蛋白酶水解糯米酒糟的工艺优化.doc

蛋白酶水解糯米酒糟的工艺优化刘达玉1 , 张学峰2 ,夏兵兵2 ,吴建国2(1 . 成都大学生物产业学院 ,四川 成都 610106 ; 2 . 四川理工学院生物工程学院 ,四川 自贡 643000)摘 要 :分别采用酒用酸性蛋白酶 、木瓜蛋白酶水解糯米酒糟 , 优化提高水解液中氨基态氮含量的工艺条件 。不同蛋白酶的水 解 实 验 结 果 表 明 , 酒 用 酸 性 蛋 白 酶 的 水 解 效 果 最 理 想 。糯 米 酒 糟 水 解 的 最 优 条 件 为 : 加 酶 量2 000 U/ g 酒糟 、料液比 1 3 、p H3 . 5 、温 度 40 、时 间 5 h 。在 此 工 艺 条 件 下 , 水 解 液 中 氨 基 态 氮 含 量 达 到0 . 75 g/ L ,比初始糯米酒糟液提高了 368 . 75 % 。关键词 :糯米 ;酒糟 ;蛋白酶 ;水解 ; 氨基态氮中图分类号 : TS201 . 3 ; TS201 . 2 + 5文献标志码 : A文章编号 :1003 - 6202 ( 2011) 09 - 0024 - 04Optimization hydrolysis processing of glutinous rice wine lees by proteaseL iu Dayu1 , Zha ng Xuef eng2 , Xia Bingbing2 , Wu J ia nguo 2( 1 . College of Biolo gy Indust r y , Chengdu U niver sit y ,Chengdu 610106 ,China ; 2 . College of Biolo gy Engineering , Sichua n Insti2t ute of Science a nd Technolo gy , Zigo ng 643000 ,China)ABSTRACT : In o r der to i ncrea se a mino nit ro gen co ntent in t he hydrolysate , t he hydrolysi s p roce ssing of gl utino us rice wine lees were op ti mized by acid p ro tea se fo r alco holic beverage and pawp aw p ro tea se , re sp ectively. The hydrolysi s experiment re2 sult s of diff erent p ro tea se sho wed t hat acid p ro tea se fo r alco holic beverage wa s bet ter ; The op timal hydrolysi s co nditio ns were :p ro tea se a mo unt of 2 000 U p er 1 g wine lee s , solid2liquid ratio of 1 3 , p H3 . 5 , reactio n temperat ure 40 a nd reactio n ti me5 h . U nder t he se co nditio ns , amino nit ro gen co nt ent in hydrolyzate achieved to 0 . 75 g/ L , w hich wa s increa sed by 368 . 75 %co mp ared to t hat of t he initial gl utino us rice wine lee s.KEYWORDS : gl utino us rice ; wine lee s ; p ro tea se ; hydrolysi s ; a mino nit ro gen醪糟因其含有丰富的糖类和特有的风味物质 ,以及低度的酒精含量 , 在川菜烹饪 、特色肉食品加 工 、民间家庭都具有广泛的消费市场 。氨基酸和糖类的美拉德反应 ,是制取各种风味剂特别是在菜肴香精的重要生化技术手段 ,酶解使醪糟酒中保持很 高的氨基酸含量 ,适度的酒精含量 ,既提高了烹饪醪 糟的营养价值 ,又促成了菜肴在高温烹饪过程中 ,氨基酸 、糖类与油脂 、调料混合在一起 ,发生复杂的美 拉德反应 ,生成浓郁的香味物质和色素物质 ,更显著地提高烹饪菜肴的色香味 ,与传统醪糟相比 ,更进一 步提高烹饪食品风味 。为探求一种高产烹饪液体醪糟的蛋白酶解工艺 条件 1 ,将糯米酒糟中蛋白质尽可能全部水解利用 ,提高原料利用率和出品率 ,生产无渣液态醪糟 ,作为传统烹饪醪糟的替代产品 。新型无渣液态醪糟二次 发酵工艺流程 :第一次 ,浸米 蒸煮 淋饭 复合菌接种 复合发酵 压榨 醪糟酒半成品 灭菌 冷却 醪糟酒 ;第二次 ,酒糟及酒的沉淀物 灭菌冷却生物酶解 压榨 灭菌冷却 二次醪糟酒 。将两 次产品进行勾兑 ,即为液体醪糟酒 。第二次酶解加入酸性蛋白酶 ,使酒糟中蛋白质进一步水解 ,保证了醪糟酒中氨基酸含量 ,将糯米绝大部分加工成液体 醪糟 ,只留下很少固态酒糟 。现有对酶法水解酒糟的研究颇多 ,然而其蛋白酶添加量按照酒糟质量的百分比进行添加 ,忽略了 不同蛋白酶的酶活力不同 ,即使同一蛋白酶 ,型号不同 、酶活力亦不同 ,造成了不同蛋白酶水解酒糟结果 不具备对比性 ,同时也忽视了酶具有异味和颜色 ,会 影响氨基酸水解液及其产品的风味 。酶法水解酒糟不仅仅是一味通过增加蛋白酶用量 ,来提高酒糟水 解液中氨基态氮含量 。为此 ,笔者根据蛋白酶的特 性 ,从不同角度优化蛋白酶的最佳水解条件 ,以获得氨基酸含量较高的水解液 223 。收稿日期 :2011205219 ;修回日期 :2011208224基金项目 :四川省教育厅川菜研究项目“烹饪型液体醪糟的开发研究”( CC07 Z02)1 材料与方法1 . 1 材料与仪器糯米酒糟 :本实验室生产醪糟酒所得副产物 ,蛋 白质质量分数 15 . 44 % ,水分52 . 55 % 。食 用 级 蛋 白 酶 : 酒 用 酸 性 蛋 白 酶 ( 酶 活 力50 000 U / g) ,木瓜蛋白酶 (酶活力 650 000 U / g) 。FO SS 凯氏定氮仪 、H I98107p H 计 、H H2Z4 恒 温水浴锅 、8521 磁力搅拌器等 。1 . 2 实验方法称取 50 g 湿糯米酒糟放进 250 ml 烧杯中 , 根 据设定的液固比加入定量的蒸馏水 ,充分搅拌后 ,用质量分数 10 %NaO H 或者质量分数 10 %柠檬酸调节 p H 值至所需值 。再加入设定量的蛋白酶 ,保证 每克糯米酒糟达到设定的酶活力 ,最后放入恒温水 浴中 ,使其发生反应 ,根据需要确定时间 。水解结束后 ,对蛋白酶进行灭活处理 ,对酶解液进行离心 ,取上清液 ,弃去沉渣 ,测定水解液中氨基态氮含量 。1 . 3 分析方法(1) 蛋白酶活力的测定采用福林2酚试剂法 。(2) 蛋白质的测定采用凯氏定氮法 4 。(3) 酸度采用 p H 计测定 。(4) 游离氨基态氮的测定采用甲醛滴定法 。 由于加酶量1 0003 000 U / ( g 酒糟) ,对蛋白酶来说 ,相当于添加质量分数 0 . 02 %0 . 06 % , 而 糯米酒糟中蛋白质质量分数 15 . 44 % 。因此 , 蛋白酶占 总 蛋 白 质/ 总 氮 的 比 例 非 常 低 , 约 0 . 13 %0 . 39 % ,总氮测定数据中已经扣除 。由于酶本身不 会转化为氨基态氮 ,因此 ,添加的酶对氨基态氮几乎无影响 。酶水解糯米酒糟的最佳时间为 5 h 。图 1 酒糟中氨基态氮含量随酶解时间的变化2 . 1 . 2酶解温度的确定 温度对酶促反应的影响有两个方面 ,一是酶促催化反应 ,和一般的化学催化反应一样 ,随温度的升 高而加速 ;二是温度过高会造成酶的失活 ,使反应速 度减慢 。因此 ,酶催化反应有一个最适温度 ,但这个温度不是酶的特征常数 ,即不是一成不变的 ,它受酶 促反应体系中多种因素的影响 ,需要在具体的运用 中加以优化 5 。选 定 酶 解 条 件 为 :p H3 . 0 , 加 酶 量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比为 1 3 , 分别于 35 、40 、45 、50 下 对 酒 糟 水 解 5 h 。由 图 2 可 知 , 在 3540 ,氨基态氮含量上升较快 ,而在 4055 ,氨基 态氮含量缓慢下降 ,故确定最佳酶解温度为 40 。图 2 酒糟中氨基态氮含量随酶解温度的变化2 . 1 . 3 酶解 p H 值的确定每种酶都有最适的 p H 值 ,当反应条件远离该 值时 ,酶活性中心的构象甚至整个酶分子结构发生改变 ,而导致酶蛋白变性失活 ,酶活力中心常含有可离解的基团 ,这些基团的离解程度以及活力中心结 构与 p H 值密切相关 ,同时底物也受 p H 值影响 ,从而 p H 值能显著影响酶2底物 ( ES) 的结合与反应 4 。 选定酶解条件为 : 时间 5 h ,温度 40 ,加酶量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比为 1 3 ,分别于 p H 值为2 . 5 、3 . 0 、3 . 5 、4 . 0 条件下对酒糟水解 , 结果如图 3 所示 。在 p H2 . 53 . 5 ,氨基态氮含量上升较快 ,而 p H 值大于 3 . 5 时 ,氨基态氮含量有所降低 。因此 ,糯米酒糟水解的 p H 值应控制在 3 . 5 左右 。2结果与分析2 . 1酒用酸性蛋白酶水解酒糟的最佳工艺确定2 . 1 . 1酶解时间的确定选定酶 解 条 件 为 : 温 度 40 , p H3 . 0 , 加 酶 量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比 1 3 , 对 糯米 酒糟 水解7 h ,每小时取样测定氨基态氮含量 。由图 1 可知 ,随酶解时间延长 ,水解液中氨基态氮含量不断增加 。 在 45 h ,氨基态氮含量增幅较快 ;在 57 h ,氨基态氮含量增长趋势极为缓慢 。 这主要是因为随着水解时间的延长 ,底物浓度显著降低 ,溶液中水解产物的浓度逐渐增大 ,所以过高的产物浓度和过低的底物浓度会对水解反应产生 抑制作用 。因此 ,出现 5 h 后氨基态氮含量增长明显减弱的现象 。试验中同时发现 ,酶解时间超过5 h后 ,水解液容易变混浊 ,综合考虑确定酒用酸性蛋白2 . 2木瓜蛋白酶水解酒糟的最佳工艺的确定2 . 2 . 1酶解时间的确定选定酶 解 条 件 为 : 温 度 55 , p H6 . 4 , 加 酶 量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比 1 3 , 对 酒糟 进行 水 解7 h ,每小时取样测定氨基态氮含量 。由图 6 可知 ,木瓜蛋白酶水解酒糟反应符合一 级反应方程式 ,最初的 15 h 内水解反应迅速 ,5 h 后水解度增加缓慢 。综合考虑木瓜蛋白酶水解糯米酒糟的最佳水解时间为 5 h 。图 3 酒糟中氨基态氮含量随 p H 值的变化2 . 1 . 4加酶量的确定选定酶解条件为 :时间 5 h ,温度 40 ,p H3 . 5 ,料液 比 为 1 3 , 在 五 个 平 行 样 中 分 别 加 入 800 、1 000 、1 500 、2 000 、3 000 U / ( g 酒糟) 的酒用酸性 蛋白酶进行水解 ,分别取样测定不同加酶量下的氨基态氮含量 ,如图 4 所示 ,图中“酒酶”代表酒用酸性蛋白酶 。当加酶量小 于 2 000 U / ( g 酒糟) 时 , 氨基 态氮 含 量 随 加 酶 量 的 增 加 迅 速 提 高 , 当 加 酶 量 大于 2 000 U / ( g 酒糟) 时 , 其 提 高 减 缓 , 考 虑 到 成 本 因素 ,故确定其最佳加酶量为2 000 U / ( g 酒糟) 。图 6 酒糟中氨基态氮含量随酶解时间的变化2 . 2 . 2酶解温度的确定选 定 酶 解 条 件 为 :p H6 . 4 , 加 酶 量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比为 1 3 , 分别于 45 、50 、55 、60 、65 下对酒糟水解 5 h 。酶解后测定不同酶 解温度下的氨基态氮含量 。由图 7 可知 ,在4060 时 ,随温度升高 ,氨基态氮含量逐渐增加 ,当大于 60 时 , 氨基态氮含量 出现 下 降 趋 势 。故 木 瓜 蛋 白 酶 最 佳 水 解 温 度 为60 。图 4 酒糟中氨基态氮含量随加酶量的变化2 . 1 . 5底物浓度的确定选定酶解条件为 :时间 5 h ,温度 40 ,p H3 . 5 ,加酶量 2 000 U / ( g 酒糟) ,分别于 1 2 、1 3 、1 4 料液比下水解 ,测定不同料液比下的氨基态氮含量 。 由图 5 可知 ,随着料液比的增加 ,氨基态氮含量逐渐降低 ,且料液比越大氨基态氮含量降低幅度越大 ,这 主要是由于水解液体积增加造成的 。料液比 1 3 与 1 2 相比水解度稍低 , 但与料液比 1 4 相比较高 ,综合考虑水解液体积与浓度 ,同时考虑到水解液 中氨基态氮总量 ,故最佳料液比为 1 3 。图 7 酒糟中氨基态氮含量随酶解温度的变化2 . 2 . 3酶解 p H 值的确定选定酶解条件为 : 时间 5 h ,温度 60 ,加酶量1 000 U / ( g 酒糟) ,料液比为 1 3 ,分别于p H 6 . 0 、6 . 5 、7 . 0 、7 . 5 条件下对酒糟水解 , 测定在不同 p H值条件下的氨基态氮含量 。由图 8 可知 , 介于p H6 . 5 7 . 0 之间出现氨基 态氮含量的峰值 ,故木瓜蛋白酶水解糯米酒糟的最 适 p H 值选定在 6 . 8 附近 。图 5 酒糟中氨基态氮含量随料液比的变化图 10 酒糟中氨基态氮含量随料液比的变化2 . 3两种蛋白酶对比重复试验 不同蛋白酶的酶解工艺指标对照结果见表 1 。经比较可知 ,酒用酸性蛋白酶水解糯米酒糟 ,所得氨 基态氮含量最高 ,故若选用单一酶水解酒糟时 ,两种蛋白酶中 ,首选酒用酸性蛋白酶 。水解过程中 ,酒用 酸性 蛋 白 酶 p H3 . 5 , 较 接 近 糯 米 酒 糟 液 的 自 然p H3 . 83 ,而木瓜蛋白酶最适 p H 值为 6 . 8 ,调节水解 体系的 p H 值时会经过等电点 ,从而造成水解效果欠佳 。表 1 不同蛋白酶的酶解工艺指标对照图 8 酒糟中氨基态氮含量随 p H 值的变化2 . 2 . 4加酶量的确定选定酶解条件为 :时间 5 h ,温度 60 ,p H6 . 8 ,料液 比 为 1 3 , 在 5 个 平 行 样 中 分 别 加 入 800 、1 000 、1 500 、2 000 、3 000 U / ( g 酒糟) 的木瓜蛋白 酶进行水解 ,分别取样测定不同加酶量下的氨基态氮含量 ,如图 9 所示 ,图中“木酶”代表木瓜蛋白酶 。 由图 9 可知 ,随着酶用量的增加 ,氨基态氮含量逐渐增加 ,而当加酶量超过2 000 U / ( g 酒糟) 后 ,氨基态氮含量增加减缓 ,从生产成本考虑 ,故选用最佳 木酶添加量为2 000 U / ( g 酒糟) 。初始酒糟液酒用酸性 木瓜指标蛋白酶蛋白酶p H 值料液比 温度/ 时间/ h酶添加量/ U ( g 酒糟)3 . 831 3常温0 . 163 . 501 34052 0000 . 160 . 750368 . 756 . 801 36052 0000 . 160 . 525228 . 13- 1酶解前氨基态氮含量/ g L - 1酶解后氨基态氮含量/ g L - 1提高率/ %3结论(1) 在两种蛋白酶中 ,酒用酸性蛋白酶的水解效 果较好 , 其 最 佳 工 艺 条 件 为 : 酶 解 时 间 5 h , 温 度40 , p H3 . 5 , 加 酶 量 2 000 U / ( g 酒糟) , 料 液 比1 3 。该方法所得糯米酒糟水解液中氨基态氮含量 比初始糯米酒糟液提高了 368 . 75 % 。(2) 通过对比可知 ,水解过程中 ,酒用酸性蛋白 酶 p H3 . 5 ,较接近糯米酒糟液的自然 p H3 . 83 ,而木瓜蛋白酶最适 p H 值为 6 . 8 ,调节水解体系 p H 值时 会经过等电点 ,从而造成水解效果欠佳 。(3) 由于糯米酒糟蛋白质的结构特点带来了水 解的困难 ,糯米酒糟蛋白质的水解度还有待于进