（发酵工程专业论文）纳豆激酶研究.pdf

关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目 约豆蝴黉 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留 使用学位论 文的规定 大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等 复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 口 是否保密 保密期至wf 汐年多月f 日为止 学生签名 导师签名 主丝查丝 埘3 年弓髓 ib 摘要 摘要 本论文从日本食品纳豆中分离出具有纤溶酶活性的菌株1 1 株 并进行生理生化性 质鉴定 鉴定其为枯草芽孢杆菌 通过液体发酵比较各菌株的产纤溶酶的活力 挑选 出活性较高的菌株n 0 6 并对其进行发酵条件优化 最佳液体发酵的碳源 氮源 碳 氮比的组成以及装液量和发酵初始p h 值 葡萄糖1 5 蛋白胨1 5 碳氮比l i 装液量5 0 m l 2 5 0 m l 发酵初始p h 6 5 利用氯化苄方法从野生菌纳豆枯草杆菌n 0 6 中提取了基因组d n a p c r 的方法 将纳豆激酶基因 n k 1 扩增出来 并最终使n k 1 基因在巴斯德毕赤酵母 p p a s t o r i s g s l l 5 中成功表达出具有活性的纳豆激酶 p c r 扩增出纳豆激酶与泛素融合基因u b i n k 2 将u k n k 2 基因p c r 产物克隆 至p m d l 8 t 载体中 获得重组质粒p m d l 8 t u b i n k 2 并转入大肠杆菌j m l 0 9 关键词枯草杆菌 纳豆激酶 泛素 融合表达 尸p a s t o r i sg s l1 5 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sp a p e rs c r e e n e d11s t r a i n sw i t hf i b r i n o l y t i ca c t i v i t yf r o mj 印a n a s en a t t o a c c o r d i n g t om o r p h o l o g i c a l p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s t h es t r a i n sw e r ei d e n t i f i e da s b a c i l l u ss u b t i l i s r e s e a r c h e do nt h eh i g h e s ta c t i v i t yn 0 6s t r a i n w ef o u n dt h e b e s t c o n d i t i o n sf o rn kp r o d u c t i o ni nl i q u i df e r m e n t a t i o n c a r b o ns o u r c ei sg l u c o s eo f1 5 n i t r o g e ns o u r c ei sp e p t o n eo f1 5 c n 1 1 l i q u i dv o l u m ei s5 0 m l 2 5 0 m l f e r m e n t a t i o n o r i g i n a lp hi s6 5 n a t t o k i n a s e n k 一1 g e n ew a sa m p l i f i e db yp c rf r o mg e n o m ed n ao f b a c i l l u s s u b t i l i s n a t t on 一0 6 a n dt h en k 1g e n ew a se x p r e s s e di np p a s t o r i sg s115 u b i n k 一2g e n ew a sa m p l i f i e db yr e c o m b i n a n tp c ra n dw a sc l o n e di n t oc l o n i n gv e c t o r p m d 18 一t t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f e r r e di n t oh o s ts t r a i n se c o l ij m10 9 k e yw o r d b a c i u ss u b t i i s n a t t o kin a s e u biq uitin f u sio n e x p r e s s io n 尸p a s t o r i sg s l1 5 目录 目录 第一章文献综述 1 1 1 纳豆激酶 l 1 2 纳豆激酶的生化特性 0 o d 2 1 2 1 纳豆激酶的分子结构 2 1 2 1 1 纳豆激酶的核酸分子结构 2 1 2 1 2 纳豆激酶的蛋白质分子结构 3 1 2 2 纳豆激酶的分离纯化 3 1 2 3 纳豆激酶的活性测定 3 1 2 3 1 纤维蛋白平板法 3 1 2 3 2 凝块溶解时间法 c l t 4 1 2 3 3 四肽底物法 4 1 2 3 4 血清板法 4 1 2 3 5 三明治式酶联免疫吸附法 e l i s a 4 1 2 4 纳豆激酶的酶学特性 5 1 2 4 1 纳豆激酶的热稳定性及最适反应温度 5 1 2 4 2 纳豆激酶的p h 稳定性及最适p h 5 1 3 纳豆激酶的生物活性 5 1 3 1 纳豆激酶的酰胺水解活性 5 1 3 2 纳豆激酶的纤溶活性 6 1 4 纳豆激酶的溶栓机理 6 1 4 1 血栓的形成 6 1 4 2 纳豆激酶的溶血栓机制 7 1 4 2 1 纳豆激酶的直接溶栓作用 7 1 4 2 2 刺激血管内皮细胞产生内源性t p a 7 1 4 2 3 激活体内尿激酶原转变为尿激酶 8 1 4 2 4 通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂调控纤溶作用 8 目录 1 4 3 纳豆激酶作溶栓药物的优点 8 1 5 纳豆激酶的药理学研究 9 1 5 1 体外溶栓作用 9 1 5 2 体内溶栓作用 9 1 6 具有溶栓作用的酶 9 1 6 1 链激酶 9 1 6 2 尿激酶 1 0 1 6 3 组织型纤溶酶原激活剂 1 0 1 6 4 乙酰化纤溶酶原链激酶复合物 l l 1 6 5 葡激酶 1 l 1 6 6 单链尿型纤溶酶原激活剂 尿激酶原 1 1 1 6 7 溶纤酶 1 1 1 6 8 纳豆激酶 1 2 1 7 纳豆激酶的基因工程技术应用 1 2 1 8 纳豆激酶的研究现状及开发前景 1 2 1 9 泛素 1 3 1 1 0 蛋白质的融合表达 1 4 1 1 1 本论文的研究意义目的和研究方向 1 5 第二章纳豆枯草杆菌的分离鉴定及发酵条件优化 1 6 1 前言 1 6 2 材料与方法 1 7 2 1 试验材料 1 7 2 1 1 菌种分离样品 1 7 2 1 2 主要培养基 1 7 2 1 3 药品 1 8 2 1 4 主要试剂 1 9 2 1 5 主要仪器与设备 1 9 2 2 试验方法 2 0 2 2 1 菌种 l 勺分离和和纯化 2 0 2 2 1 1 样品预处理 2 0 1 1 目录 2 2 1 2 分离纯化 2 0 2 2 2 菌种的鉴定 2 0 2 2 3 溶栓活性测定 2 0 2 2 3 1 纤维蛋白原一琼脂平板的制备 2 0 2 2 3 2 尿激酶标准曲线制作 2 1 2 2 3 3 纳豆激酶活性测定 2 1 2 2 4 纳豆激酶粗酶液的提取 2 l 3 结果与讨论 2 2 3 1 菌种的分离与鉴定 2 2 3 1 1 菌落形态 2 2 3 1 2 菌体形态 2 2 3 1 3 生理生化特性 2 2 3 2 高活性纤溶酶产酶菌株的筛选 2 3 3 3 纳豆激酶发酵 2 4 3 3 1 发酵培养基优化 2 4 3 3 1 1 发酵培养基碳源优化 2 4 3 3 1 2 发酵培养基氮源优化 2 5 3 3 1 3 发酵培养基碳源 氮源比优化 2 6 3 3 1 4 装液量的优化 2 6 3 3 1 5 发酵培养基最佳初始p i t 优化 2 7 3 3 1 6 原发酵条件与优化发酵条件下产酶活性比较 2 7 3 4 纳豆激酶的粗酶液的提取分离纯化 2 8 4 结论 2 9 第三章纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达 3 0 1 前言 3 0 2 材料与方法 3 1 2 1 实验材料 3 1 2 1 1 菌种与质粒 3 l 2 1 2 药品 3 1 2 1 3 试剂 3 1 目录 2 1 3 1d n a 提取所用试剂 3 1 2 1 3 2 质粒提取所用试剂 3 2 2 1 3 3 琼脂糖凝胶电泳所用试剂 3 2 2 1 3 4 纳豆激酶活性测定试剂 3 3 2 1 4 培养基 3 3 2 1 4 1l b 培养基 3 3 2 1 4 2 纳豆枯草杆菌培养基 3 3 2 1 4 3m d 培养基 3 3 2 1 4 4y e p d 培养基 3 3 2 1 4 5 重组酵母生长培养基 3 3 2 1 4 6 重组酵母发酵培养基 3 3 2 1 5 主要仪器与设备 3 3 2 2 试验方法 3 4 2 2 1 纳豆枯草杆菌n 0 6 基因组d a 提取 3 4 2 2 2 以基因组d n a 为模板扩增纳豆激酶 n k 1 基因 3 5 2 2 3 纳豆激酶基因 n k 一1 克隆载体的构建 3 6 2 2 3 1 纳豆激酶 n k 1 p c r 产物的精制 3 6 2 2 3 2n k 1 基因p c r 精制产物末端平滑及磷酸化处理 3 6 2 2 3 3 目的片段的纯化回收 3 6 2 2 3 4p c r 产物与t 载体的连接 3 6 2 2 4 重组质粒转化e c o l ij m l 0 9 及重组质粒的检测 3 6 2 2 5n k 1 基因测序 3 6 2 2 6n k 1 基因表达载体的构建 3 7 2 2 6 1 重组质粒p m d l 8 t n k 1 与载体p p i c 9 k 双酶切 3 7 2 2 6 2 重组质粒p p i c 9 k n k 1 转化e c o l ij m l 0 9 3 7 2 2 6 3 重组质粒p p i c 9 k n k 1 的检测 3 7 2 2 7 重组质粒p p i c 9 k n k 1 转化pp a s t o r i sg s l1 5 3 7 2 2 8 重组纳豆激酶工程酵母菌筛选 3 8 3 结果与讨论 3 8 3 1 提取纳豆枯草市丁菌n 一0 6 基因组d n a 3 8 3 2p c r 扩增出纳豆激酶基因n k 一1 3 9 i v 目录 3 3 纳豆激酶基因 n k 1 克隆载体的构建 3 9 3 4n k 1 基因测序 4 0 3 5 纳豆激酶基因 n k 1 表达载体的构建 4 1 3 6p p i c 9 k n k 1 转化pp a s t o r i sg s l l 5 4 3 3 7 重组纳豆激酶工程酵母茵的发酵筛选 4 3 4 结论 4 4 第四章纳豆激酶与泛素融合基因克隆载体的构建 4 5 l 前言 4 5 2 材料与方法 4 5 2 1 实验材料 4 6 2 1 1 菌种与质粒 4 6 2 1 2 药品 4 6 2 1 3 试剂 4 6 2 1 4 培养基 4 6 2 1 4 1l b 培养基 4 6 2 1 4 2 巴斯德毕赤酵母生长培养基 4 7 2 1 5 主要仪器与设备 4 7 2 2 试验方法 4 7 2 2 1 巴斯德毕赤酵母的培养 4 7 2 2 2 从巴斯德毕赤酵母中提取基因组d n a 4 7 2 2 3 提取基因组d n a 的纯化 4 7 2 2 4p c r 扩增泛素基因 4 8 2 2 5 纳豆激酶基因 n k 2 的扩增及精制 4 9 2 2 6 纳豆激酶与泛素融合基因 u b i n k 2 的扩增 5 0 2 2 7 纳豆激酶与泛素融合基因基因 u b i n k 2 克隆载体的构建 5 0 2 2 8 重组质粒p m d l 8 删b i n k 2 转化e c o l i j m l 0 9 5 0 3 结果与讨论 5 l 3 i 毕赤酵母基因组d n a 琼脂糖凝胶电泳检测 5 1 3 2p c r 扩增泛素基因 u b i 和纳豆激酶基因 n k 2 5 l v 目录 3 3p c r 扩增纳豆激酶与泛素融合基因 u b i n k 2 5 2 3 4u b i n k 一2 融合基因p c r 产物精制回收 5 2 4 结论 5 3 参考文献 5 4 致谢 5 8 v i 第一章文献综述 第一章文献综述 血栓性疾病是一种常见病 常见的表现形式有心肌梗死 缺血性脑梗死 静脉血 栓栓塞等 血栓性疾病的危害相当大 每年每一千人中就有一到三人发生不同形式的 血栓性疾病 血栓栓塞类疾病严重威胁着人类的生命和健康 据不完全的统计 各种 血栓性疾病已成为许多国家人口死亡和致残的第一位原因 l 其中急性血栓类疾病 如 脑血栓 急性心急梗塞 a m i 的死亡率已达到4 0 以上 溶解血栓是治疗这一类疾病 的重要手段 目前国内外临床应用的溶血栓类药物主要有 链激酶 s t r e p t o k i n a s e s k 尿激酶 u r o k i n a s e u k 组织型纤溶酶原激活齐l j t i s s u et y p ep l a s m i n o g e na c t i v t o r t p a 及 其复合物等 目前 临床上治疗血栓的溶栓药物价格昂贵 并存在不同程度的缺陷 如药效短 副作用大 来源紧缺 造价高 很难成为一种大众药品 2 1 针对血栓性疾病日益增加 而现有药物有较多缺陷的现状 亟待开发一种天然无毒副作用的药物来预防和治疗栓 塞性疾病 开发新型的抗血栓药物已成为当前最重要的研究课题之一 1 1 纳豆激酶 纳豆食品是日本传统的大豆发酵食品 起源于中国 它是利用枯草杆菌 b a c i l l u s s u b t i l i s 的类缘菌 纳豆菌 在一定温度 湿度下对大豆原料进行发酵而成 成熟的纳豆色泽金黄 口味独特 其主要成分除了含有维护人体健康所需的皂苷 素 卵磷脂 叶酸 食物纤维 钙 铁 钾 维生素及多种氨基酸矿物质外 还含有 很多对人体有益的酶 如过氧化物岐化酶 s o d 过氧化氢酶 3 1 因而具有降血压 抗 肿瘤 抗氧化性 溶血栓 抗菌 减少骨质疏松的产生 提高蛋白质消化率 调整肠 第一章文献综述 道功能 防治心脏病等作用一 6 j 1 9 8 0 年 须见教授在美国芝加哥大学进行血栓溶解酶p r o u k 与u k 的构造分析研 究时 无意间发现纳豆食品含有高浓度的血栓溶解成分 1 9 8 7 年 须见教授进一步研 究结果表明 在纳豆发酵过程中 纳豆菌会产生一种丝氨酸蛋白酶 s e r i n ep r o t e i n a s e 经过纯化后 已知其p i 值为8 6 4 0 3 分子量为2 7 7 2 8 是由2 7 5 个氨基酸构成的蛋 白质 其在p h 6 1 2 的范围内具有很强的血纤维蛋i 刍 f i b i m 溶解能力 但环境温度超 过6 0 c 时 活性急速下降 其溶解血栓能力可能超过目前已知的溶血栓药物 因此 将纳豆与尿激酶二者名称加以结合 将纳豆食品中含有的血纤维蛋白溶酶 p l a s m i n 命 名为纳豆激酶 n a t t o k i n a s e n k 1 2 纳豆激酶的生化特性 1 2 1 纳豆激酶的分子结构 1 2 1 1 纳豆激酶的核酸分子结构 1 9 9 2 年 n a k a m u r a 等人 7 利用鸟枪法在大肠杆菌中首次克隆到包括调控序列在内 的n k 的全长基因序列 n k 基因以g t g 为起始密码子 随后是11 4 3 b p 组成的开放阅 读框架 o r e 9 编码信号肽 前肽及成熟肽在内的3 8 1 个氨基酸瞵 9 j 以t m t a g t a a 为终止密码子转录终止序列为 t a a a a a g a a g c a g g t t c c t c c a t a c c t g c t t c t t t t a 其位于成熟蛋白区域c 端下游7 b p 处 s d 序列a a a g g a gf 起 始密码子上游1 7 b p 处 为核糖体结合位点 其在核糖体同m r n a 结合过程中起重要的 作用 终止密码子之后一段序列可形成茎环结构 即p 因子非依赖性终止序y 0 s l o s u i l a mw a n g 等 j 人通过质粒整合与噬菌体p b s l 转导 绘出了与a p r n n 源性很好 的基因印r e 的图谱 并且研究了该基因启动子区域德d n a 序列 同样得出基因在成熟 的酶蛋白序列之前编码了一段有着2 9 个氨基酸序列的信号肽和一段有着7 7 个氨基酸残 基的前导肽 前肽在蛋白质分泌与折叠得过程中起着重要作用 1 2 14 1 并且确定了基因 在b s u b t i l i s 染色体伤得位置 其位于g i y b 和m e t d 之间 他们利用s 1 核酸酶保护试验分 析发现 基因的转录在双元启动子位点启动 下游位点的启动子有一个特有的63 7 识 别序列 t a d a s h iy 等人用双脱氧链终止法测出了另外一个与a p r n 同源性很好的基因 a p r a 的完整序列 启动密码子为g t g m e t 两个t a a 为终止密码子 包括一个1 1 4 3 b p 核苷酸的开放读框 在终止密码子下游的1 1 5 0 和11 8 8 之间 发现了茎 环结构和多聚 2 第一章文献综述 t p o l yt 区域 在开放读框的上游 有两段公认的一3 5 a g t c t t t 和一1 0 g a a t t t c t 序列 1 0 1 2 1 2 纳豆激酶的蛋白质分子结构 n k 是由2 7 5 个氨基酸组成的单链多肽 分子内无二硫键 1 9 9 3 年 须见洋行等 采用反向h p l c 层析法分离出n k 并测定了它的氨基酸序列 与n a d a m u r a 等测定的 核苷酸序列推导出的氨基酸序列完全一致 纯化的n k 分子量为2 7 7 2 8 作为丝氨酸 蛋白酶 n k 的活性中心为a s p 3 2 h i s 和s e r 2 2 1 与底物结合部位在s e r l 2 5 l e u l 2 6 g l y l 2 7 处 8 1 5 n k 的信号肽包含一个带3 个正电荷的亲水n 端以及一段不带电的疏水残基序列 其切割位点位于a i a g l n a l a 保守序列之后 1 列 n k 基因编码序列有一不同于多数原核 基因的特点 即在信号肽和成熟肽之间有一段2 3 1 个核苷酸编码的前肽序列 n k 在分 泌到胞外以前 为无活性的酶原 分泌到胞外后 切割前肽成为有活性的蛋白酶 目前己发 现一些与n k 基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域 比较n k 与 其它几种枯草杆菌蛋白酶发现它们的氨基酸序列有较高的同源性 与枯草杆菌蛋白酶 e s u b t i l i s i ne 的同源性达到9 9 5 与枯草菌蛋白酶 s u b t i l i s i na m y l os a c c h a r i t i c u s 的同 源性达到9 9 3 蜊7 此外 n k 与枯草菌素b p n7 s u b t i l i s i nb p n7 枯草菌素c a r l s b e r g s u b t i l i s i nc a r l s b e r g 在氨基酸组成上同源性亦达8 6 和7 2 1 6 1 2 2纳豆激酶的分离纯化 n k 最初是从纳豆中直接抽提出来 f u j i t a 1 6 1 用含2 m m o l lc a c l 2 生理盐水抽提纳豆 粗酶液力e i x 2 5 硫酸铵沉淀 离心去除杂蛋白 上清液经 b u t y l t o y o p e a r l 柱 其活性组 份用6 0 硫酸铵沉淀而获得粗酶 粗酶液经c m t o y o p e a r l 柱纯化 再用6 0 硫酸铵 沉淀 脱盐冻干得n k 纯品 现在 普遍采用液体发酵法生产纳豆激酶 经离心 盐析 透析 冻干得酶干粉 1 2 3 纳豆激酶的活 i 生测定 1 2 3 1 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法 1 7 1 是最早用于n k 的活性测定方法之一 该方法参照a s t r u p 1 9 5 2 的方法 并进行了一定的改进 1 8 其基本原理是在纤维蛋白原 凝血酶和琼脂糖组成 3 i 第一章文献综述 的平板上 注入梯度浓度的标准尿激酶 u k 以及不同的n k 样品 3 7 c 孵育一定时间 后 测定溶圈大小 与浓度作图 从中计算出n k 活性相当于u k 的单位数 1 2 3 2 凝块溶解时间法 c l t 1 8 1 9 凝块溶解时间法 简称c l t 其基本操作过程是 0 c 下 在小试管中依次加入凝 血酶 硼酸生理盐水缓冲溶液 n k 溶液和纤维蛋白原 强烈搅拌后 置于3 7 c 恒温 水浴 从纤维蛋白形成开始计时 随着反应液混浊 有气泡上升到液面 到气泡冒出 停止 作为纤维蛋白溶解时间 c t l 同样 以标准尿激酶等作为标准品 以c l t 对 n k 浓度的对数作图 测定n k 活性 此法较平板法迅速快捷 有较大的分辨率 适于 粗酶的活性测定 但随着灵敏度的提高 以及同时测定多个样品时 溶解时间的判定 也更加困难 1 2 3 3 四肽底物法 纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶 具有2 7 5 个氨基酸残基 与枯草杆菌蛋白酶同源 性极高 其与枯草杆菌蛋白酶e 只有两个氨基酸的差异 而且 n k 与枯草杆菌蛋白酶 e 的催化中心和结合中心相同 因此有人用测定枯草杆菌蛋白酶e 的方法来测n k 的 活性 1 9 其基本方法是 在四肽底物s u e a l a a l a p r o p h e p y a 溶液中加入n k 酶液 在3 7 水浴中孵育l m i m 测定单位时间内4 1 0 n m 处光吸收的变化 n k 活性定义为l m i n 水解s u c a a p f p n a 时生成1hl 硝基苯胺的n k 量为l u 四肽底物法简便易行 可 迅速测定酶的活性 缺点是该方法所得到的蛋白酶活性并不能完全表示其纤溶活性 1 9 1 2 3 4 血清板法 血清平板法的原理是 纤维形成初始 在6 5 5 n m 处存在最大光吸收 随着n k 的 加入纤维溶解 从而吸光度值降低 试验发现 吸光度的减少同n k 的浓度成线性关 系 血清平板法是在纤维平板法基础上的改进 2 0 1 将血清板制成微型纤维平板 然后 在每个孔内加入不同浓度的标准n k 反应开始4 h 内 每3 0 m i n 测定一次o d 6 5 5 值 作出吸光度的减少同n k 浓度的线性关系图 此方法可以同时测多个样品 简便 快 捷 成本低廉 可信度高 1 2 3 5 三明治式酶联免疫吸附法 el i s a 4 第一章文献综述 此方法是以对n k 有特异性的单克隆抗体与n k 发生特异结合 然后再同连有标 志酶的多克隆抗体结合 形成一种类似三明治的结构 通过标志酶 即过氧化物的 反应而测定n k 的活性 其基本操作是 将n k 的单克隆抗体吸附在微孔板上 用b s a p b s 冲洗 并封堵 未被吸附的部位 加入n k 与单克隆抗体结合 孵育2 h 后 再加入连有过氧化氢酶的 多克隆抗体与二者结合 然后加入新配制的底物 孵育1 0 m i n 后 加入2 m o l l 硫酸测 定4 9 0 n m 下的吸光值 i8 1 此方法灵敏度高 特异性强 但是操作复杂 成本高 1 2 4纳豆激酶的酶学特性 1 2 4 1 纳豆激酶的热稳定性及最适反应温度 1 5 1 8 2 1 纳豆激酶在p h 7 1 2 条件下 温度低于4 5 时 活性相对稳定 温度4 0 下 3 0 m i n 内没有酶活性丧失 3 7 v 以下贮存稳定 3 h 内酶活无明显变化 2 4 h 后残余酶活 仍在9 5 以上 温度6 0 c 以上 酶则迅速失活 但反复冻融五次 酶活性仍可保留9 5 1 2 4 2 纳豆激酶的p h 稳定性及最适p h 室温下 在p h 4 1 2 范围内 n k 活性稳定 p h 7 9 范围内酶活性最为稳定 2 4 h 残余酶活均保持在9 5 以上 p h 6 3 一1 0 8 范围内 其活性可持续近4 0 d 之久 2 2 1 1 1 3 纳豆激酶的生物活性 1 3 1纳豆激酶的酰胺水解活性 n k 是一种丝氨酸蛋白酶 其酰胺水解活性可以通过人工合成的小分子短肽作为底 物来进行研究 s u m i 将n k 对纤溶酶底物s 2 2 51 尿激酶底物s 2 4 4 4 弹性蛋白酶底 物s 2 4 8 4 凝血酶底物随 2 2 3 8 激态释放酶底物s 2 3 0 2 等的水解活性进行了比较 发现对n k 最敏感的底物为血浆纤溶酶底物s 2 2 5 1 h d v a l l e u k s p n a f u i i t i a 1 6 测定了n k 对枯草菌素和胰凝乳蛋白酶及纤溶酶底物的动力学参数 结果表明 n k 的 最适底物是枯草菌素的底物s u c a l a a l a p r o p h e p n a 从而说明了纳豆激酶是一种类 似枯草菌素的蛋白酶 n k 是第一种类似枯草菌素而有纤溶活性的蛋白酶 以氧化型胰 岛素b 链为底物 研究n k 的酶切特性发现 n k 具有严格的限制性酶切特点 其首选 5 第一章文献综述 酶切位点在l e u l 5 t y r l 6 其次在s e r 9 h i s l 0 与其他一些枯草菌素不同 n k 对氧化 型胰岛素b 链的c 端t y r l 0 0 a l a 3 0 之间肽段无任何酶切作用特性 2 2 1 1 3 2纳豆激酶的纤溶活性 n k 最为引入注目的生物学功能是其强烈的纤溶活性 s u m i 用纤维蛋白平板法测 定n k 的活性 1 9 湿重纳豆中提取的n k 活性相当于4 0 c u 纤溶酶或1 6 0 0 i u 尿激酶 用三明治酶联免疫吸附法测定n k 活性 结果表明n k 为纳豆中唯一有纤溶作用的蛋 白水解酶 但最近报道显示 由于菌株或生产工艺不同 纳豆生产过程中 产物中还 存在尿激酶 弹性蛋白酶 以及尿激酶原激活剂等 2 3 2 5 1 1 4 纳豆激酶的溶栓机理 1 4 1 血栓的形成 v i r c h o w 曾经提出血栓形成的3 要素理论 即血管壁异常 血流异常 血液成分改 变 所谓血管壁异常 主要指的是由于物理的 如外科手术 放射线 电刺激等 化 学的 如尼古丁 药物等 和生物的因素 动脉粥样硬化斑块 细菌等 引起血管内 皮细胞的损伤 从而降低了血管内皮细胞固有的对血小板的调节作用 抗凝作用和纤 溶作用 血流异常 主要指血液黏度的改变 以及由于血管变窄 弯盐等引起血流速 度和切变力的改变 造成局部的湍流 使血小板易在局部沉积 所谓血液成分的改变 则涉及体内的凝血和抗凝血系统 纤溶和抗纤溶系统中的各种因子 以及血小板等 正常情况下人体内存在一套非常完善的凝血与抗凝的平衡体系 血管壁本身就有 有很强的抗凝作用 它的一种结构蛋白称血栓调理蛋白 可以激活蛋白c 灭活活化 的v 因子和v i i i 因子 从而抑制了血栓形成的加强途径 另外 血管壁表面还有丰富 的组织因子途径抑制物 可以抑制组织因子和活化的i x 因子所形成的复合物 血管壁 表面产生的类肝素物质 也有很强的抗凝作用 一旦血小板或凝血因子活化 激活了 凝血途径 纤维蛋白原活化 纤维蛋白交联产物形成 还可有纤溶酶原活化生成纤溶 酶 溶解纤维蛋白 从而起到抗凝作用 抗凝和纤维蛋白溶解过程也有自发的抑制机 制 使之不致因过亢而引发出血 在病理情况下 特别是血管壁出问题时 就会有凝 血与抗凝的失衡 导致向柃形成 6 第一章文献综述 1 4 2 纳豆激酶的溶血栓机制 人和哺乳动物体内都存在类似平衡调节器的纤溶系统 由体内的纤溶作用和抗纤 溶作用来保持这种平衡 以避免失衡导致疾病的发生 纤溶作用是纤溶酶原参与的众 多生理和病理过程的基础 纤溶酶原是纤溶系统的重要成分 在纤溶系统中 纤溶的 底物为纤维蛋白 而纤维蛋白的前体为可溶性的纤维蛋白原 它在凝血酶的催化作用 下形成纤维蛋白 在纤溶系统的平衡中纤溶酶原激活剂与激活剂的抑制因子起着关键的调控作用 在人体内的t p a 和u p a 与p a i l 和a 2 a p 即为这类因子 根据研究发现纳豆激酶具有纤 溶酶的直接降解血栓 交联纤维蛋白 的作用外 还可激活和转化p r o u k 成尿激酶起到 间接溶栓作用 同时纳豆激酶还可促进血管内皮细胞产生内源t p a t p a 催化纤溶酶原 转变成纤溶酶 以使积累的纤维蛋白或血栓溶解 最近的研究发现 2 酬 纳豆激酶表现 出水解p a i l 纤溶酶原激活剂抑制剂的重要作用 p a i l 主要在调控纤溶系统功能时 水 解t p a 使其失去激活作用 减少纤溶酶原被激活成纤溶酶的量 因此使溶解活性变小 正是纳豆激酶的这种作用 使p a i l 失活 保证t p a 功能增加 使纤溶酶原被激活成纤 溶酶 加速血栓的溶解 由此可见 纳豆激酶作为溶栓制剂存在以下几种机制溶解血 栓具体作用机制如下 1 4 2 1 纳豆激酶的直接溶栓作用 最初纳豆激酶的溶栓作用是须见洋行博士通过发现纳豆中的纳豆激酶能溶解纤维 蛋白而发现 这种溶解纤维蛋白的作用机制 是纳豆激酶作为一种丝氨酸蛋白 它本 身具有水解纤维蛋白的作用 而且 纳豆激酶具有严格的限制性酶切位点 其主要酶 切位点在l e n y y r 之间 其次在s e r h i s 位点间 较微弱水解g l u h i s 和h i s l e n 位点 2 7 因此可直接作用于交联纤维蛋白血栓的上述氨基酸位点 使纤维蛋白水解成可溶性小 分子 达到溶解血栓的目的 f u j i t a 等 2 8 曾对纳豆激酶降解人纤维蛋白原交联纤维进行 深入的研究 发现纳豆激酶在不同时间降解交联纤维蛋白的片段大小不同 主要带为 1 7 5 k d 和11 0 k d 随着纳豆激酶与纤维蛋白反应时间延长 其降解产物中出现1 4 3 k d 3 6 k d 和4 1 k d 等不同大小片段 从而表明纳豆激酶的直接降解血栓作用 1 4 2 2 刺激血管内皮细胞产生内源性t p a 组织型纤溶酶原激活剂 t p a 在体内纤溶系统的调控中起着重要作用陟 1 1 t p a 7 第一章文献综述 已经成为极为重要的临床药物 当人口服纳豆激酶之后 定时取血 然后用e l i s a 检 测法 测定不同时间内血液中t p a 含量的变化 测定结果表明 血液中t p a 含量随着 时间变化而发生从低到高 然后从高至低的变化 在正常情况下 体内t p a 量约为6 7 n g m l 但在口服纳豆激酶后4 h 其血液中t p a 的含量可增加到1 0 n g m l 以上 3 引 由 此可见 口服纳豆激酶吸收到血液中 然后刺激血管内皮细胞产生内源t p a 增加t p a 含量 由t p a 激活纤溶酶原产生新的纤溶酶 溶解血栓起到溶栓治疗作用 这是纳豆 激酶能有效地溶解血栓的机制之一 1 4 2 3 激活体内尿激酶原转变为尿激酶 须见洋行教授等研究发现 纳豆激酶可激活体内尿激酶原 p r o u r o k i n a s e 转变为尿 激酶 2 6 尿激酶是第一代溶栓剂 普遍用于各种血栓病治疗中 尿激酶也是一种纤溶 酶原激活剂 激活纤溶酶原产生纤溶酶 从而增加内源纤溶酶 增加体内溶栓作用 体外用n k 激活尿激酶原转变尿激酶 水解四肽的纤溶酶底物 依时间延长水解底物 量增大 在9 0 m i n 后逐渐下降 这就表明纳豆激酶具有激活尿激酶原产生尿激酶 参 与纤溶过程 1 4 2 4 通过降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂 p a l 1 调控纤溶作用 日本学者发现 他们发现纳豆激酶在体外具有降解和失活纤溶酶原激鼢i j t p a 的 抑制剂p a l l 的作用 p a i l 是体内调控纤溶系统平衡的主要因子 它通过降解t p a 来调 节体内纤溶酶原被激活为纤溶酶的作用 现在发现纳豆激酶有降解和失活p a i l 的作用 所以认为这种通过纳豆激酶降解和失活p a i l 的功能 可以调控p a i l t p a 和纤溶酶与纤 维蛋白的平衡关系 改变体内的溶栓作用 已经发现几种有活性的凝血因子 包括x i a 因子 钙结合因子x a 和凝血酶等均能 与p a i l 反应并使p a i l 失去活性 这是众所周知的调控凝血作用和纤溶作用之间的一 种平衡 而且也证明 纳豆激酶降解和失活p a i l 是特异现象 所以提出这种作用为纳 豆激酶具有很强的溶栓作用的一种新的作用机制 3 3 1 4 3 纳豆激酶作溶栓药物的优点 1 6 2 8 3 1 3 4 1 来源于食品 安全性能好 2 分子量小 是一 个 单链蛋白质 可能更易被人体消化吸收 3 可由消化道吸收 因此有成为口服性药物的可能 8 第一章文献综述 4 n k 对纤维蛋白的作用机制不同于u k 等现用于临床的药物 g n f f n n 样直 接作用于纤维蛋白 同时可以激活体内的t p a 5 可以用细菌进行液体发酵生产 造价低廉 1 5 纳豆激酶的药理学研究 n k 的一个显著功能便是具有溶解血栓的作用 m i t s u g u f 3 5 等人用血凝块溶解分 析法测定了n k 的纤溶活性 将之同p l a s m i n 比较 发现n k 的纤溶活性是p l a s m i n 的4 倍 m i t s u g u f 3 6 将n k 通过静脉注射到经化学诱导合成的血栓模型时 发现有明显的血 栓溶解 并且显示出比纤溶酶和弹性蛋白酶更高的纤溶能力 上述研究表明n k 无论是 在体外还是在体内 都表现出强的纤溶活性 1 5 1 体外溶栓作用 纳豆激酶的体外溶栓作用十分明显 最初是通过将n k 酶液滴加到纤维蛋白原平 板上 发现有明显的溶圈 从而认定n k 具有水解纤维蛋白的功能 对n k 体外溶栓 作用的研究 表明 n k 的抗凝不能被凝血酶原酶所校正 1 5 2 体内溶栓作用 经小鼠十二指肠内给药 3 5 h 即刻检测出n k 并产生纤溶效果 表明n k 可以由消 化道吸收到血液中而起溶血栓作用l l 引 此外 通过动物血栓模型研究nk 的溶栓活性 发现nk 不仅抑制血栓的形成 同时还有很强的溶栓作用 并在一定范围内呈量效关系 健康人口服n k 后1 8 d 血浆优球蛋白纤溶活性 e f a 逐渐升高 在第8 d 达到峰值 同 时伴随血浆纤维蛋白降解产物 f d p 增高 血浆t p a 水平亦有明显提高 血浆t p a 水平增高可维持8 d 3 0 j 1 6 具有溶栓作用的酶 1 1 6 1 链激酶 s t r e p t o k in a s e s k 链激酶是在 9 3 3 年由t i l l e t 和g a r n e r 首先在多株链球菌的培养液中发现的 也是 最先用于临床治疗的溶栓药 其由4 1 5 个氨基酸组成 分子质量为4 7 k u 等电点为5 5 9 第一章文献综述 6 0 蛋白比活为1 0 0 0 0 0 u m g 体内半衰期为2 0 m i n 最初的药物是从b 溶血性链球 菌的培养液中提取的 且制品中残存的溶血素对心肌和肝脏有一定的损害 以后改用 基因工程技术在大肠杆菌中表达的重组链激酶避免了该危害 链激酶是一种非酶性单链蛋白 本身不能激活纤溶酶原 它的激活机制是间接的 即先要与纤溶酶原以1 l 的比例结合成链激酶 纤溶酶原复合物 此时的复合物才能 激活在纤维蛋白表面的或游离在血液中的纤溶酶原 使之形成纤溶酶 溶解纤维蛋白 该复合物的催化作用很快 由于他对结合于纤维蛋白和游离的纤溶酶原的激活作用无 选择性 因此在溶栓的同时 干扰了正常的凝血机制 同时由于它是一种异性蛋白 对人体有免疫原性 可引起过敏反应 1 6 2 尿激酶 u r o k i n a s e u k 尿激酶是继链激酶后第一个从人体内发现 以后由p l o u g 等从人尿肾细胞的培养 液中提取的溶栓药 尿激酶是一种双链的丝氨酸酶 有高分子尿激酶和低分子尿激酶 两种 高分子尿激酶由4 1 0 个氨基酸组成 分子质量为5 4 k u 其a 链含1 5 7 个氨基酸 b 链含2 5 3 个氨基酸 丝氨酸酶活性在b 链 a 链不稳定 可自溶裂解成各种小片段 当在l v s l 3 5 t y s l 3 6 出裂解时就形成低分子尿激酶 含2 7 6 个氨基酸 分子质量3 2 k u 市场上的尿激酶常常是高分子和的分子尿激酶的混合物 它们的溶栓特性是一样 的 催化作用是直接的 且作用较慢 体内半衰期7 1 8 m i n 只是前者主要激活的是 谷氨酸纤溶酶 后者主要激活赖氨酸纤溶酶 由于尿激酶对纤维蛋白也无选择性 因 此在溶栓同时对全身纤溶系统也有很大影响 容易引起出血等不良反应 1 6 3 组织型纤溶酶原激活剂 t is s u et y p ep i a s m i n o g e na c t iv a t o r t p a 组织型纤溶酶原激活剂及其抑制物 p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r 1 p a i 一1 是纤 溶系统的两个重要组成部分 t p a 可使纤溶酶原转化为纤溶酶 p a l 1 能够调节t p a 活 性 两者共同作用调节纤溶过程 38 1 血浆中纤溶酶原激活物 p a 按其免疫特性分为两类 一类与尿激酶抗原性相似 称为u k 型p a u p a 另一类则与心脏 子宫 肺等组织中的p a 相似 称为t p a 血管内皮细胞 v e c 是形成释放t p a 的重要场所 t p a 是一种丝氨酸蛋白酶 呈单链 分子量6 6 4 7 2 k d 与其它丝氨酸蛋白酶一样 t p a 由3 个具有活性的氨基酸 它对纤 溶酶原的a r g v a l 肽键有特异性裂解作用 使单链的纤溶酶原转化为纤溶酶 从而引起 1 0 第一章文献综述 纤维蛋白溶解 t p a 是继链激酶和尿激酶之后属于第二代溶栓药 与第一代溶栓药相比 较 其优点在于对血栓的特异性溶栓作用 t p a 也是f d a 迄今为止批准的惟一的一个 可用于治疗脑梗死的溶栓药 1 6 4 乙酰化纤溶酶原链激酶复合物 1 9 8 1 年 s m i t h 等用化学修饰的方法在链激酶的活性中心丝氨酸加了一个甲氧苯 甲酰基 体外试验结果表明提高了其对纤维蛋白结合的选择性 而在体内选择性完全 丧失 需要去酰基后才能发挥作用 因此 其特性完全与链激酶 纤维蛋白原复合物一 样 惟一的优点是由于在作用前需增加去酰基的时间 延长了它在体内的半衰期至9 0 1 1 0 m i n 临床应用价格较贵 实际上使用较少 1 6 5 葡激酶 s t a p h y i o k i n a s e 葡激酶和链激酶一样 本身没有溶酶活性 需与溶酶原形成葡激酶 纤溶酶原复合 物才有溶纤作用 体外溶纤模型试验结果表明它有非常明显的对纤维蛋白的选择性 且葡激酶的溶栓机制依赖于血栓中的纤维蛋白 由于该药可引起抗体的产生 而且滴 度较高 故进来不少学者正在设法对基因进行改构 使降低其免疫原性 1 6 6 单链尿型纤溶酶原激活剂 尿激酶原 p r o u r o kin a s e p r o u k 尿激酶原是尿激酶的的前体 天然的或由动物细胞表达的p r o u k 是由4 1 1 个氨基 酸组成的双链糖蛋白 分子质量为5 0 5 4 k u 差异来源于糖基化的水平 它是一种碱 性蛋白质 等电点为8 9 9 0 5 它与尿激酶有同样的抗原决定簇 可与尿激酶抗体起 反应 但是二异丙基氟磷酸 d f p 不能使它失活 而可使双链尿激酶失活 在液体 条件下很不稳定 与u k 一样也会自动分解 必须及时冻干 1 6 7 溶纤酶 f i b r o i a s e 溶纤酶原先是从铜头蝮蛇 a g k i s t r o d o nc o n t o r t r i xc o n t o r t r i x 毒液中提取的 是由 2 0 3 个氨基酸组成单链多肽 分子量为2 2 8 9 1 u 现在已由基因工程构建的酵母菌生产 它的溶栓机制不依靠纤溶酶原 而是直接降解纤维蛋白的q 链和b 链 由于它同时可 降解纤维蛋白原 因此容易引起出血 此外它也是一种异性蛋白 也可引起免疫反应 第一章文献综述 1 6 8 纳豆激酶 n a t t o k i n a s e n k 纳豆激酶是一种新型的溶栓药 最初是从食品纳豆中提取的 它是一个有2 7 5 个 氨基酸组成的单链多肽 分子量为2 7 7 2 8 u 等电点为8 6 由于分子量小 可经口服吸 收 而且维持时间长 它的溶栓机制类同于溶纤酶 直接作用于纤维蛋白 同时还可 促进组织内t p a 的合成 现在正在进行中试研究 1 7 纳豆激酶的基因工程技术应用 应用重组d n a 技术获得目的基因和表达产物已成为一种有效的技术手段 n a d a m u r a 等对纳豆激酶基因的核苷酸序列测定使得用基因工程技术提高纳豆激酶活性 及产量成为可能 3 9 n a d a m u r a 等人将鸟枪法得到的n k 基因克隆到质粒p u c l1 9 上 再将连接物转化e c o l ih b l 0 1 受体 所选质粒具有氨苄青霉素抗性 经筛选得到重组 质粒 发酵研究结果表明基因工程菌具有胞外蛋白酶活性 但没有检测到其溶栓活性 y o s h i m o t ot 4 0 等人利用穿梭质粒载体p h y 3 0 0 p l k 克隆a p r a 得到重组质粒p t h l 在e c o l ir r l 受体中扩增重组质粒 然后再将此重组质粒转化到四种不同的枯草芽孢 杆菌 i s w l 2 1 4 m 1 111 i a 5 1 0 i a 2 7 4 中 试验结果表明转化菌株 i s w l 2 1 4 p t h l 的蛋白水解酶产率比宿主菌和基因供给菌分别提高2 0 倍和4 倍 m a r k l 4 0 等人将目 的基因克隆到穿梭载体p b s 4 2 上 转入e c o l i 中扩增重组质粒 然后将扩增的重组质 粒转化枯草杆菌 经表达测定其丝氨酸蛋白酶活性是野生型的5 倍 并且该酶能够直 接分泌到细胞外 1 8 纳豆激酶的研究现状及开发前景 日本是最先发现和提取到纳豆激酶的国家 铃木英