（遗传学专业论文）蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究.pdf

复旦大学博十学位论文蝴蝶兰查尔酮台酶基因家族成员分了进化和差异表达调控的研究 中文摘要 蝴蝶兰 p h a a e n o p s i sh y b r i d a 原产于亚洲热带地区 具有很高的观赏价值 和经济价值 类黄酮类色素是植物主要的花色素 而且在其它许多生物功能中发 挥作用 如防紫外照射 植物一一微生物间的相互作用以及雄性育性 查尔酮合 酶 c h a l c o n es y n t h a s e c h s e c 2 3 1 7 4 是类黄酮合成途径的关键酶 催化 一分子的香豆酰c o a 与三分子的丙二酰c o a 缩合生成4 5 7 三羟基黄烷酮 n a r i g e n i nc h a l c o n e 是类黄酮合成的限速酶 本研究利用一系列p c r 方法克隆到3 个新的蝴蝶兰查尔酮合酶基因 将它们 分别命名为p h c h s 墨p h c h s 4 和p h c h s 5 0 首先 利用r t p a r 方法克隆到p h c h s 3 和p h c h s 5 的c d n a 片段 利用常规p a r 方法分离到肋c h s 4 的d n a 片段 然后根 据每个基因己知区域的序列设计反式p e r 引物 进行反式p a r 得到全长基因 p h c h s 3 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o a y 9 5 4 5 1 5 包含有一个长为11 7 3 b p 的开放 读框 在保守的第6 0 位氨基酸 半胱氨酸 密码子的第一个和第二个核苷酸之 间存在一个长为1 0 3 b p 的内含子 其编码的蛋白与其它物种的c h s 有6 1 6 5 的同源性 并且包含了大部分c h s 保守的活性位点 我们还得到了该基因6 8 4 b p 5 非翻译区序列 在助曲妇的启动子区存在许多c h s 基因特有的顺式作用元件 如g b o x w b o x p b o x 和t a c p y a tm o t if 等 p h c h s 4 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o a y 8 2 5 5 0 2 包含有一个长为l1 7 3 b p 的开放 读框 在保守的第6 0 位氨基酸 半胱氨酸 密码子的第一个和第二个核苷酸之 间存在一个长为1 0 9b p 的内含子 该基因编码由3 9 0 个氨基酸组成的蛋白质 该蛋白包含大部分c h s 保守的活性氨基酸 与其它物种的c h s 有6 1 6 5 的同 源性 我们还得到了其6 1 8b p5 非翻译区序列 在肋e h s 4 启动子区发现了多 种参与c i s 基因表达调控的顺式作用元件 p h c h s 5 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o d q 0 8 9 6 5 2 包含有一个长为11 8 5b p 的开 放读框 在保守的第6 1 位氨基酸 半胱氨酸 密码子的第一个和第二个核苷酸 之间存在一个长为1 5 9b p 的内含子 不管在核苷酸水平还是氨基酸水平 p h c h s 5 与其它兰科植物和其它科属植物c h s 的同源程度高于与已知的蝴蝶兰c h s 序列之 间的同源程度 s o u t h e r n 杂交表明 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族至少由4 个成员组成 同源进化分析表明 兰科c h s 基因在蝴蝶兰 石斛兰和b r o m o h e a d i a 三个 复旦大学博士学位论文蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 属形成以前就已经分歧为两个亚家族 p h c h s 5 属于缓慢进化的一支 p h c h s 3 和 p h c h s 4 属于加速进化的一支 蛋白序列同源比较表明 许多c h s 活性必须的氨 基酸残基在加速进化的一支中不存在 以半定量r t p c r 方法对三个蝴蝶兰c h s 基因在处于不同发育阶段的不同花器 官中的表达进行了鉴定 p h c h s 5 是花器官中表达最强的基因 它特异的在花色 素积累时期的花瓣和唇瓣中表达 阶段1 至4 p h c h s 5 在花瓣中最高水平的表 达发生在阶段3 和4 这一时期 花色素在该组织中的积累速度最快 p h c h s 3 和p h c h s 4 在花器官中的表达水平较p h c h s 5 低 肋幽妇在发育早中期的着色的 花被中表达 也在发育晚期无色的生殖器官中表达 与p h c h s 5 相似 p h c h s 4 仅 在花瓣和唇瓣中表达 它在早期的花瓣 阶段卜3 和晚期的唇瓣中微量表达 阶 段4 上述结果为蝴蝶兰单个c h s 基因的差异表达提供了新的事实依据 对p h c h s 5 在不同蝴蝶兰花色品种中的表达进行鉴定分析 结果进一步证明 该基因特异的在花瓣和唇瓣中表达 其表达水平明显与组织中花色素积累水平一 致 它在 紫红 品系 紫红花瓣 花瓣中的表达水平大大高于 黄花红唇 黄 色花瓣 和 白花黄唇 白色花瓣 花瓣中的水平 以p h c h s 3 的外显子2 序列作为目的基因转化烟草可以使转基因植物的花瓣 颜色加深 这些数据证实了肋曲妇在花色素合成中的功能 为过量表达蝴蝶兰 c h s 基因来进行其它植物的花色改良奠定了理论基础 关键词 查尔酮合酶 蝴蝶兰 类黄酮和花色素 表达 反式p c r 基因家族 系统进化分析 分子进化 转基因烟草 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 a b s t r a c t p h a l a e n o p s i s n a t i v et ot r o p i c a la s i a a r ea m o n gt h em o s tr e w a r d i n go r c h i d st o g r o w f l a v o n o i d sa r et h em a j o rf l o w e rp i g m e n t si np l a n t sa n dp l a yi m p o r t a n tr o l e si n m a n yo t h e rb i o l o g i c a lf u n c t i o n s i n c l u d i n gs e r v i n gf o ru vp r o t e c t i o n p l a n t m i c r o b e i n t e r a c t i o na n dm a l ef e r t i l i t y c h a l c o n es y n t h a s e c h s e c 2 3 1 7 4 i st h ek e y e n z y m ei nf l a v o n o i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y w h i c hc a t a l y s e st h ec o n d e n s a t i o no ft h r e e a c e t a t er e s i d u e sf r o mm a l o n y l c o aw i t h4 c o u m a r o y l c o at of o r mn a r i n g e n i n c h a l c o n e i nt h i ss t u d y t h r e en o v e lg e n e se n c o d i n gp h a l a e n o p s i sc h a l c o n es y n t h a s ew e r e i s o l a t e db yas e r i e so fp c ra m p l i f i c a t i o n s t h e yw e r ed e s i g n a t e da sp h c h s 3 p h c h s 4 a n d p h c h s 5 r e s p e c t i v e l y f i r s t l y t h ee d n af r a g m e n to f p h c h s 3a n d p h c h s 5 a sw e l la s d n af r a g m e n to fp h c h s 4w e r ei s o l a t e db yr t p c ro rr o u t i n ep c r t oo b t a i n f u l l l e n g t hg e n e i n v e r s ep c rw e r ep e r f o r m e du s i n gp r i m e r st h a td e s i g n e da c c o r d i n g t ot h es e q u e n c e so f k n o w n r e g i o n so f i n d i v i d u a lg e n e s p h c h s 3 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o a y 9 5 4 5 15 c o n t a i n e da i lo p e nr e a d i n gf r a m e o f1 1 7 3b pd i s r u p t e db yo n e1 0 3 b pi n t r o n w h i c hw a sl o c a t e da tt h ec o n s e r v e ds i t e i e b e t w e e nt h ef i r s ta n dt h es e c o n dn u c l e o t i d eo f t h ec o n s e r v e dc y s t e i nc o d o n c h s p r o t e i np r e d i c t e df r o mp h c h s 3s h o w e d6 1 6 5 i d e n t i t i e sw i t l lc h so fo t h e rp l a n t s p e c i e sa n dr e t a i n e dm o s to ft h ec o n s e r v e dr e s i d u e s 6 8 4 b p5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n w e r eo b t a i n e d a n ds o m ep u t a t i v ec i s e l e m e n t sc h a r a c t e r i s t i co fc h sg e n e i n c l u d i n g g b o x w b o x p b o xa n dt a c p y a tm o t i f w e r ef o u n da tt h ep r o m o t e rr e g i o no f p h c h s 3 p h c h s 4 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o a y 8 2 5 5 0 2 a l s oc o n t a i n e da ni n t a c to p e n r e a d i n gf r a m eo f117 3b p 衍t 1 1o n e10 9b pi n t r o na tt h ec o n s e r v e ds i t e t h ed e d u c e d p o l y p e p t i d e p h c h s 4 f r o mp h c h s 4c o m p r i s e d3 9 0a m i n oa c i d s w h i c hs h o w e d 6 1 6 5 i d e n t i t i e sw i t hc h sf r o mo t h e rp l a n t sa n dr e t a i n e dm o s to ft h ec o n s e r v e d r e s i d u e s s o m ep u t a t i v ec i s r e g u l a t o r ye l e m e n t sr e s p o n s i b l ef o rf l e x i b l er e g u l a t i o no f p l a n tc h sg e n e sw e r ep r e s e n ta tt h e5 a n d3 f l a n k i n gr e g i o no f p h c h s 4 p h c h s 5 g e n e b a n ka c c e s s i o nn o d q 0 8 9 6 5 2 c o n t a i n e da no p e nr e a d i n gf r a l n e o f118 5 b pw i t l lo n e15 9b pi n t r o na tt h ec o n s e r v e ds i t e p h c h s 5s h o w e dh i g h e r i d e n t i t yw i t hc h sg e n e sf r o mo t h e ro r c h i dp l a n t sa n do t h e rp l a n tf a m i l i e st h a nw i t h p h a l a e n o p s i sc h s so nb o t hn u c l e o t i d ea n da m i n oa c i dl e v e l s s o u t h e r nb l o ta n a l y s i sp r e d i c t e da tl e a s tf o u rc h s l i k eg e n e si n d i c a t i n gt h e 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 p r e s e n c eo f as m a l lm u l t i g e n ef a m i l yi np h a l a e n o p s i s t h ei n f e r r e dp h y l o g e n yo ft h ec h sg e n e so fp h a l a e n o p s i sw i t ho t h e rt w oo r c h i d p l a n t s b r o m o h e a d i af i n l a y s o n i a n aa n dd e n d r o b i u mh y b r i d s u g g e s t e dt h a to r c h i d c h sg e n e sh a v ed i v e r g e di n t ot w os u b f a m i l i e sb e f o r ed i v e r g e n c eo ft h e s et h r e e g e n e r a p h c h s 5b e l o n g e dt ot h eb r a n c h w h i c hi ss l o w l ye v o l v e d p h c h s 3a n dp h c h s 4 b e l o n g e dt o t h eo t h e rb r a n c h w h i c hi se v o l v e di na c c e l e r a t e dr a t e a m i n oa c i d s e q u e n c ec o m p a r i s o nb e t w e e no r c h i dc h s si n d i c a t e dt h a ts e v e r a la m i n oa c i d s w h i c h a r ei n d i s p e n s a b l ef o rc h se n z y m ea c t i v i t y a r ea b s e n ti ns e q u e n c e so ff a s te v o l v e d r e l a t i v e l yq u a n t i t a t i v er t p c ra n a l y s i si d e n t i f i e de x p r e s s i o np a t t e m so ft h e s e t h r e ec h sg e n e si nd i f f e r e n tf l o r a lt i s s u e sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s p h c h s 5 w a st h em o s ta b u n d a n t l ye x p r e s s e dc h sg e n ei n f l o r a lo r g a n sa n di tw a ss p e c i a l l y t r a n s c r i b e di np e t a la n dl i pa tt h es t a g e sw h e na n t h o c y a n i na c c u m u l a t e d s t a g e lt o4 t h ep e a kl e v e lo fp h c h s 5m r n aw a si np e t a lt i s s u ea ts t a g e 3t o4w h e nt h e a n t h o c y a n i nw a sa c c u m u l a t e da tt h eh i 曲e s tr a t e p h c h s 5i se v i d e n t l yt h es o l ec h s g e n er e s p o n s i b l ef o r t h ea c c u m u l a t i o no f p i g m e n ti np e t a l s p h c h s 3a n dp h c h s 4w e r e e x p r e s s e da tm u c hl o w e rl e v e l st h a np h c h s 5 p h c h s 3w a se x p r e s s e di np i g m e n t e d t e p a lt i s s u e i n c l u d i n gl i p p e t a la n ds e p a l a te a r l ya n dm i d d l es t a g e s s t a g e2t o4 a n di nc o l o r l e s sr e p r o d u c t i v et i s s u ea tl a t es t a g e s t a g e5 l i k ep h c h s 5 p h c h s 4w a s a n o t h e rc h sg e n e w h i c hi ss p e c i a l l ye x p r e s s e di np e t a la n dl i p i tw a sw e a k l y e x p r e s s e di np e t a l sa te a r l i e rs t a g e s s t a g e1t o3 a n di nl i p sa tm i d d l es t a g e s t a g e4 t h e s er e s u l t sp r e s e n tn e wd a t ao nd i f f e r e n t i a t i o no fg e n ee x p r e s s i o na m o n gd u p l i c a t e c o p i e so fc h sg e n e si np h a l a e n o p s i s e x p r e s s i o na n a l y s i so fp h c h s 5i nd i f f e r e n tp h a l a e n o p s i sc u l t i v a r sw h os h o w d i f f e r e n tf l o w e rc o l o rt y p ef a r t h e rs u g g e s t e dt h a tp h c h s 5w a ss p e c i a l l ye x p r e s s e di n p e t a la n dl i pt i s s u ea n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fi tw a sa p p a r e n t l yc o n s i s t e n tw i t h a n t h o c y a n i na c c u m u l a t i o n t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp h c h s 5i np e t a lo fm a u w h oh a s m a u v ep e t a l s w a sm u c hh i g h e rt h a nt h o s ei np e t a lo f b o t hy e l w h oh a sy e l l o wp e t a l s a n dw h t w h oh a sw h i t ep e t a l s e x p r e s s i o no fe x o n 2s e q u e n c eo fp h c h s 3i nt o b a c c oc a nl e a dt od a r k e rf l o w e r l i m b st h a nc o n t r o l s t h e s ed a t ac o n f i r mt h ei d e n t i t ya n df u n c t i o no fp h c h s 3a n d f u r t h e rs u g g e s tt h a to v e r e x p r e s s i o no fp h a l a e n o p s i sc h sg e n ec o u l db eu s e dt o m a n i p u l a t ef l o w e rc o l o ro f o t h e rp l a n t s k e yw o r d s c h a l c o n es y n t h a s e p h a l a e n o p s i s f l a v o n o i d sa n da n t h o c y a n i n e x p r e s s i o n i n v e r s ep c r g e n ef a m i l y p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s m o l e c u l a re v o l u t i o n t r a n s g e n i ct o b a c c o 复旦大学博十学位论文 蝴蝶兰查尔酮台酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 第一章查尔酮合酶基因研究进展及其在植物花色改良中 的应用 1 查尔酮合酶基因简介 查尔酮合酶 c h s c h a l c o n es y n t h a s e e c 2 3 1 7 4 催化类黄酮和花色 素合成途径的第一步反应 是类黄酮类物质生物合成途径的限速酶 它催化一 分子的香豆酰c o a c o u m a r y lc o a 与三分子的丙二酰c o a m a l o n y lc o a 缩合生 成4 5 7 三羟基黄烷酮 n a r i g e n i nc h a l c o n e h e l l e r 和h a h l b r o c k 1 9 8 0 类黄酮类物质是广泛存在于高等植物中的次生代谢物质 与植物的花 色 花粉的发育 t a y l o ra n dj o r g e n s e n 1 9 9 2 以及生长素的运输等有关 此 外 类黄酮在植物防御反应中也到起到重要作用 如防u v 辐射 s c h m e l z e r 等 1 9 8 8 真菌侵染 d i x o n1 9 8 6 以及豆科植物根瘤的形成 t a y l o r 和 j o r g e n s e n 1 9 9 2 等 在大多数物种中 c h s 基因以多基因家族形式存在 其 表达受环境和发育的调控 自2 0 世纪7 0 年代中期以来 c h s 基因一直是研究 基因进化与表达调控的模式系统 近年来 大量的c h s 基因序列被克隆得到 到目前为止 从e m b l 数据库中可查到十几个科 包括豆科 茄科 旋花科 十 字花科等 的植物的c h s 基因序列 为研究c h s 基因的分子进化提供了大量依 据 查尔酮合酶的保守性很强 裸子植物与被子植物之间氨基酸序列同源性一 般在6 0 以上 其蛋白序列长约4 0 0 个氨基酸 相对分子质量4 2 1 0 4 以同 源二聚体形式行使催化功能 c h s 富含亮氨酸 可能用于形成亮氨酸拉链 参 与c h s 同源二聚体的形成 c h s 的c 端有一保守区域g f g f l v g w 被称为c h s 标 签 只有极少数序列的w 突变为l v 或者y 根据植物中是否有类黄酮类物质推测 c h s 基因最早出现在苔藓中 s w a i n 1 9 8 6 s t a f f o r d1 9 9 1 c h s 基因与脂肪酸合成酶基因有很高的同源性 二 者可能起源于同一个祖先基因 j e z 等 2 0 0 0 从c h s 基因的结构来看 除 金鱼草 a n t i r r h i n u mm a j u s 的a m c h s 基因含有两个内含子外 s o m m e r 和 s a e d l e r 1 9 8 6 其余的均只有一个内含子 这个内含子的位置在不同的物种 中均相同 位于第6 0 位左右的半胱氨酸密码子内部 介于第一个与第二个碱基 之间 其长度从几十b p 到几个k b 不等 内含子的5 和3 剪接点遵循g t a g 复旦大学博士学位论文蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 规律 外显子1 编码约6 0 个氨基酸 外显子2 编码约3 4 0 个氨基酸 这种极为 一致的基因结构说明 c h s 基因可能起源于一个共同的祖先基因 s o m m e r 和 s a e d l e r 1 9 8 6 金鱼草a m c h s 第一个内含子的位置与其它基因相同 第二个 内含予位于第二个外显子的内部 显然第二个内含子是在金鱼草这一物种形成 后获得的 s o m m e r 和s a e d l e r 1 9 8 6 由于植物查尔酮合酶在花色素合成途径中的关键作用 利用其进行植物转 基因花色改良 成功的改变了转基因植物的花色表型 a i d a 等 2 0 0 0 f u k u s a k i 等 2 0 0 4 在此过程中首先发现了植物中的共抑制和反义抑制现象 v a l ld e rk r o 等 1 9 8 8 此后的十年间陆续对转基因共抑制和反义抑制的 机理进行了深入的研究 v a nd e rk o r l 等 1 9 9 0 李艳等 2 0 0 1 2 植物查尔酮合酶的功能 2 1查尔酮合酶是花色素合成的关键酶 绝大多数虫媒传粉的植物花瓣大且色彩鲜艳 花色影响昆虫的授粉行为 所以植物花色素含量关系到植物有性生殖成功和种族的延续 植物花的颜色主要是由类黄酮和花色素苷参与形成的 花色素苷合成后主 要积累在花瓣的液泡中 其化学结构会受液泡生理状态的影响而改变 从而使 花瓣呈现出不同的颜色 液泡的p h 值及花色素苷与金属离子的相互作用都能导 致花颜色的改变 黄酮醇和黄烷酮虽然没有颜色 但是他们可以通过与花色素 苷形成复合物来影响植物的花色 这种现象叫作共着色 c o p i g m e n t a t i o n 由 于植物的颜色 包括花和果实 易于观察 遗传学科的几个重大突破都与受植 物颜色多变的启发分不开 如以豌豆豆皮颜色作为主要性状 m e n d e l 对普通遗 传学做了科学的阐述 受玉米粒颜色差异的启发 m c c i i n t o c k 发现了自然界 存在的转座元件 近年来发现的共抑制现象同样是在植物花色的研究中发现的 v a nd e rk r o l 等 1 9 8 8 类黄酮是植物合成的一类次生代谢产物 已知化学结构的类黄酮有3 0 0 0 种 并且还在不断发现新的结构 虽然类黄酮种类繁多 但它们有共同的基本 结构 即由两个芳香环 c 6 被一个c 3 单位联接成的1 5 碳化合物 图1 根据c 3 单位氧化程度的不同 类黄酮又分成不同的种类 例如黄酮醇 f l a v o n o l s 黄烷酮 f l a v o n o n e s 异黄酮 i s o f l a v o n o i d s 以及花色 素苷 a n t h o c y a n i n s 这些不同种类的类黄酮在r l r 2 r 3 和r 4 位置又可 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 进一步被修饰 如羟化 甲基化 酰化或糖苷化等 这样 自然界中就产生了 种类繁多的类黄酮 从而形成了五彩缤纷的颜色 h 0 rl 图1 类黄酮的基本结构 f i g 1t h ep r i m a r ys t r u c t u r eo ff l a v o n o i d s 注 r 1 r 2 r 3 和r 4 代表可被修饰的位置 o h r2 类黄酮的生物合成是从查尔酮合酶 c h s 催化一分子的4 一香豆酰c o a 和 三分子的丙二酰c o a 缩合生成苯基苯乙烯酮开始的 d a n g 等 1 9 8 9 v a nd e r m e e r 等 1 9 9 3 香豆酰c o a 是由苯丙氨酸经过三步酶促反应形成的 由于香 豆酰c o a 也是其它多种化合物 如木质素 芪类化合物和香豆素 的合成前 体 所以这三步反应被称为普通苯丙酮途径 丙二酰c o a 源于乙酰c o a 的羧 化 而后者是三羧酸循环的产物 苯基苯乙烯酮生成后 由异构酶催化形成黄 烷酮 以黄烷酮为中心 合成途径产生了许多分支 以合成不同种类的类黄 酮 类黄酮和花色素苷的生物合成途径以及中间产物的生物功能见图2 c h s 催化生成的苯基苯乙烯酮为其它类黄酮的合成提供了基本的c 1 4 骨 架 所以c h s 被认为是类黄酮合成途径的关键酶 复旦人学博j j 学位论义蝴蝶兰查尔酬台酶基 家族成员分子进化和差异表达调控的研究 p a l 古 c 4 h 毒 4 c l 士 c 珏s c h i l i g n i n i l r u c t u r a ls u p p o f l s r i l l m e s 懒n 曲 l l i i d e s b e n 2 0 j ca c i d s 姻k 阵 i f s 毒粼 腑蜘 1 遍衅酋眦越p 越珏t d c 6 日西c f s 翻8 v o l 斟 c 小p 喀m e n b a 矗 毒 盯叼6 t i r t l a n t h o c y a a i n p i g m e n t s u vp r o t e c t i o n 图2 类黄酮合成途径 f i g 2t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo ff l a v o n o i d s 注 本图显示了花色素苷合成所需要的酶和分支途径 p a l 苯丙氨酸裂解酶 c 4 h 香豆酸 4 一羟化酶 4 c l 香豆酸 c o a 连接酶 c h s 查尔酮合酶 c h i 查尔酮异构酶 f 3 h 黄 烷酮3 一羟化酶 f 3 5 h 黄烷酮3 5 一羟化酶 d f r 二氢黄酮醇4 一还原酶 a s 花 色素合成酶 u f 3 g t u d p 一葡糖3 一o 一葡糖基转移酶 在牵牛 i p n m o e ap u r p u r e a 中存在几种花色表型突变体 图3 对这 些突变体进行了十几年的遗传分析研究 将造成不同表型的突变位点定位在4 个区域 e n n o s1 9 8 3 e p p e r s o n1 9 8 8 e p p e r s o nt 9 9 2 包括紫色 a a p p l l w w 深粉色 a a p p i i w w 浅粉色 a a p p l i v n v 白色 a a p p l i w w 以及白色花瓣上局部紫色 a a p p i i w w 和白色花瓣上紫色区域呈辐射状 4 一一k麓僦 一 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮台酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 a a p p i i w w a 位点突变导致花色表型呈白色 h a b u 对稳定的白花和局部紫色 突变体进行遗传分析证明 发现在a 突变体的c h s d 内含子区有一个长为3 9 k b 的新的转座元件插入 命名为t i p l 0 0 h a b u 1 9 9 7 以特异性探针对不同 表型进行n o r t h e r n 杂交 结果表明a 位点代表的基因正是c h s d 基因 d u r b i n 等 2 0 0 0 以上研究表明 正是由于c h s d 的突变造成花色素合成功能的部分 或彻底丧失 从而形成了部分区域白色或完全白花突变体 图3 牵牛花 i p n m o e ap u r p u r e a 的花色表型 f i g 3t h ep h e n o t y p eo fm o r n i n gg l o r yf l o w e r s 注 a 紫色 a a p p i i w w b 深粉色 a a p p i i w l c 浅粉色 m p p i i w w d 白色 a a p p i i w w e 白色花瓣上局部紫色 a l a 午p 1 1 w w f 白色花瓣上紫色区域呈辐射状 m p p ii w w 摘自d u r b i n 等 2 0 0 0 1 9 8 8 年 v a nd e rk r o l 首次报道了转查尔酮合酶基因产生反义抑制的现象 v f l bd e rk r o l 等 1 9 8 8 以反义查尔酮合酶基因转化矮牵牛 p e t u n j a h y b r i d a 造成转基因植株的c h sm r n a 水平和内源c h s 酶活水平下降 转基 因植株花朵的颜色较野生型花朵有明显的改变 少部分植株花瓣局部着色 其 它部位无花色素积累 有一植株花色完全呈白色 以同样的方法转化三色堇 y o r e n i af o u r n i e r i 造成转基因共抑制 或者以r n a 干扰的方法导致三色堇 t o y e n y ah y b r i d a 内源查尔酮合酶活性水平下降 都造成了植物花色素水平 的降低 f u k u s a k i 等 2 0 0 4 a i d a 等 2 0 0 0 复旦大学博士学位论文蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 以上研究从不同的侧面证明 在上述物种中 查尔酮合酶是花色素合成的 关键酶 其活性一经丧失 花色素便停止在细胞中的积累 花色变浅甚至完全 变为白色 2 2查尔酮合酶在植物防御反应中的作用 在对植物查尔酮合酶研究的早期 发现其表达受紫外照射 f r i t z 等 1 9 8 3 和真菌侵染的诱导 r y d e r 等 1 9 8 4 推测查尔酮合酶与植物的抗紫 外辐射和防微生物侵染有关 类黄酮拥有的芳香环结构使其具有很高的紫外吸收系数 暗培养的岩芹悬 浮细胞经u v 辐射会造成1 6 个酶的协同表达 这些酶都与糖基化类黄酮的合成有 关 s c h r o d e r 等 1 9 7 9 作为类黄酮合成途径的关键酶 c h s 是光诱导后表达 量最高的酶 从被辐射的细胞中可以很容易的大量分离到 o k u 等 1 9 7 7 有人 推测在进化初期 类黄酮是陆生植物机体中存在的最古老的滤光器 但是由于 作为u v 滤光器需要较高的浓度 同时早期合成类黄酮的酶的数量不多 所以这 一推测好像又很难解释通 s t a f f o r d 1 9 9 1 认为 在进化早期 类黄酮首先作 为一种化学信号分子完成其生物滤光器的作用 因为这样只需少量就可以完成 这种功能 s t a f f o r d 1 9 9 1 类黄酮作为信号分子的在植物生长素极性运输中 的作用对这种假说是一种补充 b r o w n 等 2 0 0 1 t a y l o r 和 g r o t e w o l d 2 0 0 5 在豆科植物中 类黄酮在根瘤菌 r h y i z o b i u m 的致瘤作用中作为信号分 子 r e d m o n d 等 1 9 8 6 p e t e r s 等 1 9 8 6 r o l f e1 9 8 8 研究表明 正是一种 类黄酮衍生物 7 一羟基一4 一甲氧基异黄酮 7 4 d h f 通过对过氧化物酶活 性的调节来影响根瘤菌侵染过程中生长素的极性分布 促使植物形成根瘤菌 m a t h e s i u s2 0 0 1 其中异黄酮类成员可以作为植物抗毒素 i n g h a m 1 9 8 2 d i x o n1 9 8 6 与此相适应 在植物受到病原菌侵染时 c h s 会被诱导而高效表 达 c h sm r n a 的量在4 h 达到最高点 此时被诱导的样品中的c h sm r n a 含量比 对照样品高1 0 0 倍左右 c r a m e r 等 1 9 8 4 除了作为花色素合成和植物防御反应生物合成途径中的关键酶 查尔酮合 酶还与植物的雄性不育有关 由于黄酮醇的积累过程被阻断 矮牵牛中的突变 体造成花冠和花药的颜色变浅 同时雄性不育 这种突变的表型可以被c h s 转基 因互补 n a p o t i 等 1 9 9 9 6 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮台酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 3 查尔酮合酶基因家族成员的分子进化及其多样性表达的调控 3 1 查尔酮合酶在多数植物中由多基因家族编码 基因冗余是植物基因组的一个基本特征 几乎至今得到的所有植物基因都 由小基因家族组成 除欧芹 h e r r m a n n 等 1 9 8 8 金鱼草 w e i n a n d 等 1 9 8 2 和拟南芥 f e i n b a u m 和a u s u b e l 1 9 8 8 基因组中含有单拷贝c h s 基因 外 迄今鉴定过的所有植物基因组中都含有多拷贝的c h s 基因 m a r t i n 1 9 9 3 在矮牵牛基因组中存在8 1 0 个c h s 基因 k o e s 等 1 9 8 9 在豆科 植物中c h s 基因的拷贝数普遍较高 如在菜豆 p h a s e o l u sv u 地a i s 和豌豆 p i s u ms a t i v o l l l 中均发现了至少8 个c h s 基因 r y d e r 等 1 9 8 7 a n 等 1 9 9 3 基因家族的形成源于基因复制 基因复制形成的新成员必须受正向选择才 能在长期的进化过程中保持自身的存在 否则 伴随着碱基插入 缺失和无义 以及移码突变 自然界天然存在的突变的压力最终会毫不留情的将其转化为假 基因 w a l s h 1 9 9 9 5 一旦突变为假基因 该基因拷贝最可能的命运是继续 在各个位点以最快的速度积累突变 最终使得无法辨认最初它属于哪类基因 新的基因拷贝在生物进化中有三种意义 d u r b i n 等 2 0 0 0 1 增加有 限的基因产物的量 2 其编码的蛋白获得新的功能或活性获得修饰 3 使机 体对该类基因的表达调控更加精确特异 其中也许伴随着催化活性的细微的变 化 以便对该代谢途径加以优化 3 2 查尔酮合酶基因家族成员的特异性表达 关于查尔酮合酶家族成员的组织发育和环境诱导的特异性表达在许多植物 如矮牵牛 牵牛 豌豆中都得到了深入的研究 在矮牵牛 p e t u n i ah y b r i 曲中 c h s a 和c h s j 在花和u v 处理的苗中表 达 而国嬲和 5 口的转录物在花中检测不到 仅在u v 处理的幼苗中表达 k o e s 等 1 9 8 9 在豌豆 p i s u ms a t i v u m 中至今发现了8 个c h s 基因 其中c h s l c h s 2 和 c h s 8 不仅在u v 和激发子处理后强烈表达 还在根和花器官中组成型表达 c h s 3 c h s 4 和c h s 5 也受u v 和激发子的诱导 但是仅在根中组成型表达 c h s 6 和傩7 只在根中有微弱表达 不受任何环境因素诱导 i t o 等 1 9 9 7 在牵牛 i p o m o e ap u r p u r e a 中 至今发现5 个c h s 基因 分别命名为a b c d 和e d u r b i n 等 1 9 9 5 f u k a d a t a n a k a 等 1 9 9 7 c h s d 是着色的 花瓣中表达量最强的c h s 基因 其表达与植物着色时期一致 最高的m r n a 水 复旦大学博士学位论文 蝴蝶兰查尔酮合酶基因家族成员分子进化和差异表达调控的研究 平发生在4 6 期 在这段时期花瓣中花色素积累的速度最快 所以推断在牵牛 中 c h s b 是唯一负责花色素合成的c h s 基因 c h s a b 和c 在花发育的早期表 达 相对c h s d 来说 表达水平很低 c h s e 早期在白色的花筒中大量表达 同 时在花粉囊中表达量也很高 d u r b i n 等 2 0 0 0 以上研究表明 同一物种中的不同c h s 成员有不同的表达模式 揭示了正 向选择在进化中的作用 以上物种中不同成员是否存在催化活性的微小改变还 没有一一证明 但在牵牛中有研究证明 仅c h s d 和e 有催化柚皮苷查尔酮合酶 合成的活性 而a b 和c 没有 s h i o k a