微生物对正十六烷的运输富集机理研究.doc

微生物对正十六烷的运输富集机理研究 1引言目前生物修复被认为是最为经济有效的处理石油污染土壤的技术主要依靠环境中的微生物以有机污染物为碳源进行新城代谢从而净化土壤12微生物细胞膜的功能之一是扩散屏障即阻止碳氢化合物和亲脂性化合物向细胞内扩散3但大量研究表明吸附在微生物细胞表面的烃类物质主要通过三种方式进入微生物体内即被动运输主动运输和整批转运4Bateman等5发现即使在细胞外基质中加入ATP生成抑制剂萘仍会顺利被转移到降解菌Pseudomonapuidat体内因此认为萘通过简单扩散方式进入微生物体内Shishido6的研究结果表明苯酚在浓度低于50mgL1时以主动运输方式进入降解菌体内而在浓度较高时以被动运输的方式进入微生物细胞内Kennedy7认为细菌直接吸附在油滴上然后烃类通过扩散或主动运输的方式进入菌株体内BealR8观察到接种量高时PG201对正十六烷的降解率低于接种量低时十六烷的降解率从而推测这一现象与正十六烷的运输方式有关Steinbuchel和Ratledge911等人在研究中发现许多能降解烷烃类物质细菌在代谢过程中会产生不同的脂类物质然后微生物将这些亲脂性物质以特定的形式储存在细胞内文章在此基上利用两种高效石油降解菌DQ01和DQ02为对象研究吸附在微生物表面的正十六烷以何种方式进入微生物体内以及细胞内烷烃的存在形式2材料和方法2.1实验材料和仪器无机盐培养基（MSM）：5%KH2PO40.1%NH4Cl0.02%MgSO47H2O0.0015%CaCl21mL微量元素/L培养基(每100mL溶液包含0.5mgCuSO45H2O1.0mgH3BO31.0mgMnSO45H2O,7.0mgZnSO4)去离子水定容到1000mL115湿热灭菌20min葡萄糖液体培养基：0.15%K2HPO40.02%MgSO47H2O0.5%蛋白胨1%葡萄糖去离子水定容到1000mL115湿热灭菌20min正十六烷培养基：在无机盐培养基中加入一定浓度的正十六烷仪器：Varian3800气相色谱仪（美国瓦里安技术有限公司）THZC恒温振荡器（哈尔滨东联公司）真空抽滤装置（北京康林科技）J25型高速离心机（美国BECKMAN公司）JY96超声波细胞粉碎机（宁波新芝公司）BX41显微镜（OLYMPUS）120kVTecnai20透射电子显微镜（FEI香港有限公司）UV240紫外分光光度计（上海精密科学有限公司）2.2实验方法2.2.1菌种对不同浓度正十六的运输富集试验将微生物在温度为30的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d然后4下储存细胞从固体培养基中接种到液体培养基中30下培养过夜移取5mL培养液以6000r/min离心5min过滤掉上清液后剩下的菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次并以5mL灭菌的无机盐培养基重悬以10的体积比接种到无机盐培养基中加入一系列不同浓度（1、10、20、30、40、50、100mgL1）的正十六烷20min后将培养液离心菌体用无机盐培养基清洗1次乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次以去除吸着在表面的烷烃然后重悬于10mL10mmolL1的TrisHCl(pH=7.5)中冰浴超声破壁每次3s共60次每次间隔7s离心分离(7000r/min,10min)上清液用等体积正己烷超声萃取2次收集有机相并用无水硫酸钠脱水在旋转蒸发定容到1mL用GC测定浓度富集的烷烃就是DQ01和DQ02体内烷烃的量2.2.2菌种细胞内外正十六烷含量分析这部分实验是为了分析烷烃从细胞外进入细胞内是顺浓度梯度还是逆浓度梯度具体方法如下：微生物在温度为30的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d然后4下储存细胞从固体培养基中接种到液体培养基中30下培养过夜培养液以6000r/min离心5min然后菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次以灭菌的无机盐培养基重悬以10的体积比接种到一系列试管中加入20mgL1十六烷分别在1、2、5、10、15、20、30、40、60min里将细菌离心菌体用无机盐培养基清洗1次乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次用GC测定清洗溶液中的正十六烷即为吸着在微生物表面的烷烃细胞膜内烷烃富集量的分析见2.2.1 1引言目前生物修复被认为是最为经济有效的处理石油污染土壤的技术主要依靠环境中的微生物以有机污染物为碳源进行新城代谢从而净化土壤12微生物细胞膜的功能之一是扩散屏障即阻止碳氢化合物和亲脂性化合物向细胞内扩散3但大量研究表明吸附在微生物细胞表面的烃类物质主要通过三种方式进入微生物体内即被动运输主动运输和整批转运4Bateman等5发现即使在细胞外基质中加入ATP生成抑制剂萘仍会顺利被转移到降解菌Pseudomonapuidat体内因此认为萘通过简单扩散方式进入微生物体内Shishido6的研究结果表明苯酚在浓度低于50mgL1时以主动运输方式进入降解菌体内而在浓度较高时以被动运输的方式进入微生物细胞内Kennedy7认为细菌直接吸附在油滴上然后烃类通过扩散或主动运输的方式进入菌株体内BealR8观察到接种量高时PG201对正十六烷的降解率低于接种量低时十六烷的降解率从而推测这一现象与正十六烷的运输方式有关Steinbuchel和Ratledge911等人在研究中发现许多能降解烷烃类物质细菌在代谢过程中会产生不同的脂类物质然后微生物将这些亲脂性物质以特定的形式储存在细胞内文章在此基上利用两种高效石油降解菌DQ01和DQ02为对象研究吸附在微生物表面的正十六烷以何种方式进入微生物体内以及细胞内烷烃的存在形式2材料和方法2.1实验材料和仪器无机盐培养基（MSM）：5%KH2PO40.1%NH4Cl0.02%MgSO47H2O0.0015%CaCl21mL微量元素/L培养基(每100mL溶液包含0.5mgCuSO45H2O1.0mgH3BO31.0mgMnSO45H2O,7.0mgZnSO4)去离子水定容到1000mL115湿热灭菌20min葡萄糖液体培养基：0.15%K2HPO40.02%MgSO47H2O0.5%蛋白胨1%葡萄糖去离子水定容到1000mL115湿热灭菌20min正十六烷培养基：在无机盐培养基中加入一定浓度的正十六烷仪器：Varian3800气相色谱仪（美国瓦里安技术有限公司）THZC恒温振荡器（哈尔滨东联公司）真空抽滤装置（北京康林科技）J25型高速离心机（美国BECKMAN公司）JY96超声波细胞粉碎机（宁波新芝公司）BX41显微镜（OLYMPUS）120kVTecnai20透射电子显微镜（FEI香港有限公司）UV240紫外分光光度计（上海精密科学有限公司）2.2实验方法2.2.1菌种对不同浓度正十六的运输富集试验将微生物在温度为30的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d然后4下储存细胞从固体培养基中接种到液体培养基中30下培养过夜移取5mL培养液以6000r/min离心5min过滤掉上清液后剩下的菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次并以5mL灭菌的无机盐培养基重悬以10的体积比接种到无机盐培养基中加入一系列不同浓度（1、10、20、30、40、50、100mgL1）的正十六烷20min后将培养液离心菌体用无机盐培养基清洗1次乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2次再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次以去除吸着在表面的烷烃然后重悬于10mL10mmolL1的TrisHCl(pH=7.5)中冰浴超声破壁每次3s共60次每次间隔7s离心分离(7000r/min,10min)上清液用等体积正己烷超声萃取2次收集有机相并用无水硫酸钠脱水在旋转蒸发定容到1mL用GC测定浓度富集的烷烃就是DQ01和DQ02体内烷烃的量2.2.2菌种细胞内外正十六烷含量分析这部分实验是为了分析烷烃从细胞外进入细胞内是顺浓度梯度还是逆浓度梯度具体方法如下：微生物在温度为30的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d然后4下储存细胞从固体培养基中接种到液体培养基中30下培养过夜培养液以6000r/min离心5min然后菌体用5mL灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2次以灭菌