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临床本科毕业论文范文 题目：红芪多糖的纯化及初步结构鉴定 论文摘要：目的研究红芪多糖的分离纯化及初步的结构方法采用超声辅助提取多糖比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸正丁醇法脱蛋白的效果并用GC、TLC及IR分析多糖的初步结构结果三氯乙酸正丁醇法脱蛋白经SephadexG25柱层析分离纯化后得红芪多糖2(HPS2)HPLC确定为均一多糖糖含量为98.2%糖组成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖摩尔比为.3.22.716.12.结论HPS2是一种以苷键为主的吡喃型杂多糖 论文关键词：红芪多糖;薄层色谱;结构鉴定 红芪(RadixHedysari)为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.Mazz的干燥根为甘肃特产名贵药材在临床上主要用于补气固表利尿托毒排脓敛疮生肌红芪中含有氨基酸、有机酸、谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质1近年来研究发现红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用12特别是我们近几年的研究发现经7%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显由于多糖为大分子化合物分离纯化比较困难而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一为了提高多糖的得率、纯度及活性本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究结合TLC、GC、IR等方法对HPS2的结构进行了初步的分析以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础 1材料与仪器 红芪购自甘肃武都;牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G25(西安周鼎国生物技术有限责任公司);单糖对照品(中国药品生物制品检定所);SephadexG25(上海长征制药厂);硅胶G(青岛海洋化工厂);其它试剂均为分析纯 CR22G型离心机(日本日立);UV17型紫外仪(日本岛津);GCClarus5型气相色谱仪(美国PerkinElmer公司);红外光谱仪(NicoletNEXUS67);BS1A自动部分收集器、HL2恒流泵(上海沪西分析仪器厂有限公司);美国Waters6型高效液相色谱仪配Waters2414型示差折光检测器 2方法 2.1红芪多糖的提取纯化路线其流程如下 2.1.1提取红芪药材粉碎超声脱脂热水提取3次合并提取液减压浓缩后离心取上清液乙醇沉淀有机溶剂洗剂透析减压浓缩冷冻干燥得粗多糖HPS 2.1.2纯化粗多糖液脱蛋白、色素SephadexG25柱层析洗脱液透析浓缩冷冻干燥精制红芪多糖HPS2 2.2蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法3多糖含量采用苯酚硫酸法4 2.3脱蛋白方法 称取一定量的粗多糖加入适量蒸馏水6加热溶解备用本实验采用3种脱蛋白的方法 2.3.1Sevag法取粗多糖溶液加入等体积的氯仿正丁醇(V/V为41)试剂混合振摇3min离心除去沉淀透析后醇沉冷冻干燥即得脱蛋白多糖 2.3.2三氯乙酸法取粗多糖溶液加入多糖溶液体积.1倍量的三氯乙酸低温(4)剧烈振摇3min离心除去沉淀透析后醇沉冷冻干燥即得脱蛋白多糖 2.3.3三氯乙酸正丁醇法 取粗多糖溶液加入等体积的三氯乙酸正丁醇(V/V为11)试剂振荡1min静置分层收集下层水溶液透析后醇沉冷冻干燥即得脱蛋白多糖 2.4红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖溶解于适量蒸馏水中过氧化氢除色素减压浓缩经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1(HPS1)取适量的HPS1蒸馏水溶解后SephadexG25柱分离蒸馏水洗脱流速.8ml/min每3ml收集1份苯酚硫酸法跟踪检测绘制洗脱曲线合并主峰流出液减压浓缩至一定体积冷冻干燥得HPS2 2.5纯度鉴定用HPLC法TSKgelG25PW色谱柱示差折光检测器流动相为双蒸水流速1.ml/min检测器温度35样品浓度4mg/ml进样量5l同时取该样品溶液在24nm范围内进行紫外扫描 2.6气相色谱参照文献5多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行GC分析色谱条件:OV11毛细管柱(5m.32mm)载气为N2流速5ml/min分流比41FID氢火焰检测器汽化室温度25检测器温度28程序升温:11(保持5min)(5/min)28(保持2min)进样量.4l 2.7薄层色谱6取15mgHPS2三氟醋酸彻底水解水解产物溶于1ml蒸馏水中以标准单糖为对照分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样上行二次展开展开剂:醋酸乙酯冰醋酸甲醇水=12332(V/V);自然风干后显色显色剂:苯胺邻苯二甲酸溶液烘箱中15加热51min显色 2.8红外光谱测定取2mgHPS3KBr压片测定红外光谱 3结果 3.1脱蛋白方法的选择以蛋白脱除率和多糖损失率为指标比较Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸正丁醇法的脱蛋白效果(见图1)Sevag法的多糖损失率最低但脱蛋白率也最低;三氯乙酸正丁醇法的脱蛋白率最高多糖损失率最低;三氯乙酸法的脱蛋白率达3%以上但多糖损失最高综合各方面的因素本实验选取三氯乙酸正丁醇法脱除红芪多糖中的蛋白质 3.2红芪多糖分离纯化红芪多糖经SephadexG25柱层析纯化分离的洗脱曲线(见图2)仅出现1个洗脱峰收集主峰透析浓缩冷冻干燥得到HPS2 3.3纯度鉴定HPS2的紫外扫描在2628nm处吸收峰消失茚三酮反应呈阴性说明样品中的蛋白质基本除尽也无核酸存在;碘碘化钾反应呈阴性表明样品为非淀粉多糖;经HPLC凝胶色谱后为单一对称峰表明其为均一组分;苯酚硫酸法测定HPS2的糖含量为98.6% 3.4红芪多糖的结构分析 3.4.1气相色谱分析 气相色谱分析(见图3)比较标准品和样品的保留时间可见多糖HPS2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5种单糖组成其摩尔组成比例为.3.22.716.12. 3.4.2薄层色谱分析HPS2经薄层色谱(见图4)检出半乳糖(Rf对=Rf样=.4)、葡萄糖(Rf对=Rf样=.3)、阿拉伯糖(Rf对=.2Rf样=.19)、木糖(Rf对=Rf样=.62)和鼠李糖(Rf对=Rf样=.77)其中木糖和鼠李糖含量较低斑点不明显这与气相色谱结果一致 3.4.3红外分析从IR谱图由图5可见HPS2在3632cm1、328cm1和1412cm1处均具有多糖的特征吸收峰1154、18、124cm1处为吡喃糖基的振动峰7;898cm1为糖苷键的吸收峰82cm1处为吡喃糖的吸收峰说明多糖HPS2中存在和两种类型的苷键并以吡喃型糖为主 4结论 本实验比较了3种脱蛋白方法三氯乙酸正丁醇法脱蛋白效果最好脱除率达37.2%多糖损失率少利用葡聚糖凝胶SephadexG25柱层析分离纯化红芪多糖得HPS2经HPLC及紫外扫描为均一多糖不含蛋白质和核酸 GC、TLC及IR分析HPS2的糖基组成和结构为主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成其摩尔比为.3.22.716.12.单糖主要为吡喃糖异头碳以型为主并有少量的型这为红芪多糖的深入研究打下了理论基础特别为其组成的快速分析提供了可靠的方法 参考文献 1权菊香.红芪的药理研究进展J.时珍国药研究19978(2):178. 2金智生汝亚琴.中药红芪的实验研究进展J.甘肃中医学院学报232(4):52. 3李知敏王伯初周菁等.植物多糖提取液的几种脱蛋白方法