（微生物学专业论文）人参皂甙rg3对乳腺癌细胞的抑制作用.pdf

浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所提交的学位论文是本人在导师的指导下 独立进行研究工 作所取得的研究成果 除文中已经加以标注引用的内容外 本论文不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果 也不含为获得浙江工业大学或其它教育 机构的学位证书而使用过的材料 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体 均 已在文中以明确方式标明 本人承担本声明的法律责任 作者签名 每和 菱 日期 口年芎月四日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借 阅 本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 l 保密口 在年解密后适用本授权书 2 不保密a 请在以上相应方框内打 作者签名 导师签名 日期 矿j 年善月墙日 日期 加卜年f 月坫日 j 么钐 孤 浙江工业大学硕士学位论文 人参皂甙r 9 3 对乳腺癌细胞的抑制作用 肿瘤的发病率逐年增高 对肿瘤药物的研究也更迫切 人参皂甙i 沁3 是中国传统中药人参的有效成分 以往的研究中报道对肿瘤有抑制效应 本课题对人参皂甙r 9 3 对乳腺癌细胞系的作用机制进行进一步探讨 研究包括如下内容 1 人参皂甙i 沁3 对c x c r 4 的影响 选取i m 2 和 i 沁3 两种常用的抗肿瘤人参皂甙 配为6 0 鸺恤l 的细胞培养基 孵育 加a 2 31 细胞株2 4 h 后 以免疫细胞化学方法检测c x c i 表达 发 现碰和r 9 3 均降低了细胞表面c x c r 4 的表达 而r 9 3 的抑制作用更明 显 而以趋化实验对m d a 2 3 1 细胞运动能力 分别以2 0 啪o l m l 1 0 0 m o l m l 2 0 0 n m o 1 的c x c l l 2 作为诱导剂测试r 9 3 培养的细胞趋化 活性 结果显示c x c l l 2 浓度为1 0 0 啪o l m l 时 r 9 3 对细胞的趋化活性抑 制显著 3 r 9 3 对m d a 一 2 3l 细胞周期的影响 以6 0 肛g m lr 9 3 与 a 2 31 细胞共孵育 流式细胞术测定发现g l 期细胞周期指数增加 1 8 4 s 期细胞周期指数减少1 5 o 即发生了g 1 期阻滞 4 r 9 3 对 m d a m 2 31 细胞m a p k 信号通路的影响 采用免疫细胞化学法 发现 6 0 肛咖li 沁3 孵育2 4 h 抑制m d a 一2 31 细胞e i 蛋白的活化 而 6 0 鹇 m li 迎3 孵育6 h 抑制 a 2 3 1 细胞肿 蛋白的活化 本研究结果表明人参皂甙i 崦3 可抑制乳腺癌细胞m d a m 2 3 1 细胞 c x c r 4 的表达 并且由此抑制其转移能力 另外 r 9 3 可阻滞 a 2 3 1 浙江工业大学硕士学位论文 细胞在g 1 期 并且抑制e r k m a p k 和肿 2 蚴时 肿瘤 基质生成微血管直接给自身提供养料 加速生长 同时掉落的肿瘤细胞可通过新生血管 连接成的脉管系统向远端器官转移 因此肿瘤新生血管的生成和肿瘤转移的关系密切 高勇等 4 l 利用人参皂甙r 9 3 在鸡胚绒毛尿囊膜观察r 9 3 作用后肿瘤新生血管的生 长情况 并且采用l e 埘s 肺癌荷瘤小鼠以r 9 3 灌胃 结果显示r 9 3 可抑制体内肿瘤生长 以及肿瘤新生血管的生成 来自肺癌细胞的脐静脉内皮细胞能刺激新生血管生长 而耿怀成 4 2 等以不同浓度 r 9 3 培养人肺癌s p c a 1 细胞后的上清液对人脐静脉内皮细胞作用发现 人参皂甙r 9 3 9 浙江工业大学硕士学位论文 能抑制肺癌细胞新生血管生成的作用 另外 陶厚权 4 3 1 等人选取3 2 例胃癌 术前口服i 逛3 后 术后服用r 9 3 的受试者微 血管密度显著低于未服用r 9 3 者 另外服用r 9 3 的受试者v e g f 和b f g f 表达强度也有 显著降低 说明r 9 3 刻调控血管内皮生长因子受体的表达 以抑制肿瘤新生血管的生成 1 2 2 2 2 抑制肿瘤细胞迁移 肿瘤细胞浸润是原发肿瘤得以向远端侵袭的必要条件 肿瘤浸润首先要对基底细胞 膜进行溶解 之后再向远端侵袭 杨威等 删人以人参皂甙r 9 3 对鼠源性膀胱癌细胞系 b b t 7 3 9 进行体外共培养 发现r 9 3 能有效抑制b b t 7 3 9 的黏附 侵袭 同时在体内实验 中r 9 3 也能有效较少肺部转移 且呈剂量依赖性 赵翌等 4 5 人也发现r 9 3 对肝癌小鼠具 有抑制肿瘤生长 并且能够有效抑制淋巴结转移 m o 出z u k i 等 4 6 将黑色素瘤细胞系 b 1 6 f e 7 接种b a l b c 小鼠后发现 静脉注射和口服r 9 3 都可以显著降低黑色素瘤肺部转移 率 同时还可显著增加小鼠存活率 i i s h i 等 4 7 1 以自发肿瘤转移模型对r 9 3 抑制结肠癌转 移效应的影响进行研究 发现5 m g m 哜u 量的r 9 3 对其转移抑制有显著影响 u 等 4 8 人发 现r 9 3 可上调蛋白激酶抑制因子p 2 1 以及p 2 7 的表达 同时抑制p c n a 和细胞周期蛋白 c y c l i n d l 表达 阻滞细胞于g 1 期 1 3 本课题研究的基本内容和目标 基于以上中药有效成分r 9 3 在肿瘤治疗中的作用 我们提出本课题 其核心目标为 研究r 9 3 对乳腺癌细胞作用的机制 人参皂甙r 9 3 为中药有效成分 价格较便宜 且在临床安全性较高 我们应用人参 皂甙r 9 3 对乳腺癌细胞系m d a m b 2 31 作用后 研究其对c x c i m 的影响以及对细胞 周期和信号通路的影响 以有助于更好地理解i 崦3 对乳腺癌细胞系的作用机制 首先选择i 追3 和砌1 2 两种在以往的研究中证实对肿瘤治疗有作用的人参皂甙 通 过免疫细胞化学法和趋化实验 比较它们对肿瘤转移相关蛋白c x c r 4 的影响 之后对细胞的运动能力进行测试 以划痕实验检测细胞侧向运动能力在经由i 沁3 作用后的改变情况 通过流式细胞术 检测r 9 3 对m d a m b 2 31 细胞周期的影响 l o 浙 浙江工业大学硕士学位论文 第二章人参皂甙r 9 3 对乳腺癌细胞c x c i h 的影响 乳腺癌是女性高发疾病 其死亡率在在女性患者中居高不下 引起乳腺癌的发病的 确切原因尚不明确 但大致可归结为激素分泌紊乱 遗传 生育 授乳等几个方面的因 素 乳腺癌病变部位主要由乳腺癌细胞组成 有m d a m b 1 3 4 m d a m b 1 5 7 m d a m b 2 31 n 妇d a m b 3 3 0 m d a m b 3 3 1 m d a m b 416 匝 a m b 4 31 m d a m b 4 3 5 m d a m b 4 3 6 m d a m b 4 5 3 以及m c f 7 等许多种细胞系 其中在临 床中构成乳腺癌组织较为常见的细胞系是m c f 7 细胞以及m d a m b 2 3 1 细胞 4 9 其中 m d a m b 2 3 l 细胞系原为取自1 9 7 3 年1 0 月1 7 日从从一位实施了四分之一 乳房切除术的5 1 岁患者的胸膜浸出液中提取出的恶性细胞 4 9 此细胞株在以往的研究 中发现其具有高转移性 且能高表达c x c r 4 蛋白 c x c r 4 是趋化因子c x c l l 2 s d f 1 基质细胞衍生因子 的唯一受体 在炎症 反应 组织修复 免疫细胞发育及分化中都有重要作用 m u l l e r 等 3 在2 0 0 1 年的n a n l r e 杂志首次指出 c x c r 4 多高表达于人乳腺癌细胞系以及乳腺癌原发部位 淋巴结 肺 肝 骨髓等常见的乳腺癌转移部位则高表达c x c l l 2 且正常肝 肺组织的蛋白提取物 对乳腺癌细胞趋化作用明显 祖国中医药中 对于癌症历来有使用扶正培本药物来治疗的传统 其根本目的是通 过提高人体 血气 以来贯通身体内原先的淤塞 血气 的提高便可使得人体内的残余肿 瘤细胞被人体自身所 贯通 这种说法转换为西医的说法就是人参黄芪等中医中的扶正 培本类药物可以治疗原发肿瘤以及肿瘤的转移 扶正培本药物中 人参是经过了千万年 使用的药物 其投入临床使用的时间比研发新药要快很多 因此 对人参抑制肿瘤以及 肿瘤转移的研究将更加有助于肿瘤以及肿瘤转移的临床治疗 人参的有效成分是人参皂 甙 目前的研究多集中在i 妣 r 9 3 r e r 9 1 等几种人参皂甙单体上 本实验以m d a 2 3 1 继代细胞系为对象 进行细胞培养 以m d a m b 2 3 1 细胞 为靶细胞 在对m d a m b 2 3 l 细胞中c x c r 4 的表达进行定位后 以人参皂甙作用于 加a m b 2 3 1 细胞 然后用免疫细胞化学的方法来测定人参皂甙对c x c r 4 表达的影响 1 2 浙江工业大学硕士学位论文 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 人参皂甙r 9 3 砌 1 2 鼠抗人c x c r 4 单克隆抗体 二抗 h r p 标记的兔 鼠通用i g g d a b 粉末 d m e m 培养基 胰酶 o 0l e d l a 胎牛血清 f b s 双抗 p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n 苏木素 伊红y 醇溶性 多聚甲醛 倒置相差显微镜 a 9 咖盖玻片 0 2 2 岫滤器 细胞培养皿 移液器枪头 1 0 p l l o o p l 1 0 0 0 扯1 可调式移液枪 1 0 山 1 0 0 山 1 0 0 0 m 离心管 1 m l l o m l s w 二c j i f d 型单人单面净化工作台 二氧化碳培养箱t h e 肌os c i e n t i f i c31 10 移液器 t g l l 1 8 台式高速冷冻离心机 d g g 9 0 3 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 吉林大学基础有机化学教研室 美国i m 公司 上海基因科技有限公司 海门市碧云天生物技术研究所 美国h y c l o n e 公司 吉诺生物医药技术有限公司 杭州四季青生物工程材料有限公司 美国g i b c o 公司 北京博奥森生物技术公司 上海三爱思试剂有限公司 上海分析试剂厂 德国l e i c a 公司 广州市永程实验仪器有限公司 美国m i l l i q 公司 美国b d 公司 丹麦n u n c 公司 芬兰j f i n n p i p e n e 公司 德国印p e n d o r f 公司 苏州净化设备有限公司 赛默飞世尔科技 中国 有限公司 芬兰f i l l n p i p 眦公司 上海中国科学院生物物理研究所 上海森信实验仪器有限公司 1 3 浙江工业大学硕士学位论文 2 1 2 细胞系 m d a m b 2 3 l 细胞 购自上海中科院细胞库 2 1 3 细胞培养和细胞爬片 2 1 3 1 细胞复苏 1 将冻存在液氮中的细胞取出 并迅速转入3 7 水浴中 不断摇动使之融化 注意尽 量不要让冻存管上部浸入水中 以防污染 2 当细胞完全解冻后 用7 5 乙醇擦洗冻存管 并将细胞放入超净台中 3 打开冻存管 将细胞吸出并转入完全培养基中 4 细胞培养2 4 h 后 倒去旧的培养基 加入新培养基 继续培养 2 1 3 2 细胞换液 1 用7 5 乙醇消毒培养基瓶外壁 放置到超净台上 2 将2 5 m l 细胞培养瓶取出 用7 5 乙醇棉球消毒瓶底 3 用吸管吸弃1 日培养基 更换吸管 从非细胞培养面加入新鲜培养基 2 1 3 3 细胞传代 1 将长满细胞的培养瓶中原来的培养基弃去 2 加入0 5 1 m l0 2 5 胰酶 e d t i a 溶液 使瓶底细胞浸没 3 盖好瓶盖 待细胞大部分浮起之后加入0 5 1 m l 培养基终止反应 4 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液 1 0 0 0 砷m 离心 倒去上层液体 用完全培养基重 悬细胞 等量分入另外两瓶中 置3 7 下继续培养 第二天观察贴壁生长情况 2 1 3 4 细胞计数 1 将长满细胞的培养瓶中原来的培养基弃去 2 加入0 5 1 m l0 2 5 胰酶 e d t a 溶液 使瓶底细胞浸没 3 盖好瓶盖 待细胞大部分浮起之后加入0 5 1 m l 培养基终止反应 4 用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液 离心 倒去上层液体 用少量完全培养基重悬细 胞 用移液器取少量细胞悬液将其从血球计数板和盖玻片之间的缝隙轻轻加入 使之充 1 4 浙江工业大学硕士学位论文 满细胞悬液 显微镜下观察五个大中格内细胞总数n 四个角 正中间的中格 c 细胞数目 m l n 竺 1 0 1 0 0 0 5 n 五个大中格内细胞总数 2 1 3 5 细胞冻存 1 将对数生长期的细胞用胰酶消化 离心 2 将离心后的细胞以1 0 7 m l 的浓度重悬冻存液中 3 将细胞悬液加入冻存管中 每管o 5 m 1 1 m 4 冻存管按照4 冻存2 h 2 0 冻存2 h 的梯度冻存 或者使用冻存盒 后 放入 8 0 低温冰箱中 2 4 h 后 将冻存管转入液氮罐中 2 1 3 6 细胞爬片 1 将a 9 n 蚰的盖玻片泡酸后 再用1 0 0 乙醇浸泡2 4 h 烘干后放入干净小盒备用 在 实验前将盖玻片小心取出并整齐地摆放在细胞培养皿中 注意尽量不要相互重叠 然后 用紫外照射l h 合上细胞培养皿盖 备用 2 按常规培养m d a m b 2 3 1 细胞 待细胞成长至对数期后 消化 离心 调整其细胞 密度 1 07 枷 3 打开细胞培养皿盖 将细胞悬液小心地滴在已经处理过的洁净a 9 衄n 盖玻片上 注 意不要让悬液液滴不要超过盖玻片边缘 关上细胞培养皿盖 4 将细胞培养皿放入二氧化碳培养箱中3 4 h 5 向细胞培养皿中加入细胞培养基 然后按正常程序培养细胞 6 1 砣d 后取出盖玻片即为细胞爬片 2 1 4 苏木精伊红 h e h e m a t o x y l i ne o s i ns t a i l l i n g 染色 用眼科镊将细胞爬片轻轻取出后 按照如下步骤进行h e 染色 1 4 多聚甲醛固定5 m i l l 2 苏木素染液染色2 m i n 3 自来水洗 浙江工业大学硕士学位论文 4 1 伊红乙醇染液染色1 m i n 5 自来水洗 6 7 0 乙醇脱水1 i n j n 7 8 0 乙醇脱水1 m i n 8 9 0 乙醇脱水1 m i n 9 9 5 乙醇脱水1 m i n 1 0 1 0 0 乙醇脱水l 耐n 1 1 1 0 0 乙醇脱水1 1 1 1 i n 1 2 二甲苯透明1 i 血 1 3 中性树胶封片 2 1 5 免疫细胞化学染色 按照c o n t r o l 组 砒亿组 r 9 3 组编号之后 c o n 们l 组和阴性对照组以完全培养基 培养 抛组以砒也培养基培养 r 9 3 组以i 沁3 培养基培养 2 4 h 后将以药物处理后的 细胞爬片从培养皿中用眼科镊轻轻夹出 之后以如下步骤进行免疫组化染色 p b s 洗2 遍 直至洗去残余的培养基 4 多聚甲醛固定液 固定1 h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的固定液 一抗 c x c i 孵育 过夜 1 2 h 孵育时需覆盖细胞爬片上的细胞 室温下复温1 h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的二抗 d a b 显色2 0 m i n 以镜检为准 6 0 乙醇脱水1 m i n 7 0 乙醇脱水1 m i n 8 0 乙醇脱水1 m m 9 0 乙醇脱水l 而n 9 5 乙醇脱水1 m i i l 1 6 2 用去掉尖头的2 0 0 m 移液枪头吸取5 0 微升f i b r o n e c t i n 溶液涂布于t r a i l s w e l l 板中各 个小室聚碳酸酯膜下层 紫外照射1 h 小室结构如下图所示 1 7 浙江工业大学硕士学位论文 上室 聚碳酸酯腰 下室 图2 2t r a n s w e l l 小室结构示意图 f i 薛 2t h e s t m c t u 陀0 fac h 觚l b e r o f t 删 1 s w e l l 3 将t 阳n s w e l l 小室在3 7 培养箱中预加热1 h 以防加样时产生气泡 4 m d a m b 2 3 1 细胞以胰酶消化后 调整细胞终浓度为1 1 0 6 砌 5 取2 4 孔板 每孔下室加入含有1 0 0 n g m 1 的c x c l l 2 的无血清培养基6 0 0 p l 6 将n a i l s v e l l 小室一一对应放回培养板孔中 上室分别加入1 1 0 6 个细胞 每组细胞 设3 个复孔 7 加样完毕后 将t r 锄s w e l l 小室和2 4 孔板放入3 7 培养箱中 8 加样完毕后的2 4 h 取出t r a n s n 小室 擦去上层未穿过的细胞 下层细胞用4 多聚甲醛固定1 m i n 后 苏木素染色 脱水 封片 拍照 在高倍镜下随机取5 个视野 内细胞并计数 9 计算趋化指数c i c h e m o t a c t i ch l d e x 迁移到含有不同浓度趋化因子液体中的细胞 数目与迁移到无趋化因子液体中细胞数的比值 c i 表示趋化活性的高低 2 1 7 图像处理与数据分析 c x c r 4 阳性表达样品为经免疫细胞化学染色后样品细胞膜部位呈现棕黄色或棕红 色 并和c x c r 4 蛋白质表达强度呈正比 c x c r 4 阴性表达样品经免疫细胞化学染色后 细胞膜部位和其他部位无明显色差 每个样本在高倍显微镜下随机抽取5 个区域并拍摄 拍摄条件设定光圈最大 曝光 时间1 2 5 0 秒 白平衡r g b 1 o 1 0 1 0 黑平衡为0 1 8 浙江工业大学硕士学位论文 设定专业图像分析软件i m a g e p r op l u s6 o 参数h s i 4 0 2 5 5 2 5 0 软件自动测定岬2 图像o d 值的累积值 并以积分光密度值 h n e g r a t e do p t i o nd e n s i t y i o d 表示 i o d 表示拍摄范围内所有着色细胞反应强度的总和 i o d 一l o g i f 饥b i i o d 为着色区域光密度值总和 i f 前景光密度值 i b 背景光密度值 平均光密度值m d m e 锄d e n s i t y 1 0 d 儿恤a 5 0 5 1 1 s p s s l 6 o 统计学软件包进行a n o v a 单因素方差分析 以确定是否样本具有显著性 p 0 0 5 为具有显著性 2 2 结果 2 2 1 乳腺癌细胞系m d a m b 2 31 图2 1 为m d a m b 2 3 1 细胞在相差倒置显微镜下形态 m d a m b 2 3 1 细胞为以贴 壁形式附着 成团成簇生长的细胞系 1 9 浙江工业大学硕士学位论文 萝麓 蕊 8 囊 一是 乳h 一 泓戆透i j 2 2 2 乳腺癌细胞系m d a m b 2 3 1 髓染色结果 由图2 2 可知 m d a m b 2 3 1 细胞核质比例较大 且细胞大多呈梭形 图2 4 am d a m b 2 3 1 细胞h e 染色 4 0 f i 9 2 4 am d a m b 一2 31c e l l si n 眦s t a i n i n g 4 0 图2 4 bm d a 小位 2 3 l 细胞h e 染色 1 0 0 f i 醇4 bm d a 小毋 2 3 1c e l l s mh es t a i n i n g 1 0 0 浙江工业大学硕士学位论文 2 2 3 人参皂甙对m d a m b 2 3lc x c r 4 表达的影响 辫 誊 影二器 漤0 7 一 j 夕 i 7 曩 乒 0 j i 一 2 2 4c x c r 4 表达量平均光密度值比较 通过软件h a g e p r 0p l u s 6 0 进行平均光密度值 m d 值对比 c o i 灯0 1 组m d 值 最高 为0 0 7 2 士o 0 0 3 砌 1 2 组m d 值居中 为0 0 6 8 士o 0 0 1 且与c o r l 仃o l 组相比差异显 著 幸p 0 0 5 r 9 3 组 值最低 为0 0 6 0 士o 0 0 1 与c o n 缸d l 组相比差异极显著 尸 0 0 1 图2 4 2 l 浙江工业大学硕士学位论文 o 0 8 o 0 7 o 0 6 0 0 5 坌 o 0 4 0 0 3 0 0 2 0 o l o r h 2 r 9 3 g r o u p s 图2 6c i x c r 4 着色情况平均光密度值比较om d 表不平均光密度值 f i 9 2 4c x c r 4e x p r e s s i o n 访c o m p a f i s o no fm e 锄o p t i c a ld e n s 姆u n d e rd i 凰r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s 注 与对照组相比 尸 o 0 5 p 0 0 1 f 砒1 2 8 3 6 2 f r 够 9 7 1 8 8 n 5 2 2 5 人参皂甙r 9 3 对m d a m b 2 3 l 细胞趋化能力的影响 在划痕实验中已经发现人参皂甙i 沁3 可抑制m d a m b 一2 3 1 细胞的侧向运动能力 本实验以不同浓度趋化因子受体c x c r 4 的对应趋化因子c x c l l 2 为诱导剂 r 9 3 作为研究药品 检测细胞向下室迁移时趋化活性的改变 结果发现 c x c l l 2 浓度为o n m o l m l 2 0 i u i l o 2 0 0 n g m o 时 人参皂甙r 9 3 对细胞的迁移率没有影响 s p s s l 6 0 分析无显著性差异 胗o 0 5 但c x c l l 2 浓度为 2 0 呦o l 和2 0 0 姗 妇l l 时对细胞有一定的抑制作用 而c x c l l 2 浓度为1 0 0 m o 妇1 l 时 人参皂甙i 沁3 对细胞迁移率具有抑制作用 组间比较差异具有显著性 p o 0 5 浙江工业大学硕士学位论文 2 0 1 0 02 0 0 c x c l l 2 n m 图2 7 趋化实验不同浓度c x c l l 2 下趋化指数 f 啦一7c h e m o t a c t i ci n d e x 衄d e rd i 仃e 凇l tc o n c e n t r a t i o n so fc x c l l 2o fc h 锄o t a l i s 胬s a y 注 与对照组相比 水尸 9 8 p i 美国h y c l o n e 公司 杭州四季青生物工程材料有限公司 吉诺生物医药技术有限公司 美国g i b c 0 公司 吉林大学基础有机化学教研室 海门市碧云天生物技术研究所 浙江工业大学硕士学位论文 r n a s e a 细胞培养皿 移液枪头 1 0 p l 1 0 0 p l 1 0 0 0 山 可调式移液枪 10 肛l 1 0 0 肛1 1 0 0 0 m 离心管 1 m l l o m l 倒置相差显微镜 s w 二c j i f d 型单人单面净化工作台 二氧化碳培养箱1 1 1 e 册os c i e m i f i c31 10 流式细胞仪 f a c s c a l i b e r t g l l 1 8 台式高速冷冻离心机 d g g 9 0 3 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 3 1 2 细胞培养 海门市碧云天生物技术研究所 美国b d 公司 丹麦n u l l c 公司 芬兰f i n n p i p e n e 公司 德国e p p e n d o r f 公司 德国l e i c a 公司 苏州净化设备有限公司 赛默飞世尔科技 中国 有限公司 美国b e c t o nd i c k i i l s o n 公司 上海中国科学院生物物理研究所 上海森信实验仪器有限公司 m d a m b 2 3 1 细胞生长在完全培养基中 置于5 c 0 2 3 7 恒温密闭式培养箱中 培养 其他培养方法同第二章 3 1 3 流式细胞术检测 1 将细胞分为c o n 加l 组和r 9 3 组 分别以完全培养基和r 9 3 培养基培养2 4 h 后用胰 酶消化并收集细胞 2 将消化后的细胞用p b s 洗三遍 打散细胞 然后加入预冷的7 0 乙醇中 吹打均匀 4 固定1 2 h 以上 3 调整细胞浓度为1 0 6 个 m l 以1 0 0 0 印m 离心5 m i n 洗去乙醇 重复两次 最终重悬 在0 5 1 1 1 1p b s 中 4 依次加入5 0 删黜粥e a 和5 0 删p i 在3 7 温浴3 0 i 出 5 流式细胞仪测定细胞周期 浙江工业大学硕士学位论文 3 3 结果 流式细胞仪检测细胞周期是在r n a s e a 将细胞内i 斟a 消化后 p i 与细胞d n a 结合 流式细胞仪通过检测p i 的荧光强度即可知道细胞内d n a 含量的多少 而由于处于各个 周期的细胞内d n a 含量不同 因此可以流式细胞仪可以通过测定不同d n a 含量的细 胞 从而分别检测出处于g 1 期 s 期和g 2 期的细胞数目 由图4 一l 图4 2 和表4 1 可知 r 9 3 组的m d a m b 2 3 1 细胞和正常组m d a m b 2 3 1 细胞相比g l 期细胞周期指数增加 而s 期细胞周期指数减少 图3 1m d a 小忸 2 3 l 细胞在正常条件下培养时细胞周期图 c o n 仃0 l 组 f i 9 3 1c e l lc y c l ed i a 黟锄o f m d a m b 一2 31c e l l sc u l n j r e d 吼d e rn o 彻a lc o n d i t i o n s c o n 仃 0 lg r o u p 一篮 n3 i n 图3 2 m d a 2 3 l 细胞在r 9 3 作用后2 4 h 细胞周期图 1 溜组 f i 驴 2c e i lc y c i ed i a 鲈瓶o fm d a m b 2 3lc e i l sc u l t u r e d 吼d e rr 移c o n d i t i o n 他3g r o u p 浙江工业大学硕士学位论文 表3 1婶对m d a 2 3l 细胞周期的影响 t a b 3 一lr 驴e 仃e c to nt h em d a m b 一2 31c e l l sa f e r2 4 ho fc e l lc y c l ec h 锄g e s g 盟 z 里 堡竺璺堡竺 鲤塑垦g i 鲤坚 g 14 8 3 6 6 7 g 2 记 g 1 s 1 3 1 9 3 2 3 8 7 9 7 1 9 9 5 2 3 7 3 4 讨论 细胞周期可分为g 1 期 s 期 g 2 期和m 期 其中g 1 期为细胞d n a 复制前期 是从上一次有丝分裂完成到下一次d n a 复制前 d n a 的准备过程 主要进行r n a 和d n a 复制相关酶以及其他蛋白质以及a r p 等的合 成 s 期为d n a 合成期 合成及复制d n a 此时d n a 含量倍增 细胞成为四倍体 每条染色质丝转变为在着丝点相连接的两条染色质丝 s 期为细胞增殖的关键时期 g 2 期为d n a 复制完成到下一次有丝分裂开始的时期 此时细胞合成大量蛋白质及 对姐 为m 期细胞分裂做准备 m 期为细胞分裂时期 此时期染色体告诉螺旋化 细胞一分为二 正常细胞大多处于静止期 即g o 期 g o 期是细胞暂时脱离细胞周期的状态 在合 适条件下才会重新进入细胞周期 而肿瘤细胞则可以不断进入细胞周期 不断进行自我 增殖 在本次实验中我们可得出m d a m b 2 3 1 细胞在g l 期细胞周期指数增加 而s 期 细胞指数减少 表明r 9 3 对m d a m b 2 3 1 细胞的调控为阻滞细胞处于g 1 期 无法进 入s 期 g 1 期主要是r n a 以及相关蛋白质 a r p 的合成 近年来的研究还发现 g 1 期的异常在癌症的发生过程中具有十分重要的作用 g 1 期表达的细胞周期正调控相关 蛋白c y c l i l ld 可激活细胞周期相关蛋白c d k l 2 c d k 4 c d k 5 等的活性 从而促使细 胞周期继续进行 并使d n a 不断增殖 在肿瘤细胞中 c y c l i i ld 往往过量表达 对于 c y c l i nd 表达的阻滞往往可使得细胞处于g l 期 而不能进入s 期 c y c l i l ld 同时还是原 型墼至燮兰堡圭堂垡堡苎 癌基因 g 1 期的另一个细胞周期相关蛋白c y c l i ne 是决定细胞进入s 期的启动因子 c y c l i ne 的过表达可缩短细胞g l 期 促进细胞进入s 期 6 8 因此 r 9 3 可能是通过某种途径 从而将细胞周期阻滞于g 1 期 浙江工业大学硕士学位论文 第四章人参皂甙r 9 3 对乳腺癌细胞m a p k 信号通路的影响 肿瘤细胞的增殖分化过程失去负反馈调节机制 而引起增殖分化失控最直接的因素 就是细胞信号通路的传导障碍 细胞信号通路是通过细胞通过其表面受体与胞外物质分 子 配体 选择性地相互作用 以调节细胞的生长 增殖和分化的过程 细胞因子则能 通过多种信号通路进行胞内信号转导 7 0 1 肿瘤细胞最明显的特征就是增殖分化的失控 其中 m a p k 信号通路和细胞的增殖 分化关系最为密切 在肿瘤细胞中 绝大部分都可发现m a p k 信号通路的异常 已有 报道证实 阻断c x c r 4 的表达可抑制e 砌 舣p k 亚途径的活性 另外 c x c l l 2 和 高表达c x c i m 的细胞共同培养可激活某些m a p k 信号通路亚途径 那么 在利用人参 皂甙r 9 3 对高表达c x c r 4 的m d a m b 2 31 细胞共培养后 人参皂甙r 9 3 对m a p k 信 号通路各个亚途径的作用情况是如何的呢 通过第二章和第三章的研究 我们知道 人参皂甙r 9 3 通过对c x c r 4 的表达抑制 从而抑制乳腺癌细胞的转移 本实验以乳腺癌细胞m d a m b 2 31 为研究目标 通过免 疫细胞化学的方法 检测在经过r 9 3 培养基作用后 j n k e r k l 2 亚途径的表达变化 情况 4 1 材料与方法 4 1 1 材料 d m e m 培养基 美国h y c l o n e 公司 胎牛血清 f b s 杭州四季青生物工程材料有限公司 胰酶 0 0 1 e d t i a吉诺生物医药技术有限公司 p e i l i c i l l i n s n e p t o m y c i i l 双抗美国g i b c o 公司 人参皂甙i 沁3 r h 2吉林大学基础有机化学教研室 兔抗鼠磷酸化p 4 4 4 2 1 r 2 0 2 仃y r 2 0 4 多克隆抗美国c e l ls i 口1 a l i n gt e c h n 0 1 0 9 体 3 0 浙江工业大学硕士学位论文 兔抗鼠p 4 4 4 2m a p k e r k l 2 1 3 7 f 5 多克隆 抗体 兔抗鼠磷酸化s a p 刚 k n l r l 8 3 t 1 8 5 多克 隆抗体 兔抗鼠s a p 列 k 5 6 g 8 多克隆抗体 二抗 h i 冲连接的抗兔l g g t r i t o n x1 0 0 b s a 粉末 d a b 粉末 巧9 m m 盖玻片 0 2 2 u m 滤器 细胞培养皿 移液枪头 1 0 p l 1 0 0 山 1 0 0 0 山 可调式移液枪 1 0 m 1 0 0 p l l o o o m 离心管 1 m l 1 0 m 1 倒置相差显微镜 s w c j i f d 型单人单面净化工作台 二氧化碳培养箱n l e m os c i e n t i f i c311o t g l l 1 8 台式高速冷冻离心机 d g g 9 0 3 0 a 型电热恒温鼓风干燥箱 4 1 2 细胞培养和细胞爬片 美国c e us i g n a l i n gt e c h n o l o g y 美国c e us i g i l a l i n gt e c h n o l o g y 美国c e us i g m l i n gt e c h n o l o g y 美国c e l ls i g i l a l i n gt e c l l l l o l o g 温州市东升化工试剂厂 上海生工生物工程技术服务有限公司 海门市碧云天生物技术研究所 广州市永程实验仪器有限公司 美国m i l l i q 公司 美国b d 公司 丹麦n u i l c 公司 芬兰m m p i p e t t e 公司 德国印p e n d o r f 公司 德国l c i c a 公司 苏州净化设备有限公司 赛默飞世尔科技 中国 有限公司 上海中国科学院生物物理研究所 上海森信实验仪器有限公司 m d a m b 一2 3 1 细胞生长在完全培养基中 置于5 c 0 2 3 7 恒温密闭式培养箱中 培养 其他方法同第二章 4 1 3 免疫细胞化学染色 4 1 3 1 e r k m a p k 相关抗体染色 将用r 9 3 处理2 4 h 后的细胞爬片从培养皿中用眼科镊轻轻夹出 按照c o n 仃d l 组和 浙江工业大学硕士学位论文 r 9 3 组编号后 分别按照如下步骤处理 p b s 洗2 遍 直至洗去残余的培养基 4 多聚甲醛固定1 h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的固定液 1 t r i t o n x10 0 溶液破膜1 h p b s 洗2 遍 1 b s a 封闭液 封闭1 h 一抗 兔抗鼠磷酸化p 4 4 4 2 n l r 2 0 2 厂r y r 2 0 4 多克隆抗体和兔抗鼠p 4 4 4 2m a p k e r k l 2 1 3 7 f 5 多克隆抗体 孵育过夜 1 2 h 需覆盖细胞爬片上的细胞 室温下复温l h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的一抗 二抗孵育1 h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的二抗 d a b 显色2 0 m i n 以镜检为准 6 0 乙醇脱水1 m i n 7 0 乙醇脱水1 m i n 8 0 乙醇脱水1 m i n 9 0 乙醇脱水1 l l l i n 9 5 乙醇脱水1 m i n 1 0 0 乙醇脱水1 m i n 1 0 0 乙醇脱水1 m i l l 二甲苯透明l m i n 中性树胶封片 4 1 3 2 扑 m a p k 相关抗体染色 将用r 9 3 处理6 h 后的细胞爬片从培养皿中用眼科镊轻轻夹出 按照r 9 3 组 c o n t r o l 组编号后 分别按照如下步骤处理 p b s 洗2 遍 直至洗去残余的培养基 4 多聚甲醛固定l h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的固定液 3 2 浙江工业大学硕士学位论文 1 嘶t o n x1 0 0 溶液破膜l h p b s 洗2 遍 1 b s a 封闭液 封闭1 h 7 一抗 兔抗鼠磷酸化s a p 孙j k 1 1 1 r 1 8 3 t y r l 8 5 多克隆抗体和兔抗鼠s a p 7 玳k 5 6 g 8 多克隆抗体 孵育过夜 1 2 h 需覆盖细胞爬片上的细胞 室温下复温l h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的一抗 二抗孵育l h p b s 洗2 遍 直至洗去残余的二抗 d a b 显色2 0 m i n 以镜检为准 6 0 乙醇脱水1 m i n 7 0 乙醇脱水1 血 8 0 乙醇脱水1 n l i n 9 0 乙醇脱水1 l n i n 9 5 乙醇脱水1 n l i n 1 0 0 乙醇脱水l m i n 1 0 0 乙醇脱水l m i n 二甲苯透明1 m i l l 中性树胶封片 4 1 4 图像处理与数据分析 脚k 信号通路相关蛋白在细胞核 质表达 经免疫细胞化学染色后样品细胞膜部 位呈现棕黄色或棕红色 并随表达强度的不同颜色深浅不同 且呈正比 m a p k 相关蛋 白阴性表达样品经免疫细胞化学染色后细胞核质部位和其他部位无明显色差 由于使用 了破膜剂讹o n x1 0 0 处理细胞 因此在细胞膜部位可能出现较淡的棕红色或棕黄色 每个样本在高倍显微镜下随机抽取5 个区域并拍摄 拍摄条件设定光圈最大 曝光 时间1 2 5 0 秒 白平衡r g b 1 0 1 0 1 0 黑平衡为0 设定h m 寥 p r 0p l u s6 0 参数h s i 4 0 2 5 5 2 5 0 软件自动测定 m 图像o d 值的累 3 3 浙江工业大学硕士学位论文 积值 并以积分光密度值 i n t e g r a l 丽o p t i o nd e n s 毋 i o d 表示 i o d 表示拍摄范围内 所有着色细胞反应强度的总和 i o d 一l o g i f i 肥i i o d 为着色区域光密度值总和 i f 前景光密度值 m 背景光密度值 平均光密度值m d m e a l ld e n s i t y i o d 几m a 5 0 5 1 1 4 2 结果 4 2 1 人参皂甙r 邸对m d a m b 一2 31 细胞e r k l 2 亚途径的影响 i 勰荔蘧警 对 弩一 4 襄一 争 器曩6 己 i 时誓i 谖 j4 二警 d 彳 i 够 溆 磬 飞 j j 多 每 o o 移 j 警 o 每 浙江工业大学硕士学位论文 4 2 2 人参皂甙对e i 1 2 亚途径表达量平均光密度值比较 兔抗鼠p 4 4 4 2m a p k e r k l 2 1 3 7 f 5 多克隆抗体敷育的r 9 3 组和c o n t r o l 组细胞平 均光密度值分别为o 0 8 3 士0 0 0 8 和o 0 9 6 士0 0 0 3 s p s s l 6 0 分析二者无显著性差异 胗0 0 5 兔抗鼠磷酸化p 4 4 4 2 1 f 1 2 0 2 厂r y r 2 0 4 多克隆抗体敷育的i 沁3 组和c o n 仃o l 组细胞平 均光密度值分别为o 0 3 9 士0 0 0 4 和0 0 5 8 士0 0 0 3 s p s s 软件分析1 6 0 分析得i 沁3 组和 c o 曲r o l 组具有显著性差异 书p o 0 5 说明r 9 3 组磷酸化e r k 表达弱于c o i 嫩o l 组磷酸化e r k 表达 o 1 2 o 1 o 0 8 呈o 0 6 o 0 4 o 0 2 o e r k p h o s p h o e r k e r k l 2s u b p a t h w a y 图4 2 r 舀对e r k l 2 亚途径的影响 m d 为平均光密度值 f i 9 4 2 m e 能c t o f i 够0 n e r k l 2 加i s m e 觚d e n s 时 注 与对照组相比 尸 o 0 5 兔抗鼠磷酸化s a p 幻仆 m 18 3 t r r l8 5 单克隆抗体敷育的i 沁3 组和c o n 们l 组细 胞平均光密度值分别为o 0 3 5 士0 o o l 和0 0 7 4 士o 0 0 2 s p s s l 6 0 分析得知其具有显著性 p 0 0 5 浙江工业大学硕士学位论文 0 0 8 0 0 7 0 0 6 0 0 5 盆0 0 4 o 0 3 o 0 2 o o l o p h o s p h o j n k 图4 4 睁对肿 亚途径的影响 为平均光密度值 f i 9 4 4j n ks i g n a l i n gs u b p a i l l w a yc o m p a r i s o no f m e a nd e i l s 渺v a l u e s 注 与对照组相比 尸 0 0 5 f 4 0 1 4 2 9 n 5 4 3 讨论 乳腺癌细胞的发生发展涉及许多信号通路的改变 其中m p k 通路在肿瘤细胞的 增殖 分化 转移和浸润中都起了重要的作用 e r k l 2 亚途径是凇p k 信号通路中研究最清楚也是最重要的一条通路 也是与癌 症关系最密切的一条途径 e i 水信号通路和细胞的增殖 分化 凋亡 迁移都有关 它 可被许多胞外信号所激活 e r k l 2 被m e k 激活后 依次激活m a p l 0 0 k 即r a f r 胙1 b 姘 a r a t m e k m a p q m a p k 1 6 j 其中 被细胞生长因子和丝裂原所激活的 e r k l 2 与肿瘤关系较为密切 z h o n gl i 等 7 l 以染料木黄酮作用于m a m b 2 3 l 细胞后 发现e r k l 2 亚途径在2 4 h 后被持续激活 可保持至4 8 h 后 1 1 1 a i l h h u l l g 等 6 1 1 以自藜芦 醇作用m d a m b 2 3 1 细胞2 4 h 后也发现了e r k l 2 亚途径的持续激活 另外 其他研 究也说明了 e r k l 2 亚途径发生作用一般都在2 4 h 4 8 h 7 0 7 2 1 之前的表达较弱或无法 检测 因此 对于e r k l 2 亚途径来说 2 4 h 或以上是其作用后发生效用的时间点 因 此本实验采用了敷育人参皂甙i 沁3 后2 4 h 的细胞作为研究e i 1 2 亚途径的时间点 在 本实验中 r 酪作用于乳腺癌细胞2 4 h 后 e r k 的表达被抑制 说明人参皂甙r 9 3 对 e r k l 2 亚途径的作用是抑制 而e r k l 2 亚途径和细胞的增殖分化密切相关 说明r 9 3 3 7 浙江工业大学硕士学位论文 可能是通过e r k l 2 亚途径抑制m d a m b 2 3 1 细胞的活性的 k 亚途径应激活化蛋白激酶 s a p k 属应激信号通路 在细胞因子 紫外照射 生长因子缺少 d n a 损伤物的作用下会开启 k 家族包括 k 1 刷k 2 k 3 k 由g p k g m e k k l s e k l k 1 级联反应激活 7 3 主要和细胞的前增殖以及前凋亡有 关 肿瘤细胞具有耐受多种应力状态的能力 如低氧 脱离基质 炎症反应 代谢产物 失调等 这些都跟肿 亚途径相关 但是小k 亚途径的控制在很大程度上和细胞的种 类以及外界刺激的种类密切相关 在以往的实验中 州 脚k 亚途径的作用时间点一 般在l h 6 h 7 4 彻 超过6 h 后 一般无法检测