（有机化学专业论文）流动注射液滴荧光法用于水溶性维生素的分析研究.pdf

南昌人学2 0 0 5 届硕十研究生学位论文 摘要 光化学生物传感是以光学信号选择性表达检测体系化学 生物组分实时信息 的应用技术 它在生命科学 环境监测 疾病诊断 药物筛选 食品工业及材料 科学等重要领域中正得到越来越多的应用 液滴光化学生物传感装置具有连续产生新鲜试剂并与样品相互作用的功 能 并且液滴本身就是无需任何光窗的光池 它避免了在传统的光化学测量中 试剂和样品对比色池的污染以及因反应池池壁对光的吸收 散射或过程中产生的 吸附物质等所引起的对测量信号的干扰 因而可以大大提高传感器检测的灵敏度 和准确性 维生索是一类重要的营养物质 与人体的健康密切相关 对药物或食品中 维生素的检测具有重要的意义 本文利用液滴光化学传感器 结合流动注射技术 建立了一种新型的流动注射液滴荧光法对药物制剂中的水溶性维生素 叶酸 抗 坏血酸和复合维生素b 进行快速检测 该方法自动化程度高 测试时间短 试 剂用量少 在制药工业中可用于实时检测 本文具体内容如下 1 利用液滴光化学生物传感器对叶酸进行快速检狈4 在酸性条件下 弱荧 光的叶酸被高碘酸钾氧化为强荧光的化合物 在优化条件下 叶酸在0 0 2 2 8 4 g m l 的浓度范围内有良好的线性响应 检测限为o 0 0 1 g m l 将该传感器用 于叶酸片荆中叶酸含量的检测 结果满意 4 用h g i i 将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸 然后与邻苯二胺缩合生成具 有荧光性质的喹喔啉衍生物 基于此衍生化反应 利用液滴光化学传感装置 检 测维生素c 片中抗坏血酸的含量 在优化条件下 体系荧光强度与抗坏血酸的 浓度在o 0 6 1 3 2 9 9 m l 范围内呈线性关系 回归方程为f 7 7 7 8 5 1 3 9 c 5 利用维生素b l b 2 和b 6 在葡聚糖凝胶上的不同吸附性质及b 1 b 6 在铁 氰化钾碱性溶液中的荧光相反表现 一应用于复合维生素b 药片和人工合成样品 的检测 获得了较为满意的结果 维生素b 1 b 2 和b 6 在浓度分别为 流动注射液滴荧光法朋丁 水溶性维生紊的分折研究 o 0 1 8 0 0 m g m l 0 0 1 1 0 0 0 g m l 和o 0 1 3 0 0 芦g m l 范围内呈线性关系 其检 出限分别为0 0 0 8 u g m l 0 0 0 5 u g m l 和0 0 0 6 u g m l 该方法测试速度快 所需 样品量少 且可以克服以往荧光分析中由于b 2 和b 6 的光不稳定性所引起的测量 误差和普遍出现的荧光吸收峰重迭现象 关键词 液滴 光化学生物传感器 荧光分析 n 南昌人学2 0 0 5 腻硕十研究生学位论文 a b s t r a c t o p t i c a lc h e m i c a lb i o s e n s i n g i sa t e c h n i q u ea p p l i e dt os e l e c t i v e l ye x p r e s s r e a l t i m ei n f o r m a t i o no fc h e m i c a la n db i o l o g i c a lc o m p o n e n t sw i t ho p t i c a ls i g n a li n d e t e c t i o ns y s t e m i ti su s e dm o r ea n dm o r ew i d e l yi nm a n yi m p o r t a n ta p p l i c a t i o n f i e l d ss u c ha sl i f es c i e n c e s e n v i r o n m e n tm o n i t o r i n g i l l n e s s sd i a g n o s i s m e d i c a t i o n s c r e e n i n g f o o di n d u s t r i a la n dm a t e r i a ls c i e n c e s t h ed r o p l e to p t i c a lc h e m i c a lb i o s e n s o rh a st h ef u n c t i o no fc o n t i n u o u sp r o d u c i n g f r e s hr e a g e n t sa n dr e a c t i n gw i t hf l e s hs a m p l e s t h ei n f e c t i o no fo p t i c a ls i g n a l w h i c h c a u s e db yt h ea b s o r p t i o na n ds c a t t e r i n go fc e l ls u r f a c eo rt h ec o n t a m i n a t i o n so f r e a g e n t sa n ds a m p l e st oc e l l si nc o n v e n t i o n a lp h o t o m e t r i ca n a l y s i s c a nb ea v o i d e d t h eu n i q u ef e a t u r e so fal i q u i dd r o pc a nb ec h a r a c t e r i z e di ni t sr e p r o d u c i b i l i t y r e n e w a b i l i t y d e f i n e dv o l u m e a n dl a c k o f c o n t a i n m e n tw a l l s t h ef e a t u r e s i n d i v i d u a l l yo ri nc o m b i n a t i o n m a yr e s u l ti nh i 曲s e n s i t i v i t ya n da c c u r a c yf o r a n a l y t e s v i t a m i ni sak i n do fi m p o r t a n tm i c r o n u t r i a n t sa n dh a sac l o s er e l a t i o n s h i pw i t h t h eh u m a nh e a l t h i ti s s i g n i f i c a n t t od e t e r m i n et h ec o n t e n to fv i t a m i n si n p h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s o ri nf o o d s an o v e lf l o wi n j e c t i o n d r o p s s p e c t r o f l u o r i m e t r y c o m b i n i n gw i t h 出0 p b a s e do p t i c a lc h e m i c a ls e n s o rw i t hf l o w i n j e c t i o nt e c h n i q u e h a sb e e ne s t a b l i s h e dt of a s td e t e c tw a t e r s o l u b l ev i t a m i n ss u c ha s f o l i ca c i d a s c o r b i ca c i da n dc o m p l e x v i t a m i nbi np h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s t h i s m e t h o di sa u t o m a t i c s h o r tt i m e l o wr e a g e n tc o s ta n dr e a l t i m ei nd e t e r m i n a t i o no f v i t a m i n si nm e d i c a t i o nm a n u f a c t u r e t h ec o n t e n t so ft h i st h e s i si n c l u d ea sf o l l o w i n g 1 af l u o r o m e t r yb a s e do no p t i c a lc h e m i c a ls e n s o rc o m b i n e dw i t hf l o wi n j e c t i o n t e c h n i q u eh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff o l i ca c i d t h em e t h o d i sb a s e d o nt h ec h e m i c a lp r o p e r t yo ff o l i ca c i dw i t hw e a k l yn a t i v ef l u o r e s c e n c eo x i d i z e db y p o t a s s i u mp e r i o d a t et of o r mf l u o r e s c e n tp r o d u c ti n a c i d i cm e d i u m u n d e ro p t i m u m i l i 流动注射液滴荧光法州丁水溶性维生素的分析研究 c o n d i t i o n s t h ec a l i b r a t i o ng r a p hw a so b t a i n e do v e rt h er a n g eo f0 0 2 2 8 4 u g m lf o r f o l i ca c i dw i t ht h el i m i to fd e t e c t i o no f0 0 0 1 m lt h es e n s o rw a sa p p l i e dt oa s s a y f o l i ca c i di np h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 2 a s c o r b i ca c i dw a sc o n v e r t e dt od e h y d r o a s c o r b i ca c i dw i t ht h eo x i d a t i o no f m e r c u r y i i i o na n dt h e nc o n d e n s e dw i t hd p h e n y l e n e d i a m i n ep r o d u c i n gf l u o r e s c e n t q u i n o l i n e b a s e do nt h i s d e r i v a t i z a t i o nr e a c t i o n t h ec o n t e n to fa s c o r b i ca c i di n v i t a m i nct a b l e tw a sd e t e r m i n e du t i l i z i n gd r o p l e to p t i c a lc h e m i c a lb i o s e n s o r u n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n s t h es e n s o rs h o w sl i n e a rr e s p o n s ei nt h er a n g ef r o mo 0 6 1 3 2 肛g m l f o ra s c o r b i ca c i d t h er e g r e s s i o ne q u a t i o ni sf 7 7 7 8 5 1 3 9 c 3 an o v e lo p t i c a lc h e m i c a ls e n s o rb a s e do nt h el i q u i dd r o p sc o m b i n e dw i t hf l o w i n j e c t i o n s o l i dp h a s eh a sb e e nd e v e l o p e df o rc o n t i n u o u sa n ds e q u e n t i a ld e t e r m i n a t i o n s o ft h em i x t u r eo fv i t a m i nb i v b l v i t a m i nb 2 v b 2 a n dv i t a m i nb 6 v b 6 q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n so fv bx v b 2a n dv b 6w e r ec a r r i e do u tb a s e do ns e l e c t i v e a d s o r p t i o no fs e p h a d e xc m c 2 5a n dd i f f e r e n tf l u o r e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c so fv b l v b 6i nt h eb a s i cs o l u t i o n s t h i sm e t h o dh a sb e e na p p l i e di nt h ed e t e r m i n a t i o no f s y n t h e t i cm i x t u r eo fv b l v b 2 v b 6a n dv i t a m i nbc o m p o u n d t a b l e t sw i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t s u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s l i n e a rc a l i b r a t i o nc u r v e sw e r eo b t a i n e do v e rt h e r a n g eo f0 0 1 8 0 0j z g m 1 0 0 l 1 0 0 0 g m la n do 0 1 3 0 0 2 9 m lf o rv b l v b 2a n d v b 6w i t ht h el i m i t so fd e t e r m i n a t i o no f0 0 0 8 0 0 0 5a n do 0 0 6 m m l r e s p e c t i v e l y t h em e t h o di sf a s ti na s s a ya n dl o wi nr e a g e n tc o s t t h ee r r o r sr e s u l t sf r o mo p t i c a l i n s t a b i l i t yo fv b 2 a n dv b 6i np r e v i o u sa n a l y s i sa n do v e r l a po ff l u o r e s c e n c ep e a ka r e e l i m i n a t e d k e y w o r d s l i q u i dd r o p s o p t i c a lc h e m i c a lb i o s e n s o r f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s i v 南吕人学2 0 0 5 俑硕十研究生学位论文 本文常用英文缩略词表 v 学位论文原创性声明与版权使用授权书 南昌大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品 对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担 作者签名 禾诘刁 日期 2 0 0 5 年6 月 厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查 阅和借阅 本人授权湖南大学可以将奉学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文 本学位论文属于 1 保密口 在年解密后适用本授权书 2 不保密囤 作者签名 导师签名 请在以上相应方框内打 辛木诗刁 冬诲 日期 2 0 0 5 年6 月 曰 日期 2 0 0 4 年6 月世日 南昌人学2 0 0 5 屑硕士研究生学位论文 1 1 前言 第1 章绪论 有机分析是有机化学和分析化学学科的一个重要分支 是人类了解 认识和 研究有机化合物的重要手段 它不仅对于理论有机化学 天然有机化学 有机合 成化学等学科的发展起着重大的推动作用 而且对于医药学 分子生物学以及石 油化工 环境科学 材料科学的发展也起着极其重要的作用 随着近代科学技术 的飞速发展 各种新的测试手段的广泛应用 仪器分析法在有机分析中发挥着越 来越大的作用 成为有机分析的主流 2 0 世纪8 0 年代发展起来的光化学传感器可以快速 灵敏 选择性地在线分 析有机物 无机物及生物样品等 1 e i 在工业生产 医学检验 环境监测 生命科 学 材料科学等领域得到广泛应用 光化学传感器 o p t i c a lc h e m i c a ls e n s o r s 是建立在光谱化学和光学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以吸 收 反射 荧光或化学发光 散射 折射和偏振光等光学性质表达的传感装置 7 从传感器的角度而言 我们希望识别分析对象的化学反应为可逆反应 以便样品 浓度的增加或减少时能获得连续的响应信号 同时我们还希望反应的选择性高 反应完全 以达到降低检测限的目的 在己发展的光化学传感器中 大多数反应 都符合这一要求 但仍然有一些在分析应用上很有价值的化学或生物反应 由于 反应产物稳定性高 或者反应过程中有气体或沉淀生成等原因 使得反应完成后 不能返回起始状态 这些反应往往有很高的检测灵敏度和专一性 仅仅由于反应 的不可逆性而使其难以移植到光化学生物传感器中 而且多数光化学传感器都是 基于敏感膜的传感器 敏感分子被物理包埋在聚合物膜中 敏感物质的流失和光 漂白现象是其难以克服的缺点 此外 样品与试剂对比色池的污染也常常是一个 令人头痛的问题 基于新生液滴光池的光化学生物传感技术的出现 为这些问题 的解决提供了一个新的方法m i 液滴光化学传感器是光化学传感器的新兴领域 具有广阔的发展前景 液滴 传感器的独特之处主要表现在探测光与样品之间的作用方式 新生液滴表面被用 流动注射液滴荧光法用于水溶性维生紊的分析研究 作无窗光池 取代了传统光度分析中所必需的人为光学界面的流通测量池 因而 消除了样品与试剂对比色池的污染以及因光学界面对光的吸收 散射等所引起的 对测量信号的影响 而且液滴光池近似光学透镜的形态具有聚光作用 使收集到 的透射光信号比普通流通池更多 提高了光耦合效率 因而大大提高传感器检测 的灵敏度和准确性 同时也克服了传统光化学传感器存在着敏感膜中敏感试剂的 易流失和光漂白的缺点 1 2 液滴光化学传感器的研究 1 2 1 液滴传感器的发展历程 液滴虽然是自然界一种常见的现象 然而一旦把它独 无二的特性如可重复 性 可更新性 体积一定以及无容积器壁等单独或是与其他技术结合起来应用于 科学领域 就能产生一些新颖而独特的分析装置和应用 某一特定的液体在管径固定的管道端面所形成的液滴体积是不变的 因此液 滴最早作为物理学中的定容装置 1 8 6 4 年 r a t e 率先开始对液滴的生长过程作 了详细的研究 得出一系列关于不同条件下液滴形成大小规律的理论 他指出 实 验证明 在相同条件下所产生液滴的重量是非常均匀的 其变化的大小不会超过 本身重量的百分之一 利用液滴的这一特性 t a t e 通过停流操作对在管的末端 形成的液滴作静态研究测量出液体的表面张力 9 1 1 9 2 2 年 h e y r o v s k y 利用金属 汞滴球形电极表面可更新的特殊电化学性质发明了滴汞电极极谱分析法 开辟了 现代分析新纪元 并因此而获得1 9 5 9 年n o b e l 化学奖1 1 0 液滴在各种光谱检测方法中可以充当无光窗光池 它可以消除在常规的光谱 检测中 样品装在或者是流过比色皿时所产生的背景光 降低噪声 因而提高检 测灵敏度 y o u n g 和w h i t e 首先进行了这方面的研究 1 1 9 7 7 年 d i e b o l d 和z a r e 设计了一套荧光检测体系 将液滴作为无光窗光池 他们将含有黄曲霉素的样品 溶液在重力作用下流过色谱柱 洗提液流经不锈钢管和固体棒之间缝隙并在端面 产生液滴 直接检测液滴的荧光信号 获得的黄曲霉素的检测限在亚皮克级 1 2 1 9 9 4 年m c m i l l a n 等人对液滴荧光装置进行了广泛的研究 研制了一种称作光导 纤维液滴分析仪 f i b e r d r o p a n a l y z e r f d a 的传感装置 首次将液滴应用于光化 学传感器m 1 6 这种光导纤维液滴分析仪包含一个液滴输出孔和两根光导纤维 2 南昌火学2 0 0 5 膈硕十研究生学位论文 其中一根用于传输激发光束 另一根用于传输发射光束 由于光纤直接接触液滴 这种光池并不是严格意义上的无光窗光池 1 9 9 5 年 美国德克萨斯科技大学的 d a s g u p t a 研究组提出液滴光化学传感器的思路 注意到液滴表面对于痕量气体的 收集效果理想 将液滴用作气体采样器 用于痕量气体的检测 7 q 9 随后 又将 该传感装置用于沉淀反应的浊度分析和溶剂萃取的化学体系 1 9 9 9 年 王柯敏 研究组研制了光纤液滴传感器 用于测定金属离子和有机分子和生物大分子m 刮 后来又在光纤液滴传感器的基础上 发展了以f 一2 5 0 0 和l s 5 5 荧光仪为基础的液 滴光化学传感器 并进一步研制出集吸光和荧光为 体的液滴光化学传感装置 1 2 4 图1 1 和1 2 是以l s 5 5 型荧光 磷光 发光光度计为基础的液滴光化学生物传 感装置的外观图和原理图 图1 1 以l s 5 5 型荧光 磷光 发光光度计为基础的液滴光化学生物传感装置的外观豳 流动注射液滴荧光法刚丁水溶性维生素的分析研究 c h a n n e l1 c h a n n e l2 l s 5 5l u m i n e s c e n c es p e c t o m e t e r 图1 2 以l s 5 5 型荧光 磷光 发光光度计为基础的液滴光化学生物传感装置的原理图 1 2 2 液滴测量技术在光化学传感器中的应用 1 2 2 1 液滴用作无光窗光池和反应池 采用传统的光学检测体系检测液体样品 通常将样品溶液注入透明的光学反 应池中 再让一束光通过检测池 这就可能存在样品池器壁对光的吸收 散射以 及反应过程中样品对器壁的污染问题 可能会对信号测量产生较大影响 在液滴 光化学传感装置中 液滴本身就是无需任何光窗的光池 消除了样品池器壁对检 测信号的影响 因而可提高测量的灵敏度和准确性 m a h o n e y 和h i e f t j e 描述了一种荧光分析方法用于检测液滴体积为6 n l 的乙 醇中所含的罗丹明6 g t l 3 这种液滴的产生方法源自于a b b o a 和c a n n o n 他们将 固定直径的钢琴丝不断地插入溶液 又不断地拔出 产生的液滴通过波长为5 1 4 5 1 1 1 1 1 的氩离子激光光束进行激发 罗丹明6 g 的检测限为3 7x 1 0 1 2g 采用常规的光学检测池监测沉淀反应中浊度变化遇到的最大困难是沉淀附 着在光池表面 干扰检测 u u 和d a s g u p t 设计了一套液滴光化学传感装置建立 了基于流动注射的浊度分析法 装置示意图如图1 3 从而解决了这一问题 3 3 5 5 四甲基联苯二胺二盐酸盐 t m b d 是一种非致癌显色剂并广泛应 用于临床分析中 t m b d 溶液在紫外区激发产生强荧光 其荧光信号能被溶液 中的硝基酚熄灭 且荧光信号强度与样品浓度在一定范围内呈线性关系 基于 4 南昌大学2 0 0 5 届硕十研究生学位论文 t m b d 荧光熄灭 杨荣华研制了硝基酚荧光液滴传感器 并应用于水溶液中2 4 一 硝基酚及药物硫酸奎宁的测定 取得了满意的结果 l 他在实验中还发现h 9 2 会对t m b d 产生氧化作用 使t m b d 的荧光增强 将此用于水溶液中h 9 2 含 量的测定 结果满意1 2 2 图1 3 将液滴直接用作光池的检测装置示意图 b 在化学和生物分析中 核酸的超微量检测有着非常重要的意义j 删 通常由 于d n a 的内源荧光很弱 使得难以用直接荧光法测定微量d n a m l 因此通常采 用高灵敏的分析试剂与d n a 作用导致敏感试剂的光学性质 吸光强度或荧光强 度 发生改变 再利用分光光度法或荧光法进行测定 常用的d n a 分析试剂包 括诸如中性红帆川 耐尔蓝1 3 u l 乙基紫1 3 3 以及芘或苯骈衍得物等1 w 目 这些试剂测 定d n a 时都表现出较高的灵敏度和良好的选择性 但由于与d n a 的反应过程 不可逆 难以移植到光化学传感器中 新生测量技术的出现和发展 为解决这 问题提供了新的办法 基于d n a 对t m b d 溶液的荧光熄灭作用 杨荣华等利 用液滴装置 设计了测定溶液中微量d n a 的新方法i 该方法操作简单 测量 d n a 的灵敏度高 且所需试剂和样品量都很少 肖丹用同步荧光吸光液滴传感 器测定飞摩尔水平的c r v s l 6 冯锋等利用自行研制的液滴光化学传感器对葡萄 流动注射液滴荧光法刖丁 水溶性维生素的分析研究 糖 硫胺素快速测定叫8 1 1 222 液滴作为气体样品取样器 当采用液滴作为耿样器时 由于液体蒸发离开液滴表面 接近表面的微粒就 会受到抑制1 3 9 利用液滴的这种特性 可以测定气体而不会受到微粒的干扰 将 液滴作为气体取样器的优点不仅仅在于收集气体的表面可不断更新 而且收集气 体所需要的溶液更少 此外用液滴收集气体重现性更好 更方便 更可靠 d a s g u p t a 研究组研制了一种基于液滴的气体采集与检测装置 用于检测空气 中的氯气p 2 1 将液滴作为气体收集器的思路是将有颜色变化或荧光强度变化的试 剂所形成的液滴悬浮于气体样品中 试剂与样品的相互作用可能会引起液滴的光 学性质发生变化 从而可实现对样品的实时检测 只要所选择的化学反应体系具 有专一性 便可构成具有选择性和重现性的气体光化学传感器 d a s g u p t a 等人将 含有g r i e s s s a l t z m a n 试剂的液滴悬挂于一根细金属丝的末端用于检测p p b v 级的 n 0 2 由于细金属丝的引导作用 液滴的表面形状非常接近球形 使得其表面积 最大 这样更有利于收集气体 4 3 基于同样的测量原理 他们还测定了空气中 h 2 0 2 和h 2 s i 目等气体 1 2 2 3 液滴中溶剂的萃取 对于液相样品的预富集和分离 萃取是一种很重要的技术 d a s g u p t a 研究小 组设计了一套集萃取和检测于一体的液滴传感装置 见图1 4 其基本原理是将 含有敏感试剂的有机相微液滴成长于一流动的水相液滴中 在两相交界面上发生 溶剂萃取作用 水相中的分析对象被萃取到有机相中 引起敏感试荆的光学性质 发生变化 保持有机相的液滴大小不变 流动水相不断地送至滴液头 被装置下 方的吸管吸掉 在整个采样与分析的周期中 有机相液滴的吸收信号由一个发光 二极管实时监测 这一体系的应用实例是通过阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠 s d s 与敏感试剂甲基兰形成离子对 并被萃取到氯仿液滴中 通过检测甲基 兰吸收信号的变化测定出水溶液中低于0 4p p m 的s d s 浓度 1 7 i 对于样品的萃取和检测而言 微量有机相液滴萃取体系具有很多优点 如它可以 作为其它分析方法 如高效液相色谱h p l c 气相色谱g c 的样品分离和预富 集部分 不仅提高了萃取效率 而且缩短了洗涤时间 减少了样品和有机试剂的 6 南昌夫学2 0 0 5 届硕十研究生学位论文 消耗量 c a n t w e l l 将液滴技术作为分类的工具 通过将牛血清白蛋白溶液中未键 合的黄体酮萃取到1 l 的正辛烷中 用气相色谱束定量测定黄体酮 i 由于液滴 和水的体积比很小 萃取过程不会干扰溶液中的平衡 因而可以精确地测定平衡 键台常数 h e 和l e e 也进行了类似的研究 将微滴萃取和g c 结合起来 能获 得比静态革取更短的时间以及更高的富集因子m 图1 4 水相液滴产生于有机相液滴方式萃取装置i 1 1 12 24 单分子荧光检测 对于微观领域的单分子信号检测一直是分析化学的研究热点 b a r n e s 通过微 小液滴方式实现了对罗丹明6 t 3 的单分子荧光检测h 实验中还发现如果将激发 光由液滴内部通过光纤引出 那么液滴对光的散射作用将会减小很多 徽液滴在 液体单分子检测中具有明显的优势 首先 1p l 的微量检测体积仅受液滴大小控 制而不需要激发光束的聚焦效果 这样每一存在的分子都能被检测到 第二 采 用电动力场悬浮技术 液滴可悬浮在该场中 使得激光与待测样品作用时间比光 漂白时间长得多 从而提供尽可能多的信号 第三 液滴的空穴量子电动力效 应 能大大提高原子或分子的辐射性能 尤其是同步激发速度及集成荧光都大大 增强了 7 流动注射液滴荧光法川丁水溶性维生素的分析研究 1 3 水溶性维生紊的分析研究 13 1 维生素研究的意义 维生素是维持机体正常生命活动不可缺少的一类小分子有机化合物 尽管机 体对这类物质的需要量很少 但由于这类物质在体内不能合成 或合成量不能满 足机体的需要 故必须不断从食物或药物中摄取 通常按照溶解性质将维生素分 为脂溶性维生素 如维生素a 维生素d 维生素e 维生素k 等 和水溶性维 生素 维生索b 族 维生素c 维生素p p 等 两大类 维生素是食物的构成成 分 他们都是天然有机化合物 在生物体的生命活动中具有十分重要的作用 是 维持人体正常生理生化功能不可缺少的营养物质 各种维生素都有不同的生理生化功能 在蛋白质 脂肪 糖和有机体的能量 代谢中有着重要的位置 例如 维生素b 1 和b 2 参与细胞代谢中三羧酸循环的作 用 维生素b 6 和叶酸参与蛋白质的代谢作用 维生素b 和维生素p p 参与糖的 代谢 维生素b 2 和维生素p p 参与脂肪酸代谢作用 维生素c 参与体内抗原 胶原和组织修补以及糖 脂肪 蛋白质的代谢 保持血管完整等 由于维生素参 与了许多生物代谢过程 与人体的健康密切相关 当人体缺乏某种维生素时 会 引起相应的维生素缺乏症 例如 缺乏维生素b 能引起神经炎和脚气病 维生 素b 缺乏症为口角溃疡 唇炎和舌炎以及引起眼睛白内障 缺乏叶酸会引起巨 幼红细胞贫血 心脏病及胎儿神经软管缺陷 缺乏维生素c 时会引起坏血病等 近年来 人们对维生素越来越关心 尤其是知道某些维生素能防止癌症和冠 心病以来 对维生素更感兴趣 其研究工作不断扩大 人们研究各种维生素的生 理生化功能时 除需要了解其化学特性 来源以及各种食物中的含量外 更重要 的是需要一套检验与分析各种维生素的方法 研究出准确 快速 灵敏度高 选 择性好的方法测定药物 食物和生物样品中维生素的含量是国内外研究工作者一 直致力从事的工作 这对食品和药物的质量监控 疾病的诊断和治疗以及生命科 学等领域的研究起到重要的推动作用 1 3 2 水溶性维生素分析的主要方法 随着科学技术的发展 各种维生素的检测技术也有很大发展 最初维生素的 南昌火学2 0 0 5 届硕十研究生学伉论文 检定是以测定缺乏维生素的动物的特殊效应为基础的 但这些方法成本高 又费 时 经过多年的努力 已有较简便和准确的测定方法 如光度法 电化学分析法 荧光法 化学发光法 色谱法以及液质联用等 其中荧光分析法具有灵敏度高 选择性好 分析速度快 操作简便 易于推广等优点 在药物 食品和生物样品 中痕量维生素的检测中备受青睐 以下概述了水溶性维生素分析的主要方法 1 3 2 1 分光光度法 1 9 4 2 年 s t o k s t a d 首次成功合成了叶酸 并阐明了叶酸的化学结构 半个世 纪过去了 叶酸一直是学术界的研究热点 n a g a r a j a 利用叶酸还原产物中的对 氨基苯甲酰谷氨酸能发生偶联反应的性质 将其与二苯胺偶联得到紫色产物 最 大吸收波长为5 8 0n m 当与3 氨基酚偶合产物呈橙黄色 最大吸收波长为4 6 0 n m 当与铝酸铵和邻苯二酚反应时淡红色产物的最大吸收波长为4 9 0n m 因而 可利用分光光度法对药物中叶酸的含量进行测定 分光光度法是测定抗坏血酸最早使用的方法 通常是利用抗坏血酸和体系中 的物质反应 生成有色的物质或使原来有颜色的化台物褪色 检测体系的吸光度 的变化计算出抗坏血酸的浓度 帅 维生索b b 2 b 6 的紫外光谱严重重叠 难以用分光光度法直接测定 a b e r a s t u r i 等先测定水溶性混合维生素样品的总吸光强度 然后利用偏微分最小 平方回归法对测得的数据进行处理 可同时测定叶酸 维生素b l b 2 和b 6 1 6 1 1 也有人用一种基于卡尔曼滤波的线性神经网络同时测定b 族维生素混合组分1 6 2 1 32 2 化学发光法 n i e 利用次氯酸钠 叶酸 氨基脲盐酸盐体系 流动注射化学发光法测定叶 酸m s o n g 报道了抑制化学发光法测定叶酸 该方法的原理是叶酸和铁氰化钾 在碱性条件下快速发生氧化反应 生成亚铁氰离子 它抑制铁氰离子与鲁米诺的 化学发光反应 检测发光信号的变化测定叶酸的含量i 卅 抗坏血酸与高锰酸钾隅删 鲁米诺 f e 1 1 1 过氧化氢州 罗丹明b c e w 硫酸 6 b 体系作用产生化学发光 而对鲁米诺和铁氰酸盐 6 1 f e i i 鲁米诺体系1 7 0 的化 学发光有抑制作用 检测体系发光信号的变化定量测定抗坏血酸 鲁米诺和过氧化氢在碱性介质中发生反应 产生化学发光 维生素b 1 使化 流动注射液滴荧光法埘丁水溶性维生素的分析研究 学发光信号增强 吕九如等基于此原理建立了化学发光法测定维生素b 在酸 性条件下 维生素b 2 与高锰酸钾和亚硫酸钠发生化学发光反应 维生素b 2 的浓 度在1 0 x 1 0 一 1 0 x 1 0 5 9 m l 范围内与化学发光强度呈良好的线性关系1 7 2 1 3 2 3 荧光光度法 叶酸本身无荧光 但用k m n 0 4 m h 2 0 2 j p b 0 2 氧化可转变为荧光化合 物 利用荧光法检测 l a p a 和黄朝表等人报道了光化学荧光法测定叶酸i 硎 抗坏血酸本身也没有荧光 可通过衍生化方法转变为强荧光物质1 7 s e o l y a n g 等研究发现在p h1 0 2 1 0 5 介质中 抗坏血酸和2 3 二胺基萘 d a n 反应生成 强荧光物质 加入b 环糊精使体系的荧光强度大大增强 维生素b 2 和b 6 有荧光 b 在碱性介质中可氧化为具有荧光的硫胺荧 因此 可用荧光法对这些化合物进行测定 王柯敏等用h g i i 将维生素b 1 氧化 利用 液滴光化学传感器测定维生素b 1 3 s 许金钩基于b l 的光化学荧光衍生化反应和 b t 的光分解反应 光化学动力学荧光法测定b 1 和b 6 i s 3 g a r c i a 用同步荧光法测定上述三种维生素b i 州 也有人应用人工神经网络处 理数据同时测定维生素b l b 2 和b 6 的含量陋 1 3 2 4 电化学分析法 s z c z e p a n i a k 等采用吸附溶出伏安法测定叶酸片剂及含铁制剂中的叶酸m 示 差脉冲溶出伏安法嗍和悬汞电极吸附 阴极溶出伏安法i l 钡0 定叶酸也有人报道 南京大学的陈洪渊研究小组报道了在晶体管敏感区域修饰m n 0 2 纳米颗粒 制成离子敏感场效应晶体管 i s f e t 抗坏血酸与m n 0 2 纳米颗粒反应 会引 起p h 发生变化 可由i s f e t 检测 p h 的变化与抗坏血酸的浓度相关m t e i x e l r a 用v o s a l e n 修饰碳电极 伏安法测定维生索b 6 但维生素b 1 会 产生干扰即j 1 3 2 5 色谱法和质谱法 1 9 9 5 年 s a n t h o s h k u m a r 等提出用气相色谱 质谱法 g c m s 检测红细胞叶 酸的含量 填补了直接检测样品中红细胞叶酸浓度的空白l 蜘 z h a n g 等人将植物 样品中所有叶酸衍生物经化学方法转化为对一氨基苯甲酸 h p l c 分离 用荧光 胺柱后衍生 荧光法测定马铃薯 胡萝h 大白菜和菠菜中叶酸的总含量m j 南昌火学2 0 0 5 崩硕 研究生学位论文 k o z h a n o v a 利用高效液相色谱 h p l c 将含有多种维生素的样品经两次色 层分离 u v 检测器检测 测定样品中水溶性维生素 维生素b b 2 b 6 b 2 叶酸 泛酸 烟酸和烟酰胺 和脂溶性维生素 维生素k 3 d 2 d 3 a 和e 的含量 近年来 液质联用在水溶性维生素的分析中起到重要的作用 l e p o r a t i a 报道了高效液相色谱一质谱联用测定水溶性维生素b b 2 b 6 p p 烟酸和烟酰 胺 叶酸以及泛酸嗍 1 3 2 6 原子光谱法 王伟等在p h 5 o 的h a c n a a c 缓冲溶液中加入过量硝酸银使叶酸沉淀完全 滤去沉淀后 采用电感耦合等离子体原子发射光谱法 i c p a e s 测定滤液中剩 余的硝酸银 间接测定叶酸的浓度 扩宽了电感耦合等离子体原子发射光谱法在 药物分析方砸的应用 啊 利用坑坏血酸与高价态金属离子的氧化还原反应 离子交换树脂选择性吸 附 火焰原子吸收光谱法间接检测抗坏血酸 删 郎惠云等在弱酸性介质中 用新制各的二氧化锰与维生素b 6 发生氧化还原 反应 二氧化锰被还原为m n i i 通过流动注射 原子吸收光谱检测m n 1 i 间 接测定维生素b 6 上述几种检测水溶性维生素的方法各有自身特点 分光光度法虽然操作简便 但 灵敏度低 电化学分析法中 工作电极制作麻烦且电极的稳定性和重现性欠佳 原子光谱法分析时间长 样品消耗大 色谱法和液质联用在分析复杂样品时具有 很大的优势 但操作复杂 条件要求苛刻 荧光法和化学发光法操作简便 分析 速度快 选择性好 灵敏度高 易于推广应用 在药物 食品和生物样品中痕量 维生素的检测中备受青睐 随着人们对各种维生素在生物代谢过程中的 乍用的认 识逐渐深入 迫切需要研究和发展快速 灵敏 专一 准确的方法检测维生素 以满足生命科学 食品科学以及制药工业等研究领域的需求 1 4 本论文拟开展的工作 液滴光化学生物传感技术在溶剂萃取和气体分子 有机分子 生物分子 单分子荧光检测等方面均已开展了应用 并取得了一些成果 但其相关的理论与 方法还有待补充和完善 应用体系有待于进一步拓展 将液滴光化学传感技术与 流动注射液滴荧光法h j 于水溶性维生紊的分析研究 其它分析方法结合起来 可以更好地拓展其应用范围 例如 将流动注射技术和 液滴荧光技术结合起来 可使不同种类的试剂和样品既可以在检测装置前进行预 富集和预分离 又可以在微型三通器中进行即时反应或在反应器中受热发生反 应 因而可建立一种高效实时 重现性好 低耗快速的新型检测方法 维生素是维持人体正常生命活动所必需的营养物质 在生物体中其中重要 的作用 鉴于维生素特殊的生理功能 对药物和食品中维生素的检测有着重要的 意义 本文拟利用以l s 5 5 荧光分光光度计为基础的液滴传感装置 对水溶性维 生素如叶酸 抗坏血酸 复合维生素b 进行检测 以拓展液滴光化学传感技术 的应用领域 1 在酸性条件下 叶酸被高碘酸钾氧化为强荧光的喋呤一6 一羧酸 基于此原 理 拟建立流动注射液滴荧光法检测药物制剂中叶酸的含量 考察高碘酸钾的浓 度 溶液p h 值 温度及流速等因素的影响 优化实验条件 2 抗坏血酸能被h g i i 氧化为脱氢抗坏血酸 然后与邻苯二胺缩合 生成 强荧光的喹喔啉衍生物 根据此衍生化反应 利用流动注射液滴光化学生物传感 器测定溶液中的抗坏血酸 拟探讨抗坏血酸测定的工作条件 并应用于维生素c 片中抗坏血酸含量的检测 3 利用葡聚糖c m c 2 5 对维生素b l b 2 b 6 的选择性吸附性质和维生素b b 在碱性条件下的不同荧光表现 拟发展一种新型的基于固体基质的流动注射 液滴荧光分析方法用于复合维生素b 中多组份的联合检测 分别研究葡聚糖 c m c 2 5 对维生素b 1 b 2 b 6 的吸附隋况和维生索b 1 b 6 在碱性铁氰化钾溶液 中的荧光变化 具体探讨测定复合维生素b 的最佳工作条件和作用机理 应用 于复合维生素b 药片和人工合成样品的检测 南昌火学2 0 0 5 俑硕十研究生学位论文 第2 章流动注射液滴荧光法用于药物制剂中 叶酸含量的测定 2 1 前言 叶酸 维生素b n 4 一 2 氨基 1 4 一二氢一4 氧 6 喋呤甲基 氨基苯甲酰 一l 谷 氨酸 是一种水溶性b 族维生索 是维持人体健康所必需的营养物质 生化和 医学研究者已证明 叶酸作为 9 十辅酶 对嘌呤 嘧啶 核酸 蛋白质的生物合 成 细胞分裂和生长具有特别重要的作用f l o o 缺乏叶酸 容易导致生理功能低下 及某些疾病如巨幼红细胞贫血症 胃肠功能紊乱 智力退化及神经管畸形新生儿 的发生 近年来 叶酸日益成为医学 生物学和化学研究领域的热点之 由于叶酸 在天然样品中含量很低 组成复杂而且稳定性差 因此叶酸在所有维生素研究当 中 很可能是对研究工作者的最大挑战 目前测定叶酸的方法主要有