（分析化学专业论文）头孢菌素和苏丹红在鲁米诺溶解氧反应体系中发光行为研究和应用.pdf

头孢菌素和苏丹红在鲁米诺溶解氧反应体系中 发光行为研究和应用 摘要 本学位论文包括综述和研究报告两个部分。 第一部分综述 本部分以2 0 0 6 年以来国内外一百多篇化学发光研究论文为基础，综述了鲁米诺、酸 性高锰酸钾、四价铈、光泽精等化学发光体系，总结了鲁米诺化学发光体系的反应机理 及其在食品分析，环境分析等领域中的应用。 第二部分研究报告 本研究工作主要采用鲁米诺溶解氧和鲁米诺溶菌酶流动注射化学发光体系，完成 了对头孢菌素( c e p h a l o s p o r i n s ) 和苏丹e l i ( s u d a nd y e s ) 含量的测定。 1 头孢菌素与鲁米诺发光行为的研究及应用 当头孢菌素与鲁米诺混合时，鲁米诺溶解氧的化学发光强度明显的减小了，其减 小值与头孢菌素浓度的对数值在纳克至微克之间呈现线性关系，检出限在纳克水平。头 孢菌素测定的灵敏度由高到低为：头孢哌酮 头孢曲松 头孢呋辛 头孢克洛 头 孢氨苄 头孢拉定。该方法已成功应用于体外监测口服头孢拉定胶囊后头孢拉定在人 体尿液中的排出量，进一步讨论了化学发光机理以及测定灵敏度与头孢菌素不同代之间 的关系。本研究工作发表在d r u gm e t a b o l i s ml e f f e r s ，2 0 0 9 ，3 ( 3 ) ：1 4 4 1 5 1 。 2 流动注射化学发光法测定辣椒粉中的苏丹红i v 基于苏丹红i v 对于鲁米诺溶解氧化学发光反应的增强作用，本文采用流动注射化 学发光方法对于苏丹进行了灵敏的测定。化学发光强度的增加值与苏丹的浓度在 o 7 3 0 0 0n gm l j ( r 2 = 0 9 9 8 2 ) 的范围内呈现线性关系，检出限为0 2n gm l 。1 ( 3 0 ) 。在流 速为2 0m lm i n 1 时，整个测定过程，包括进样和冲洗，在4 0s 内完成，相对标准偏差均 小于5 o ( n - - 7 ) 。该方法成功应用于测定被污染的辣椒粉中苏丹，回收率为 8 9 3 一1 0 8 4 。本研究工作发表在j o u r n a lo f t h es c i e n c eo f f o o da n d a g r i c u l t u r e ，2 0 1 0 ， 9 0 ( 2 ) ：3 3 8 - 3 4 2 。 i 3 流动注射化学发光法测定苏丹红i 本研究以苏丹红i 对鲁米诺溶菌酶的化学发光反应的增敏为基础，设计出一种简便、 快速、灵敏地测定苏丹红i 的新方法。鲁米诺溶菌酶体系化学发光强度的增加值( i ) 与苏 丹红i 浓度在7 3 0 0 0p gm l 1 的范围内具有良好的线性关系( r 2 = o 9 9 9 0 ) ，检出限为2p g m l 以( 3 6 ) ，实验测定的相对标准偏差小于3 0 ( n - - 5 ) 。该方法成功应用于被污染的辣椒 酱中苏丹红i 含量的测定，回收率为9 1 1 1 0 5 4 。本研究工作发表在分析化学，2 0 0 9 ， 3 7 ( a 0 1 1 ：2 0 9 2 0 9 。 关键词：流动注射，化学发光，头孢菌素，苏丹红染料 a bs t r a c t t h et h e s i sc o n s i s t so ft w o p a r t s ：r e v i e wa n dr e s e a r c hr e p o r t s p a r ti ：r e v i e w i nt h i sp a r t ，t h ec h e m l u m i n e s c e n c es y s t e m si n c l u d i n gl u m i n o ls y s t e m ，a c i d i cp o t a s s i u m p e r m a n g a n a t es y s t e m ，c e ( i v ) s y s t e m ，l u c i g e n i ns y s t e m ，e t c h a v eb e e nr e v i e w e d ，b a s e do n o v e ro n eh u n d r e dr e f e r e n c e sf r o m2 0 0 6t on o w , a n dt h em e c h a n i s m sa n da p p l i c a t i o n si nf o o d a n a l y s i sa n de n v i r o n m e n t a la n a l y s i so fl u m i n o lc h e m l u m i n e s c e n c es y s t e m sh a v eb e e n s u m m a r i z e d p a r ti i ：r e s e a r c hr e p o r t s i nt h i sp a r t ，c e p h a l o s p o r i n sa n ds u d a nd y e sw e r ed e t e r m i n e d ，u s i n gl u m i n o l d i s s o l v e d o x y g e na n dl u m i n o l l y s o z y m ef l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n ts y s t e m 1 as t u d yo ft h ec h e m i l u m i n e s c e n c eb e h a v i o ro fc e p h a l o s p o r i n s 、航t l ll u m i n o la n di t s a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n t h ec h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yo fl u m i n o l d i s s o l v e do x y g e nw a sd e c r e a s e dw h e n c e p h a l o s p o r i n sw e r em i x e dw i t l ll u m i n 0 1 t h ed e c r e a s ec h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a s l i n e a rw i t ht h el o g a r i t h mo fc e p h a l o s p o r i n sc o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g ef r o mn a n o g r a mt o m i c r o g r a m m el e v e l ，w i t ht h el i m i t so fd e t e c t i o na tn a n o g r a ml e v e l t h es e n s i t i v i t i e so f d e t e r m i n a t i o nf o rc e p h a l o s p o r i n sw e r ei nt h eo r d e ro fc e f o p e r a z o n e c e f t r i a x o n e c e f u r o x i m e c e f a c l o r c e f a l e x i n c e f r a d i n e t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e dt om o n i t o r t h ee x c r e t i o no fc e f r a d i n ei nh u m a nu r i n ea f t e rt a k e nc e f r a d i n ec a p s u l e s t h ep o s s i b l e c h e m i l u m i n e s c e n c em e c h a n i s ma n dr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed e t e r m i n a t i o ns e n s i t i v i t i e sa n d g e n e r a t i o n so fc e p h a l o s p o r i n sw e r ea l s od i s c u s s e d t h i sw o r kh a sb e e np u b l i s h e di nd r u g m e t a b o l i s ml e t t e r s ，2 0 0 9 ，3 ( 3 ) ：1 4 4 - 1 5 1 2 d e t e r m i n a t i o no fs u d a ni vi nh o tc h i l l i p o w d e rw i t l l l u m i n o l d i s s o l v e do x y g e n c h e m i l u m i n e s c e n c es y s t e m as e n s i t i v e p r o c e d u r e ，b a s e d o nt h ee n h a n c i v ee f f e c to fs u d a ni vo nt h e c h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o nb e t w e e nl u m i n o la n dd i s s o l v e do x y g e n ，w a sp r o p o s e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fs u d a ni vi naf l o w i n j e c t i o ns y s t e m t h e i n c r e m e n to ft h e c h e m i l u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fs u d a ni v , g i v i n ga i i i c a l i b r a t i o ng r a p hl i n e a ro v e rt h ec o n c e n t r a t i o nf r o mo 7n gm l t o3 0 0 0n gm l 。1 ( r 2 = 0 9 9 8 2 ) w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f0 2n gm l 1 ( 3 0 ) a taf l o wr a t eo f2 0m lm i n 1 ，a c o m p l e t ed e t e r m i n a t i o no fs u d a ni v , i n c l u d i n gs a m p l i n ga n dw a s h i n g ，c o u l db ea c c o m p l i s h e d i n4 0sw i t ht h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n so fl e s st h a n5 o ( n - 7 ) t h ep r o p o s e dm e t h o d w a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs u d a ni vi nc o n t a m i n a t e dh o tc h i l l ip o w d e r 谢t 1 1t h er e c o v e r i e sf r o m8 9 3 t o10 8 4 t h i sw o r kh a sb e e np u b l i s h e di nj o u r n a lo ft h e s c i e n c eo f f o o da n d a g r i c u l t u r e ，2 0 10 ，9 0 ( 2 ) ：3 3 8 3 4 2 3 f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e r m i n a t i o no fs u d a ni an e wm e t h o d ，b a s e do nt h ee n h a n c i v ee f f e c to fs u d a nio nt h ec h e m i l u m i n e s c e n c e r e a c t i o nb e t w e e nl u m i n o la n dl y s o z y m ei naf l o wi n j e c t i o ns y s t e m , w a sp r o p o s e df o r d e t e r m i n a t i o no fs u d a ni t h ei n c r e m e n to ft h ec h e m i l u m i n e s c e n c e i n t e n s i t y w a s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fs u d a nio v e rt h er a n g eo f7 - 3 0 0 0p gm l 一( r 2 = 0 9 9 9 0 ) 晰t 1 1t h ed e t e c t i o nl i m i to f2p gm l 咀( 3 6 ) t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sw e r el e s st h a n 3 0 ( n _ 5 ) t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sa p p l i e ds u c c e s s f u l l yt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs u d a ni i nc o n t a m i n a t e dh o tc h i l l is o u r c ew i t ht h er e c o v e r i e so f91 1 10 5 4 t k sw o r kh a sb e e n p u b l i s h e di nc h i n e s e j o u r n a lo f a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，2 0 0 9 ，3 7 ( a 0 1 ) ：2 0 9 2 0 9 k e y w o r d s ：f l o wi n j e c t i o n ，c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c e p h a l o s p o r i n s ，s u d a nd y e s 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：垒亟：!指导教师签名： 力口p 年j 月“日纠口年 月彩日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 二 思。 学位论文作者签名：斗砀h i 沙p 年岁月“日 西北大学硕士学位论文 第一部分综述 1 1 引言 近几年，国内外频频传出药品质量不合格致病事件，食品中被检测出含有超标物质， 如：山西的问题疫苗、各地发现的假冒药品、红心鸭蛋、辣椒制品中的“苏丹红”、鱼 肉组织中的“孔雀石绿”、大肉中的“瘦肉精”、以及奶制品中的“三聚氰胺 等事件引 起了人们对药物及食品安全的重视。美国、欧盟等发达国家相继对进口食品的安全指标 提出了越来越严格的要求，我国政府也于2 0 0 9 年6 月颁布了新的食品安全法，食品、 药品安全问题逐渐成为大家关注的焦点问题。随着国民经济的发展，药物、食品的安全 问题受到了空前的重视，药物、食品检测的新方法、新技术和新标准也随之不断涌现。 分析化学正朝着开发绿色、清洁技术以及环境友好体系的方向发展。流动注射化学 发光法由于具有较快的分析速度、相对简单的仪器设备、高的灵敏度和低的化学试剂消 耗等优点满足了人们对绿色化学的要求，其中的鲁米诺溶解氧化学发光体系以其简单 的体系、环境友好等特点在药物及食品分析中具有广泛的应用前景。 化学发光法对药物及食品的分析，可分为两类： 1 药物或食品添加剂直接与化学发光试剂发生反应，产生化学发光。 2 药物或食品添加剂对化学发光体系的增敏或抑制作用。 在一定的实验条件下，药物或食品添加剂在一定浓度范围内与化学发光强度呈现线 性关系，该化学发光体系可用于该药物及食品的定量分析。 1 2 化学发光概述 某些物质在常温下进行化学反应，能够生成处于激发态的反应中间体或产物，这些 反应中间体或产物在从激发态跃迁返回基态时会伴随有光子辐射的现象。由于物质激发 态的能量是通过化学反应，而不是通过其他途径如光照或加热等途径获得的，故将这种 通过化学反应产生的光辐射称为化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 。确切地说，化学 发光是指由高能量、不放热、不做其他功的化学反应所释放的能量，去激发体系中的反 应物、荧光物质或者中间体，使其由基态跃迁至激发态，当其再从激发态返回基态时， 将能量以光辐射的形式释放出来，从而产生的次级光辐射。化学发光现象的本质是将化 学能转换为光能的过程。 第一部分综述 r a d z i s z e w s k i 等在1 8 7 7 年发现在过氧化氢存在时，洛粉碱( 2 ，4 ，5 三苯基咪唑) 能 够在碱性介质中发出绿色的光。在1 8 8 8 年，w i e d e m a n n 等对化学发光现象进行了科学 的解释，认为这是一种相对简单的有机反应。自此以后，人们发现并合成了越来越多的 化学发光化合物，其中最为重要的就是鲁米诺( 1 u m i n 0 1 ) ，在1 9 0 2 年由s c h m i t z 等合成。 1 9 2 8 年，a l b r e c h t 等首先观察到l u m i n o l 在碱性介质中的化学发光行为，由于它具有其 它试剂无法比拟的优点，如光量子产率高、水溶性好和容易合成等，直到目前为止依然 是一种应用非常广泛的化学发光试剂。 目前，化学发光分析已成为一种优良的分析手段1 一。化学发光分析依据在某一时 刻化学发光强度或化学发光总量对反应中组分含量进行定量，是一种分子发射光谱分析 法。与其它发射光谱分析方法相比较，如荧光和磷光，化学发光分析由于不需要外界光 源，因此可以有效的避免背景光和散射光的干扰，降低了背景干扰，提高了光电倍增管 在高压下工作时的信噪比。由于化学发光分析的线性范围宽，灵敏度高，设备简单，操 作方便，将它与毛细管电泳技术、流动注射技术、传感器技术和芯片技术等相结合可以 实现高灵敏度的、微型化的和高自动化的分析，使它易于实现在线分析和批量分析，并 在痕量分析领域具有广泛的应用。此外，化学发光成像技术可以为研究的体系提供丰富 直观的信息。 化学发光可以分为直接化学发光和间接化学发光。其中直接化学发光是最简单的化 学发光反应，有两个关键的步骤组成：激发和辐射。它是化学发光反应中最多、最为普 遍的类型，大多数有机物分子在液相中的化学发光属于这一类型。间接化学发光又称为 能量转移化学发光，它主要由三个步骤组成：激发、能量转移和辐射。 因此，对于一个化学反应，如果要产生化学发光现象，必须满足以下三个条件： l 、必须为放热反应，能够提供足够的激发能，以使该反应所放出的化学能足以使反应 产物分子变为激发态。 2 、在反应过程中，必须能够使反应的化学能至少被一种物质吸收形成激发态。 3 、处于激发态的产物分子本身可以发光或能够将能量传递给其他分子，并使其分子跃 迁至激发态发光。 由于化学发光强度与反应速率相关，因此化学发光反应能够用于分析测定。 一个化学发光反应过程，一般可以由下式给出： 反应物a + 反应物b _ 激发态产物c 宰+ 其它产物 激发态产物c 一基态产物c + 光子 2 西北大学硕士学位论文 发光强度( i c l ) 与化学反应的速率( d c d t ) 和化学发光量子效率( o c l ) 有以下关 系： i c l = o c l d c d t = o e x o e m d c d t 其中化学发光量子效率c l 取决于激发态量子效率( o e x ) 和发光量子效率( e m ) ： o c l = 尉e m 对于特定的化学发光反应，o c l 为定值。同时，对于基元反应，其反应速度可以根 据质量作用定律由反应体系中物质浓度给出，因此，由化学发光强度值就可以测定反应 体系中某种物质的浓度。 一般来说，对于一级或假一级的化学发光反应，都可以通过公式进行定量分析。以 上述反应为例，若物质b 浓度恒定，物质a 浓度变化视为一级或假一级反应，那么其 化学发光强度值可以表示为： 乞= 他( f ) 协= p q 幽( f ) 西k = 已c a 即化学发光强度i c l 与物质a 的浓度成正比。 化学发光分析由于具有众多的优点，在近几十年来得到了很大的发展与广泛的应 用，尤其在痕量与微量分析中具有独特的应用优势。 本文在总结了2 0 0 6 - 2 0 1 0 年有关化学发光的文献基础上结合本人的研究工作简要 综述了各种经典化学发光体系，尤其是鲁米诺一溶解氧、鲁米脊过氧化氢、鲁米诺一铁 氰化钾、鲁米诺碘化物、鲁米诺一高锰酸钾和鲁米诺一肌红蛋白等化学发光体系以及它 们的应用进展。 1 3 常见化学发光体系及其应用 化学发光反应依据其反应介质的不同，可以分为四种：气相化学发光、液相化学发 光、固相化学发光和异相化学发光。其中的液相化学发光发展最为迅速，因为它的反应 为液相反应，易于操控、发光体系多样、设备易于商品化。因此，本节将对液相化学发 光反应体系进行综述。 1 3 1 鲁米诺体系 鲁米诺( 3 一氨基一邻苯二甲酰肼，如图l 所示) ，由于其结构简单，易于合成，性质 稳定，有较好的水溶性以及较高的发光效率等众多的优点，是目前研究较为深入和应用 3 第一部分综述 较为广泛的一种液相化学发光试剂。鲁米诺的化学发光量子效率与溶液中的p h 值具有 密切的关系，当溶液p h 值在1 1 附近时达到最大值，加入适当的氧化剂或者催化剂可 以极大的提高鲁米诺的化学发光强度。鲁米诺在化学发光反应过程中发出蓝光，其最大 发射波长位于4 2 0n l i l 至4 5 0n n l 之间，其发光反应会在数秒内即达到最大值而后又迅速 衰减。 n h i n h n h 2 o 图1 鲁米诺结构示意图 在碱性条件下，鲁米诺可以被许多氧化剂所氧化，形成叠氮醌，然后形成桥式六元 环过氧化物中间体，分解后产生化学发光。在通常情况下，鲁米诺与过氧化氢的化学发 光反应十分缓慢，但当一些催化剂，如过渡离子或某些金属复合物等存在时，其反应速 率会大大提高。在一定的范围内，其反应的化学发光强度直接与鲁米诺、过氧化氢或催 化剂的浓度呈现线性关系，因此可以用于这些物质的定量测定。除此之外，还有多种氧 化剂可以引起鲁米诺产生化学发光。目前，根据氧化剂的不同，一般鲁米诺化学发光体 系可分为鲁米诺一溶解氧、鲁米诺一过氧化氢、鲁米诺一铁氰化钾、鲁米诺坝化物、鲁米 诺一高锰酸钾、鲁米诺一肌红蛋白等体系。鲁米诺化学发光体系对化学发光分析法发展成 为一种重要的分析手段起到了非常重要的作用。 1 3 2 酸性高锰酸钾体系 1 9 2 0 年，在鲁米诺化学发光现象发现前八年，g r i n b e r g1 3 】等就报道了以高锰酸钾作 为发光试剂的化学发光现象。由于高锰酸钾化学发光体系所需要的试剂非常普通，其发 光信号强度也一般比较稳定，如今己在大气环境检测、毒品分析以及药物检验等许多方 面得到了实际的应用，成为目前应用较广泛的发光试剂之一卜9 1 。例如，高锰酸钾亚硫 酸盐体系用于测定药物以及模拟尿样中左旋多巴【1 叫的含量，药物中黏菌素【l l 】的含量，药 物以及模拟尿样中布洛芬【1 2 】的含量，测定的线性范围分别为3 4 1 0 一2 4 1 0 。5m o ll ， 4 1 0 0i s gm l ，o 1 1 0 0m gl ，检出限分别达到1 1 1 0 8m o ll 1 ，1 2 嵋m l 1 ，0 0 2m g l 。l i u 等采用高锰酸钾一甲醛体系在多磷酸盐酸性介质中测定滴鼻剂中的磺胺嘧啶 4 西北大学硕士学位论文 含量，线性范围为：8 0 1 0 2 0 1 0 4m o ll ，检出限为2 0 1 0 。7m o ll 一。w a s e e m 等采用酸性介质中高锰酸钾甲醛体系测定药物中的维生素a 和维生素e 含量【1 4 】。此外， m n ( i v ) 1 5 1 的化学发光现象也有研究，但是由于其反应历程复杂，其发光机理的讨论方 面的研究相对较少。 1 3 3 四价铈体系 与高锰酸盐类似，在酸性介质中，四价铈c e 0 v ) 具有很强的氧化能力，可以与许多 种还原性的无机物或者有机化合物发生氧化还原反应，成为强氧化性化学发光试剂之 一。目前已被应用于二氧化硫、碘、灿3 + 、亚硫酸盐以及部分有机化合物的化学发光分 析，对其进行直接测定【1 6 。2 1 1 。c e ( i v ) 体系的化学发光反应机理通常被认为是c e ( r v ) 被还 原时生成激发态的c e ( i i i ) ，当其跃迁至基态时产生化学发光。与高锰酸钾体系相比， c e ( i v ) 体系非常适用于水样中物质的测定，由于其介质不受氯离子的影响，而且还可以 采用盐酸对溶液酸度进行调节。此外，由于高锰酸钾具有强烈的光吸收作用和易于分解 的特点，在浓度较高时往往发生化学发光自熄作用。而c e ( i v ) 溶液颜色比较浅，光吸收 的能力较小，因此可以通过加大浓度的方法提高测定的灵敏度。 1 3 4 光泽精体系 光泽精( n ，n 二甲基9 ，9 联吖啶二硝酸盐) 以硝酸盐的形式存在，也是一种常 见的化学发光试剂，属于吖啶类化合物。它是由g l e u 和p c t s c h 于1 9 3 5 年发现的，它在 碱性条件下发生反应时发出波长为4 7 0i l i i l 的蓝绿色可见光。在一些还原性物质如维生 素c 、还原性糖、尿酸等的存在下可以产生化学发光，因此可以用来对其进行测定。无 催化剂存在时，在碱性介质中光泽精可被过氧化氢缓慢氧化而产生极微弱的发光，但当 加入催化剂如过渡金属离子n i ( i i ) 、a g ( i ) 、b i ( i i i ) 、p b ( i i ) 、c o ( i i ) 、t i ( i i i ) 时，光泽精发 光体系的发光速率急剧加快，发光强度也随之增强【2 2 之4 】。近年来，有不少研究工作者对 该体系进行了研究，例如：d u 等分别在碱性条件下，采用高碘酸钾光泽精体系测定了 药物中异烟肼例和钴2 6 1 及水样中的三价c r ( i i i ) 和全c r 【2 7 】的含量。 1 3 5 - - - ( 2 ，2 一联二吡啶) 钌( i i ) 配合物体系 如图2 所示，- - ( 2 ，2 联二吡啶) 钌( i i ) 体系是由r u 2 + 与三个2 ，2 联二吡啶组成的钌 ( i i 卜联吡啶配合物r u ( b p y ) 3 2 + 。它的化学发光现象是由l y t l e 等人于1 9 6 6 年发现的，在 强酸强碱的r u ( b p y ) 3 2 + 溶液中加入胺，观察到橘红色的发光。它具有较强的荧光特性， 激发态的三联吡啶钌( i i ) 在6 2 0n i n 处具有最大发光发射，呈橙色。该激发态物质通常可 s 第一部分综述 以通过r u ( b p y ) 3 3 + 或r u ( b p y ) 3 + 的氧化还原反应得到，由于其能够使r u ( b p y ) 3 2 + 再生，所 以该体系不会消耗化学发光试剂。近年来，用三联吡啶钌( i i ) 配合物为发光试剂测定物 质的报道比较多，如用于测定水样中的莠去津口引、用于同时测定陪替丁和美沙酮【2 9 1 、 用于测定氧氟沙星【3 0 1 、头孢丙烯1 3 1 】、海洛斟3 2 1 、d n at 3 3 1 、喹硫平3 4 1 、甲状腺素删、赛 洛西刭3 纠和茶丹宁3 刀等。 图2 三联吡啶钌( i i ) 盐结构图 1 3 6 过氧化草酸酯体系 过氧化草酸酯( p e r o x y o x a l a t e ) 的化学发光反应被认为是目前最为有效的非生物化 学发光反应，其最大的量子产率可以达到3 4 。由于具有较高的化学发光效率，此类化 合物除了在分析化学领域被广泛地研究和应用之外，还被较多地用于研制开发便携式光 源。r a u _ h u t 等利用该体系研究开发了应急光源，并将其称为“化学光源”( c h e m i c a ll i g h t ) ， 成为草酸酯体系获得实际应用的重要例子之一，并研制了发光棒，其最初主要应用于军 事目的，后来逐渐转入到民用领域。 过氧化草酸酯化学发光现象最早发现于1 9 6 3 年，c h a n d r o s s 等d 8 1 率先报道了草酰氯 和过氧化氢在荧光试剂的存在下可以产生化学发光。过氧化草酸酯类化合物的化学发光 反应属于间接化学发光，一般是由草酸酯与一种氧化剂( 如过氧化氢) 反应产生高能量 的中间体，并由此中间体激发合适的荧光试剂而产生化学发光。其发光过程实际上是通 过荧光发射得到测量，荧光量子效率大的化合物，其化学发光的强度也比较大。该体系 具有很多的优点，如：发光效率高、强度大、寿命长等。但是由于在水溶液中，草酸盐 类物质会水解放出c 0 2 ，限制了该反应体系在分析中的应用。 1 3 7 二氧杂环丁烷类体系 1 ，2 二氧杂环丁烷类化合物在受热时，经单分子转变后生成含羰基化合物，其中 6 西北大学硕士学位论文 叱姆 头孢曲松 头孢 呋辛 头孢克洛 头孢氨苄 头孢拉定。该实验结果可能表明测定的灵敏度与头孢 菌素的代数及脂水分配系数( 1 0 9 p 值) 有关。 1 8 西北大学硕士学位论文 头孢菌素母体 药物 头孢拉定 头孢氨苄 头孢克洛 头孢呋辛 头孢曲松 头孢哌酮 r ( n n i o c h ， x c h 3 - c h 3 c l i n h ， h 3 q 、 o s h 即人 图1 0 头孢拉定，头孢氨苄，头孢克洛，头孢呋辛，头孢曲松与头孢哌酮结构式 2 1 2 实验部分 2 1 2 1 试剂 实验中所用试剂均为分析纯，所用水均为蒸馏水经过m i l l i - q 超纯水系统( m i l l i p o r e ， b e d f o r d ，m a ，u s a ) 净化后的二次去离子水。 鲁米诺( f l u k a , b i o c h e m i k a , s w i t z e r l a n d ) 标准品由西安医药采购供应站提供。头孢菌 素标准品由中国药品生物制品检定所提供。头孢拉定，头孢氨苄，头孢克洛，头孢呋辛， 头孢曲松与头孢哌酮标准储备液( 1 0m gm l 1 ) 存放于冰箱中。测定溶液通过j j i k - - 次去 离子水稀释以上标准储备液制得。 2 5 1 0 。2m o ll 1 鲁米诺储备液由溶解0 4 4g 鲁米诺标准品于1 0 0m lo 1t o o ll 。1 n a o h 溶液中制得，并避光保存。 1 9 殴双 第二部分研究报告 2 1 2 2 实验装置及过程 流动注射化学发光装置为由西安瑞迈分析仪器有限公司制造的i f a s a 型流动注射 光谱光度分析仪，装置示意图示于图1 1 中。一台蠕动泵为所有管路提供动力，聚四氟 乙烯管( p t f e ，1 0m i l l i d ) 用于整个流动体系的连接管，1 0 0g l 六通阀用于定量注入鲁 米诺试剂。开启该系统后，保持泵速在2 0m lm i n ，将整个体系冲洗至稳定的基线， 然后进入样品头孢菌素溶液，使其与定量的鲁米诺溶液相混合，在碱性条件下流入化学 发光池，产生化学发光，信号由光电倍增管( p m t ) i 贝i 定，并由计算机记录下来。采用同 样的方法，用净化后的二次去离子水代替头孢菌素样品溶液进样，做一空白。样品溶液 的浓度通过化学发光信号的减小值( a i = i o - i 。) 进行定量，其中，i 。与i o 分别为在头孢菌 素存在和不存在的条件下系统的化学发光信号值。 紫外可见分光光度计( m o d e ll a m b d a 一4 0 p ，p ec o l t d ) 。 n a o h l u m i n o l c a r t i e r s a m p l e p u m p l l 图n 流动注射化学发光测定头孢菌素的实验装置示意图 d e t e c t o r c o m p u t e r 2 1 3 结果和讨论 2 1 3 1 鲁米诺溶解氧头孢哌酮化学发光强度与时间关系 在该流动注射体系中，采用2 5 1 0 。5m o ll 1 鲁米诺溶液与0 0 2 5m o ll 。1n a o h 溶 液进行化学发光强度与时间关系实验。如图1 2 所示，当体系中不存在头孢哌酮时，化 学发光信号强度在8s 时达到最大值，并在4 0s 内达到零；当加入0 7l a gm l 1 头孢哌酮 时，化学发光信号强度值由3 5 5 降低到7 5 。 2 1 3 2 鲁米诺及n a o h 浓度对化学发光强度的影响 鲁米诺作为发光试剂，其浓度大小对化学发光强度值具有很大影响。本实验对鲁米 2 0 西北大学硕士学位论文 诺的浓度从1 0 1 0 石m o ll d 到1 0 1 0 4t o o ll j 进行实验。当鲁米诺的浓度逐渐增大时， 其化学发光信号值也逐渐增加，鲁米诺浓度达到2 5 1 0 5t o o ll 1 时，发光强度趋于稳 定，实验选择鲁米诺的浓度为2 5 1 0 。5m o ll 1 。 鲁米诺的化学发光反应需在碱性条件下完成。因此，需要加入一定浓度的n a o h 溶 液。n a o h 溶液浓度从0 0 1m o ll d 到0 1m o ll 。1 进行实验。n a o h 浓度逐渐增加时，化 学发光强度逐渐增强，当浓度达到0 0 2 5m o ll 以时发光强度趋于稳定。因此，n a o h 浓 度选为0 0 2 5m o ll 一。 o1 02 03 0 t i m e ( s e c o n d ) 图1 2 鲁米诺溶解氧头孢哌酮化学发光强度与时间关系 一头孢哌酮不存在时的化学发光信号 0 7g gm l 。1 头孢哌酮存在时化学发光信号 2 1 3 3 温度对化学发光强度的影响 采用2 5 1 0 巧t o o ll 。的鲁米诺溶液与0 0 2 5m o ll - 1 的n a o h 溶液对于温度的影响 进行实验。分别在1 5 0 c ，2 0 0 c ，2 5 0 c 和3 0 0 c 下对化学发光强度值进行检测，分别为3 0 3 ， 3 2 4 ，3 5 7 和3 3 8 。2 5 0 c 时化学发光强度达到最大，因此选择2 5 0 c 为最佳条件。 2 1 3 4 流速与混合管长对化学发光强度的影响 流速较低时化学发光信号稳定，但会使峰展宽且降低进样速率。而流速较高时信号 强度较大，但会使基线不稳且浪费试剂。流速对化学发光强度的影响从0 5m lm i n 1 至 5 0m l m i n 1 进行实验，在对试剂消耗与灵敏度之间权衡后，选择2 0m l m i n 1 作为实验 流速。 分别采用1 肚1 0 0c l l l 的混合管长对于混合管的影响进行实验。当使用5 0c m 的管 2 1 如如0 4 3 3 2 2 1 1 =口q_ii一一u q 留至d g 第二部分研究报告 长时，化学发光强度达到最大值。因此，实验中采用5 0c m 的混合管长。 2 1 3 5 头孢菌素的线性范围及检出限 在前述选择的条件下，将一系列不同浓度的头孢菌素标准溶液注入流动注射体系。 实验结果表明，其发光信号强度减小值与头孢菌素溶液浓度的对数值呈现线性关系，线 性范围分别为：头孢拉定为5n gm l d - 5 腭m l 一，头孢氨苄为3n gm l d - 3 岭m l ，头 孢克洛为7n gm l - l _ 7 岭m l ，头孢呋辛为7n gm l 。1 - 1 0 嵋m l 一，头孢曲松为1 0n g m l d - 5 嵋m l ，头孢哌酮为5n gm l 。- 3l l gm l ，检出限均在纳克级：头孢拉定为2n g m l ，头孢氨苄为ln gm l 一，头孢克洛为2n gm l 一，头孢呋辛为2n gm l ，头孢曲松 为3n gm l ，头孢哌酮为2n gm l 一。测定的线性范围，线性方程，线性相关系数以及 检出限( 1 i m i to f d e t e c t i o n , l o d ) 均列于表6 中。该方法对于头孢菌素测定的线性范围从纳 克到微克，达到三个数量级，检出限( 3 0 ) 均在纳克水平。整个分析过程，包括进样与洗 脱，可以在4 0s 内完成，七次重复测定的相对标准偏差均低于5 0 。 表6 头孢菌素的线性方程，检出限及l o g e 值 附注l ：参考文献1 3 7 2 1 3 6 化学发光体系稳定性 在上述条件下，分别注入0 0n gm l ，7 0r i gm l ，7 0n gm l 1 和7 0 0r i gm l 1 头孢 哌酮标准溶液，测定其发光信号，强度的减小值a i = i o i 。，用于测试该系统的稳定性， 实验结果列于表7 中。由表可知，测定的相对标准偏差( r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n , r s d ) 2 2 西北大学硕士学位论文 均在0 6 与2 1 之间。因此，该体系相对比较稳定。 表7 化学发光体系稳定性( 头孢哌酮浓度分别为0 0 ，7 0 ，7 0 ，7 0 0n gm l 。) 1 附注l ：七次测定的平均值 2 1 3 7 干扰实验 在优化条件下，于1 0n gm l 以头孢哌酮标准溶液中，依次加入不同浓度的干扰物， 以此对加入物进行干扰实验。当误差水平为士5 时，允许的干扰物浓度如下：对于醋酸 根离子，碘离子，溴酸根离子，硝酸根离子，磷酸根离子，硫酸根离子，葡萄糖，淀粉 和硼酸盐为2 0i t gm l ；对于钙离子，镁离子，铵根离子，甲醇和乙醇为1 01 t gm l ；对 于铅离子，钡离子，酒石酸盐和尿素为5 0 “gm l ；对于尿酸为1 0l a gm l 。 2 1 3 8 药剂中头孢菌素的测定 该方法被成功应用于药剂中的头孢菌素含量的测定。测定药剂分别为注射用头孢呋 辛钠( 丽珠集团丽珠制药厂，1 5g 瓶) ，注射用头孢曲松钠( 海南轻骑海药股份有限公 司，1 0g 瓶) 和注射用头孢哌酮钠( 哈药集团制药总厂，1 0g 瓶) 。准确称取注射用头 孢呋辛钠，头孢曲松钠和头孢哌酮钠1 5m g ，溶于二次去离子水，溶解后用滤纸过滤， 并稀释至1 0 0m l 容量瓶中。将该溶液稀释至测定的线性范围内，采用上述方法进行测 定。实验结果列于表8 中，回收率从9 6 3 至1 0 5 2 ，本实验结果与紫外分光光度法 ( u v ) 测定结果相一致。 第二部分研究报告 表8 药剂中头孢菌素测定结果1 o 2 2 0 头孢曲松 o 4 4 0 3 5 2 5 6 9 3 3 2 7 9 1 0 3 0 3 0 5 0 5 9 9 01 0 2 1 0 4 30 9 8 1 0 2 6 3 0 8 8 4 6 0 4 1 1 2 7 0 9 o 9 1 4 1 4 9 8 31 0 1 1 0 1 30 9