细胞实验 TET KD.docx

1. 小鼠ES细胞培养：ATCC实验材料：配制格拉斯哥极限必须培养基（GMEM），外加15% 热失活牛胎血清、55L GIBCO（-巯基乙醇）、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸5000 unit/ml 青霉素和1000 unit/ml ESGRO (Chemicon)。培养饥饿处理的小鼠E14Tg2A ES细胞。2.TET 1 knockdown：（1）使用试剂盒（Lipofectamine RNAiMAX）将siRNA（CONT KD、TET1 KD1、TET1 KD2）制成脂质体后转染进受体细胞。（用Opti-MEM分别稀释RNA分子和Lipofectamine RNAiMAX，将两者混合，室温下孵育10-20分钟。加入培养细胞中，在37C孵育24-48小时）（2）每种细胞各取20ml在培养皿中于37，5CO2，100湿度条件下培养培养。*3.挽救实验：如步骤2将mrna转入基因敲除细胞，3.培养24hs后，收集培养细胞培养细胞并提取蛋白质4SDS-PAGE分离表达蛋白（1）电泳胶准备a.安装制胶板b按下表配制10%分离胶:丙烯酰胺 10% ddH2O/Ml 4.030%酵母液/mL 2.5分离胶缓冲液（pH8.8）/mL 0.910%SDS/L 7510%APS/L 65TEMED/L 5c.将配置好的分离胶加入制胶槽中，注意应随边缘缓慢加入，勿进气泡，凝胶液价值约距前玻璃板1.5cm处。d轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，是凝胶表面平整，静放30min后除去上层水层，滤纸吸去残留液体。e配制5%浓缩胶（3mL）丙烯酰胺5% dd离子水/mL 2.130%酵母液/Ml 0.5 浓缩胶缓冲液/mL 0.3710%SDS/L 2510%APS/L 25TEMED/L 5f迅速将配置好的浓缩胶加到分离胶上面，并插入梳子至凝胶内，是梳子尺底部与前玻璃板顶端平齐，小心避免混入气泡，静置30min。（2）电泳a将胶板放入电泳槽中，在上下电泳槽中添加1X电极缓冲液，使凝胶上下端均浸泡在缓冲液中，缓缓拔出梳子后上样。b接通电源，上样孔端接负极，另一端接负极，起始电压80V。待溴酚蓝进入分离胶时，电压跳到110V。5.Western Blotting检测目的蛋白及含量（Actin,OCT4, SOX2,TET1）实验试剂：电转液：25mmol/L Tris、192mmol/L Ala、20%(V/V)甲醇 一抗：HisTag抗体或鼠抗人GM-CSF单克隆抗体 二抗：HRP标记的羊抗鼠IgG12H2O、0.2%KH2PO4 10Xpbs:8%NACl、0.2KCl，0.29%NaHPO4 PBST:1Xpbs,0.01%-0.02%Tween-20 TBST:20mmol/L Tris-Hcl(pH7.4)、150mmol/L Nacl、0.05%Tween-20 封闭液：含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS（临时用200mLPBST或TBST加入10g脱脂奶粉） 显色液或发光液实验用具：垂直板电泳槽，Bio-Rad公司的电转移装置，稳压横流电泳仪，PVDF膜，Whatman 3MM滤纸，镊子，小平皿或小密封塑料袋（1）电泳结束后，于一角切去一块作为标记，小心从制胶板上将凝胶剥下，去浓缩胶。用电转液漂洗10-15min。（2）转膜（半干法）a将膜泡入甲醇中1-2min后转入电转液中，将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入电转液中。b电转移夹层的组装在电转仪上铺好三层滤纸剪去膜左上角，将膜铺在靠膜滤纸上，注意不要产生气泡，倒些电转液到膜上，保持其湿润。将胶移到膜上后，用一张靠膜滤纸覆盖在胶上。倒些电转液，铺两张靠膜滤纸。c装好电转仪，100mA/膜，转移1.5h。（3）封闭与杂交a封闭：转移结束后，将膜取出，用去离子水与PBST稍加漂洗，浸没于封闭液中。室温下70r/min孵育1h。b结合一抗：将膜1:500稀释的一抗溶液中，室温下70r/min孵育2h。c洗涤：用PBST漂洗三次，每次5-10min。d结合二抗：按相应比例稀二抗后，将膜浸入二抗溶液中，室温下70r/min孵育1h。e用PBS洗膜1-3次。（4）发光与显色鉴定HRP-ECL发光法a将A、B发光液按比例稀释混合。b膜用ddH2O稍加漂洗，滤纸贴脚吸干。c.将混合物覆盖在膜表面，1-2min，并摇晃混匀。d.熄灯可见淡绿色荧光条带后滤纸贴脚吸干，用保鲜膜把膜包起来，放入片盒。e在暗室中将X光片覆盖在上面，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。f取出胶片后立即进入显影液中1-2min，清水漂洗后放入定影液至完全定影。清水冲净晒干，标定marker后进行分析与扫描。arget sequences of shRNA(DNA)Gene Name Target sequenceControl CONT KD 5-GTTCAGATGTGCGGCGAGT-3Tet1 KD1 5-GCAGATGGCCGTGACACAAAT-3Tet1 KD2 5-GCTCATGGAGACTAGGTTTGG-3RNA:Control CONT KD 3-CAAGTCTACACGCCCGCTCA-5Tet1 KD1 3-CGTCTACCGGCACTGTGTTTA-5Tet1 KD2 3-CGAGTACCTCTCATCCAAACC-5Antibody：TET1 Abcam SOX2 GeneTex OCT4 AbcamMillipore美国Chemico