微生物领域中的物理诱变.docx

南开大学物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用物理科学学院 1110293尚彤彤2012/12/8摘要：综述了紫外线、空间诱变、离子注入、激光四种物理诱变方法的原理与应用物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用物理科学学院 1110293 尚彤彤目前，随着人口的增多和资源的匮乏，开发新能源或者提高资源利用率和回收率等成为人们研究的重点。微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中发挥着越来越重要且不可替代的独特作用，也为人类带来了巨大的社会效益和经济效益。但微生物菌种的自然突变率很低，单纯依赖自然突变选育好的菌株远不能满足人们的需求，为了获得高产、低耗、优质的菌种，人们常常通过外界物理、化学、生物因子等因素的改变诱发基因突变。常用的诱变方法包括物理诱变和化学诱变。传统的物理诱变是利用各种射线（包括紫外线、X射线、射线、快中子、微波、超声波、电磁波和宇宙射线等）为诱变源，对生物靶进行诱变。近年来，又兴起一些新型高效的诱变方法，如空间诱变、离子注入诱变、激光诱变等，他们操作简单、安全，而且具有突变谱宽和在一定程度上能克服菌种对传统诱源的抗性饱和等优点。下面介绍一些物理诱变原理及其应用。1、紫外线诱变原理：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm。紫外线可使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，引起突变或死亡。嘧啶二聚体的形成还会妨碍DNA双链的解开，影响其复制和转录。应用：在食品方面，它是最常用的技术，因为它操作简单且效果明显。比如以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，经过紫外线诱变（15W紫外灯，照射距离30cm，时间为20s），定向选育出具有磺胺胍抗性的突变株，其L-色氨酸产量比原菌株产量提高了110%；对产曲酸的米曲霉菌株、抗噬菌体保加利亚杆菌、浓香型枸杞久酿造酵母等进行紫外线诱变选育均取得了较理想的成果。同时很多研究者将紫外诱变结合其他诱变方式配合使用，更是产生了突出的效果。比如将紫外线与硫酸二乙酯结合使进行复合诱变，筛选到了巨大芽孢杆菌突变株，其淀粉酶和蛋白酶活性性较出发菌株分别提高96.4%和126.58%，突变株经5次传代后，性能保持稳定。邹建忠交叉采用紫外线照射和光复法对酒精酵母进行诱变，获得1株耐高温型酒精酵母，在40下，其产酒率比出发菌提高了11.1%，且对温度、酸度和盐度变化的耐受力也更好。环境工程方面，随着工农业的发展，化肥和化工品的大量使用，有机废物的排放量不断增大，难降解的有毒有机物的排放量不断增多，高耐毒性、高降解活性以及特异或光谱降解污染物的特殊细菌用于处理特殊污水，并且起到很好的效果。近年来有一种新的理论认为活性污泥是一个微生物的生态群体，这些微生物存在着紫外线敏感性差异，适当的紫外线辐射会改变活性污泥的微生物组成结构。紫外线增强活性污泥的生化降解能力，实际上是利用紫外线抑制活性污泥中的非目标菌群的生长，消除目标菌群在污水中的营养物质竞争对手，优化目标菌群的生长环境，最终达到所需要的增强效果。2、空间诱变育种原理：空间诱变育种是指利用返回式卫星、飞船或高空气球将生物材料搭载到太空, 利用太空特殊的环境对生物材料进行诱变, 再返回地面选育新种质、培育新品种的生物育种新技术。高空条件下的微重力水平、真空度、质子与电子辐射强度均较高, 其大气结构、气温、空气密度、压力、地磁强度、辐射流均与地面有很大差异, 另外, 还有强烈的紫外线照射等。这些空间条件都有可能引起微生物发生遗传性变异。一般认为太空辐射和微重力是空间育种的主要诱变因素。空间突变的最大特点是突变频率高、突变谱广、变异幅度大、变异性状稳定快, 可获得传统诱变难以得到的有益突变, 从而明显改良微生物某些特性。应用：对经历了太空飞行的利用木糖产L - 乳酸的野生菌株进行筛选后, 得到1株正向突变菌株Lt- s, 其L - 乳酸产量较出发菌株提高约12. 0%；对经航天诱变的啤酒酵母菌进行复壮和筛选, 得到了1株发酵力、生长速度都好于出发菌株的突变体；对从SF8卫星搭载的4个酿酒酵母样品中筛选到的酵母突变株进行研究, 发现与原始菌株相比, 突变株2. 0016 - M 各项指标增加均达极显著水平(P 0. 01), 其中生物量增加46. 7%, 细胞壁占酵母干重比率增加3. 8%, 细胞壁厚度增加62. 6%, - 葡聚糖含量增加146. 8%, 甘露聚糖含量增加18. 8%, 而突变株FL03- M 的生物量变化不显著, 其他各项指标都显著降低21。可见空间诱变是提高酵母菌株细胞壁多糖含量的一种有效手段, 但不同酵母菌株对空间环境的敏感性不同。随着空间诱变机理研究的深入, 相信这一技术将会更好地为食品工业微生物育种服务。3、离子注入诱变原理：离子注入是一种新型诱变方法，自国外六十年代中后期相继把离子注入技术应用于生物学领域的研究。由于目前研究水平和研究手段的限制，低能离子生物学的研究主要侧重于对离子注入诱变机理的探索和对生物效应的研究两方面。离子束特别是低能离子束对微生物有着很好的诱变作用, 低能离子注入生物体组织或细胞, 从而使染色体产生变异的效应包括以下四个过程: 能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交换。低能离子束具有很强的致突变作用, 并具有射程的可控性、集束性和方向性,能够显著提高生物的变异率, 获得损伤轻、突变率高、突变谱广的诱变结果。离子注入与传统的X射线、C射线等其它辐射源相比, 具有很多优势: 传能线密度大, 生物生化作用强, 主要效应是局部可控可选择, 辐照的离子参数多种多样, 离子束作用的损伤通常不易修复, 突变体稳定快, 突变率较高。目前, 离子注入技术已广泛应用于水稻、小麦、玉米、棉花、蔬菜、瓜果、花卉等作物并已初见成效, 获得了常规辐照处理难以产生的罕见变异, 且变异幅度大, 频率高, 良性变异多, 后代稳定快。应用：利用离子注入进行食品微生物菌种改良已在生产实践中得到广泛的应用。高艳红等对高耐铬性啤酒酵母菌株进行N+ 注入诱变, 当注入剂量达到一定值时, 得到1株高产GTF的啤酒酵母菌株M 11- 1A11, 其富铬能力较诱变前提高了22. 4%, 且遗传性能稳定。沈加成等将N+ 注入棘孢曲霉L22, 筛选得到1株突变株NIP35, 其- 葡萄糖苷酶活性提高1倍, 产酶水平最终提高了近2倍 ; 李文等为了获得可用于原位分离藕联发酵的耐乳酸菌株, 以米根霉为出发菌株, 在投糖浓度为50 g /L、氮源为3. 0 g /L尿素的条件下, 进行离子注入选育, 得到L ( + ) - 乳酸耐酸菌株RK4002, 不添加中和剂, 经30 h的摇瓶发酵, 其L ( + ) - 乳酸产量为出发菌株的1. 7倍, 且可在24 g /L的耐乳酸平板上生长。传统的离子诱变技术主要使用单一的离子源进行诱变, 而佘涛等用T i+ 注入和N+ 注入交替对番茄红素生产菌株三孢布拉霉进行诱变选育, 得到1株高产菌株, 其产番茄红素的能力提高了25%, 因此认为不同种类离子源交替诱变的效果优于单一离子诱变。4、激光诱变原理：激光辐射通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接的影响生物有机体，热效应引起酶失活、蛋白质变性，导致生物的生理、遗传变异；压力效应使组织形变、破裂，引起生理及遗传变异；电磁场效应产生自由基导致DNA损伤，引起突变；光效应是通过一定波长的光子被吸收，跃迁到一定能级，引起细胞DNA或RNA、质粒、染色体畸变效应，酶的活化或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子引起细胞内等所含无中的任何物质一旦发生改变，都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。但传统低功率长脉冲He-Ne激光诱变方法存在易损伤细胞活性、突变率低、突变无方向性、育种周期长等缺陷，所以飞秒激光成为了人们重点研究对象。在这里，我想重点介绍一下飞秒激光在诱变育种中的应用。飞秒激光由于其脉冲持续时间短、瞬时功率大、聚焦尺寸小的特点，其在微生物诱变方面有着独特的优势:（1）脉冲时间与生物化学反应时间相同 飞秒（s）超短的时间范围正好是基本的化学反应和分子内电子和原子核运动的时间范围，如化学反应中化学键的断裂或形成，分子重排形成新分子，能量从一个分子传递到另一个分子等过程。随着Zewail最早利用飞秒激光研究化学反应的动力学过程而被授予1999 年的诺贝尔化学奖，人们已经在飞秒化学生物领域有了较大进步，尤其飞秒技术已经被用于研究DNA 中电荷传递及质子传递过程。所以超短飞秒脉冲辐射微生物细胞时能从微观角度影响到生物新陈代谢过程中各种生物化学反应，从而促进变异概率的提高。（2）高能光子与生物组织作用强烈 飞秒激光由于其高峰值功率，在与微生物细胞相互作用时引起细胞器或细胞内分子对激光能量的非线性吸收，这种非线性吸收在焦点处产生高激发的等离子体。由于在等离子体产生的过程中会产生活性自由基，它们易与细胞内的蛋白质、酶和DNA发生化学反应，影响生物代谢，从而增强了变异的效果。（3）DNA定点切除 近红外飞秒激光系统（重复频率为80 MHz，波长为800 nm，能量2 nJ）已被用于破坏人类染色体上的高浓缩的DNA 和单个伸展的DNA 分子的染色体组对于微生物（尤其原核生物）来说，由于DNA 分子只有一条或者几条，又由于飞秒激光聚焦小，在显微镜下可以对微生物的DNA 进行飞秒激光定点切除、移植等操作。此种方法针对性强、精确度高，使突变更有目的性，避免了目前大多激光诱变“黑箱子操作”的盲目性，能够有效的减少后续高通量筛选高产优质菌株的工作量。（4）细胞损伤小 大多数细胞在7001100 nm波长范围内吸收系数小，散射系数小，因而几乎是透明的，因此近红外飞秒激光对细胞的穿透深。并且当飞秒激光聚焦于微生物细胞时，聚焦处的光强非常高，足以引起非线性吸收，但聚焦处附近的热影响非常小，飞秒激光对邻近细胞几乎没有损害（温度升高小于105 K），且不影响细胞活性，而紫外和可见光不仅穿透深度小，且对活细胞的损坏严重。其作用机理为：（1）多光子吸收机理 DNA吸收多个飞秒激光光子后，或者直接被离子化，或者发生能量堆积，产生电子迁移效应后，最终导致DNA单链或者双链的损伤与断裂。（2）等离子体的形成机理 高峰值功率的飞鸟激光光束与微生物与细胞内生物大分子作用是，处于基态的原子吸收光子后能量跃迁到高能级，形成主要由电子、离子、激发态的原子、分子和自由基等组成的低温等离子体，等离子体效应可使生物大分子的化学键发生改变，导致突变的发生。（3）生物活性氧产生机理 飞秒激光能激发细胞产生活性氧，即自由基，如过氧化氢、羟自由基和单线态氧等，而自由基的存在会导致DNA 单链断裂和碱基损伤。用激光辐照时，细胞或组织内的内源性色素充当光敏剂角色，吸收光子后，使生物体膜脂质上的不饱和脂肪酸发生过氧化链式反应，产生活性氧自由基。当脂质过氧化发生在核膜上时，自由基将优先与DNA 作用，引起DNA 的损伤。（4）DNA损伤自身修复机理 DNA 损伤主要包括DNA 双链断裂、碱基损伤、单链断裂等类型，每种损伤类型都与细胞死亡、基因突变甚至细胞恶性转化有密切联系。在细胞内，DNA 修复酶始终监视染色体，一旦发现物理、化学、生物等因素产生的核苷酸残基，就会启动细胞自身修复机制47。DNA 损伤修复是一种生物细胞内的自发的代谢反应过程，而其中-H2AX（一种组蛋白）与DNA 发生双链断裂修复是一个重要过程。DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX 的C 末端丝氨酸残基发生磷酸化。磷酸化的-H2AX 快速转导DNA 损伤信号，导致下游分子磷酸化的激活，引发一系列的生物级联反应和细胞学反应。随着DNA 损伤逐渐修复，-H2AX发生去磷酸化（半衰期约为2 h），直至DNA 修复完成，-H2AX 也即消失，而在DNA 修复的过程中便会发生大量的突变。高能飞秒激光光子辐射到微生物细胞上，通过多光子强烈吸收导致了生物分子离子化，或者发生能量堆积，造成DNA 等生物大分子损伤。在这个过程中就会形成由电子、离子、激发态的原子、分子和自由基等组成的低温等离子体，扰乱生物细胞自身的代谢过程，其中生物活性氧直接与DNA 作用，引起DNA 损伤。由于细胞的修复系统启动，细胞通过一系列生物化学反应将DNA 修复，保证遗传信息的完整性，从而将细胞自身的代谢调整到正常状态，在这个过程中就会产生大量的突变。相比较于传统激光的诱变机理，飞秒激光的诱变机理更具有本质性和微观性，结合了物理过程和生物化学反应过程，更具有全面性和系统性。应用：目前，飞秒激光主要应用于医学领域，利用飞秒光镊与飞秒光刀进行生物细胞微加工、线粒体切割、生物标记物成像、生物细胞三维高分辨率显示、生物化学反应微观过程、眼睛角膜矫正手术等。总结：综上所述, 利用物理因子诱变筛选高效菌株, 优化微生物性能, 提高其产品质量和数量, 在食品、环境、医学等方面起到了一定的效果，已被证明有广阔应用前景。许多学者在开发新型物理诱变技术方面作了不懈的探索, 取得了可喜成果。除前面阐述的空间诱变、离子束诱变和激光诱变等新型技术外, 还相继有微波诱变、双向复合磁场诱变、红外射线诱变和高能电子流诱变等技术问世, 这些诱变技术单独使用时效果不甚理想, 但与其他诱变源相结合, 则能起到很好的诱变效果。但物理诱变技术也存在着无法控制诱变方向、工作量大、诱变产物安全性不确定等问题。如何克服其缺点, 发挥其优势, 将其与其他诱变方法相结合组合成复合诱变方法,