的）测定中，建议至少在重新准备之前和以后的每周定时分析最低和最高检测浓度。对于不能保证检测物质浓度保持在20标定值范围内的测定中，就有必要遵循同样方法把每个检测浓度都作测定，即使是更稳定的物质。强烈建议测定结果基于测量过的浓度。但是，如果有证据证实整个测定中溶液中测定物质的浓度令人满意的保持在20标定值或测量过的初值范围内，实验结果可以基于标定值或测量值。样品需要先被过滤（如用0.45微米孔径筛），推荐用离心过滤法。但是如果物质不被过滤器吸附，渗滤也是可以接受的。测定中，每个缸的溶解氧的浓度，pH值，和温度都要测量。在对照组和浓度最高的一缸中总硬度，碱度，盐度（如果相关）要测。溶解氧，盐度（如果相关）至少要测三次（开始，中间，结束各一次）。在半静态测定中，建议溶解氧的测定要更加频繁，最好每次换水或者每周测一次。pH值要在开始结束时和每次换水时测量，在流动相测定中每周一次。硬度和碱度每次测定测一次。水温最好在一缸中持续监控。1.8.6 观察重量：在测定结束时，测量每只存活的鱼的湿重（吸水纸擦干），可以整缸一起测，也可以单个测。整缸测比单个测好因为单个测意味着每只鱼都要做标记。如果测量单个体重从而计算个体增长率，要选好标记技术避免使动物紧张（改用冷冻标记物是很好的，如使用优质的有色鱼线）。测定中每天都要观察鱼，任何外部的反常现象（如出血，变色等）和反常行为都要记录，死鱼要尽快取出。死鱼不要更换新的，装载率和储存密度要足够满足使每缸鱼的数量减少不至于产生影响。但是，喂食量要作调整。2 实验数据和实验结果报告2.1 实验结果的处理既然测定设计到很多变量如缸数，检测浓度数，和鱼数等，建议统计员参与测定的设计和分析测定。鉴于测定设计的选择权，统计过程的具体指导不在这里列出。如果整缸鱼的死亡率超过10，那么增长率就不要计算了。但是在所有的测定浓度中都要给出死亡率。不管用什么方法来分析实验数据，核心概念是时间t1和t2之间的增长率r。根据鱼是否是单个称量的和是否要求计算每缸平均值，r有多种定义方法。这里r1个体鱼的特定生长率r2每缸平均特定生长率r3“假”特定生长率w1，w2特定的鱼在时间t1t2时特定的重量。Loge w1在测定开始时单个鱼体重的对数值。Loge w2在测定结束时单个鱼体重的对数值。=在测定开始时每缸中的鱼平均体重的对数值在测定结束时每缸中的鱼平均体重的对数值t1，t2测定起止时间（天）。r1，r2，r3可以以28天为周期来测，（如果14天时测了），就可以按合适的014和128天为周期来测。2.1.1 实验结果的回归分析（浓度响应模型）生长率和浓度之间符合一个适当的数学关系，从而可以估计ECx也就是说任何要求的EC值。用这种方法就不必要给单个鱼求r（r1），分析可以基于整缸鱼r的平均值r2。后面这种方法更好。它也更适用于最小种类的鱼。将每缸的特定生长率（r2）对浓度作图，来观察浓度响应关系。为表达在 r2 和浓度之间的关系，应该选择一个适当的模型，而且它的选择一定要有适当的推理支持。如果在每个容器中存活的鱼数是不相等的, 那么适用模型的过程中，不管是简单还是非线性，都要容许组的大小的不同。套用模型的方法必须使EC20和它的方差（不管是标准偏差还是置信区间）的估算能够推算出。适用的模型的的图形轨迹必须表示出与数据相关，使对模型的适合可以看出来（8）（18）（19）（20）。2.1.2 求LOEC估计值的实验结果分析如果测定包括了各个浓度的备份缸，LOEC的估计可以基于用一种特定方法（如Dunnett 或 Williams的测定 (12)(13)(14)(21)对每缸平均特定增长率的方差分析（ANOVA）（见2.1），这种方法是以每个浓度的生长速率与对照组比较，得出产生0.05可能性量级上的明显不同的最低浓度。如果参数法要求的设想不能满足非正态分布（如在Shapiro-Wilk的测定中)，或异质性方差，(Bartlett的测定)，需要考虑在做ANOVA前将实验数据转换成同质性方差，或进行称重的ANOVA。如果实验每个浓度不包括多个水槽，一个建立在水槽上的结论ANOVA是不可能、无意义的。在这种情况下，一个令人接受的折中办法是将ANOVA建立在鱼个体假的具体生长率为。平均每个浓度的要和对照实验的作对比。 如前LOEC可以决定一致。可以承认这种方法不宽容，也不保护，不同水槽间变化大，此外再鱼个体之间有变化的理由，尽管如此，经验显示，水槽间变化性比水槽内变化性（即鱼和鱼个体之间）小。如果分析中未包括鱼个体，那要提供外侧鉴别法及其使用理由。2 2 实验结果说明实验结果中将对需要对在已知的分析方法测量水平范围内的有毒浓度，或要在半稳态实验中，何时实验物质的浓度会减少到新制备溶液和将更新溶液之间作出告戒。2. 3 实验结果报告231 实验结果报告实验结果报告必须包括下列信息：物理性质和相关的物理-化学性质；化学鉴别数据，包括纯度及对合适的实验物质定量分析的方法；232 实验种类学名，可能性；血统，尺寸，供给者，预想等等；233 实验条件习惯上的实验步骤（例如：半稳态/更新实验，流通法，装样，生殖浓度）；实验预想（如实验容器数量，实验浓度，更新的实验每个容器中，鱼的数量）；繁殖溶液的准备方法和更新的频率（溶质及其浓度在使用时必须给出）；标准实验浓度，测量值，测量方法和明确的容器及方法上的测量误差，及使用方法所需的涉及实验物质在真实溶液中浓度的测量方法的证据；溶剂水的性质：pH，硬度，碱度，温度，水中溶解的氧气的浓度，残余氯元素的级别（如已测），所有含碳有机物，悬浮的土壤，实验环境的含盐量和其他可测定的物质；容器水的性质：pH，硬度，温度，水中溶解的氧气的浓度；饲养的详细信息，（例如：食物种类，来源，所给数量和频率）。234 实验结果控制有效生存标准，在每个实验浓度发生的死亡率的数据；使用的统计分析法，建立在重复实验或鱼身上的统计处理数据的方法及使用此法的理由；个体的表格数据和鱼在0、14、28天时的平均含水槽的重量或假定的在028天或014、1528天的生长率（如适当）；更好的表格及LOEC和NOEC或ECx的表格或图表统计数据的实验结果（及回归分析和ANOVA），可能的时候，找出明显的错误；任何鱼不平常的反应迹象和任何由实验物质导致的明显可见的影响。3参考文献：(1) Solbe.J.F.de LG(1987).Environmental Effects of Chemicals(CFM 9350 SLD).Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. 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