（细胞生物学专业论文）胚肾衰老过程端粒酶htert表达及调控的实验研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得 注 如 没有其他需要特别声明的 本栏可空 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意 学位论文作者签名 李丕复辨字 荔彩 导j i 签字 墨 勿 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂燕有关保留 使用学位论文的规定 有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本入授权j 盟可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可 以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在 解密后适用本授权书 学位论文作者签名 蓼五灰 7 年9 牛 0 0 7 响铲 山东师范大学硕士学位论文 胚肾衰老过程端粒酶逆转录酶表达及调控的实验研究 中文摘要 端粒的结构与功能与细胞衰老有密切联系 随着体细胞有丝分裂次数增加 端粒重 复序列将逐渐丢失 导致染色体端粒长度逐渐缩短 端粒缩短至一定临界长度时 细胞便 停止分裂 进入衰老期 h a r l e y 等人提出了细胞衰老的端粒假说 认为端粒长度的变化 可以作为细胞有丝分裂能力的生物钟 端粒酶负责将端粒重复序列t t a g g g 添加到染色体末端 补偿了随细胞分裂而出现 的端粒丢失 稳定了永生化细胞的端粒长度 端粒酶催化亚基 h u m a nt e l o m e r a s e r e v e r s et r a n s c r i p t a s e h t e r t h t e r t 具有逆转录酶活性 是决定端粒酶活性的关 键组份 d n a 甲基化作为重要的表观遗传修饰 通过甲基化d n a 结合蛋白与改变染色质结构 的相关因子共同作用 调控基因转录活性 一般来说 高甲基化可抑制下游基因的转录 而去甲基化可诱导癌基因的表达 我们通过原代细胞培养 建立了胚肾细胞体外快速衰老模型 并从形态学 衰老相 关b g a l 染色 s e n e s c e n c e a s s o c i a t e db g a l s a b g a l 两方面印证了该衰老模 型 接着我们从端粒长度 端粒酶活性 h t e r t 基因表达角度探讨了胚胎体外衰老的分 子生物学机制 最后应用甲基化特异性p c r m e t h y l a t i o ns p e c i f i cp c r m s p 研究 了h t e r t 基因启动子区域的甲基化修饰水平 研究发现 胚肾细胞体外传至1 6 代出现明显衰老表型 细胞体积明显增大 形状 扁平 胞浆区域增大 细胞浆 细胞核的比例增加 胞浆中可见较多颗粒或空泡 s a d g a l 染色呈现强阳性 该快速衰老模型的建立 为体外模拟衰老研究奠定了坚实的 基础 端粒长度的研究发现1 2 代到2 0 代 端粒长度没有发生明显变化 只是长度动态 变异范围增大 端粒酶活性的研究提示1 2 代以后胚肾细胞逐渐失去端粒酶活性 1 6 代 细胞完全失去端粒酶活性 h t e r ti n l 州a 水平研究进一步印证了该结论 另外 随着细胞 走向衰老 其h t e r t 基因启动子区域出现甲基化修饰 d n a 甲基化可能参与抑制h t e r t 基因表达 表观遗传调控是实现高等生物体时空特异性基因表达的关键机制 几乎所有重大疾 山东师范大学硕士学位论文 病的发生都与表观遗传调控的失调有关 我们建立了胚肾细胞体外快速衰老模型 并探 讨了表观遗修饰在衰老过程中的作用机制 对于生物体生长发育等正常生命活动的有重 要理论指导意义 关键词 端粒酶端粒酶逆转录酶d n a 甲基化 分类号 q 2 5 5 山东师范大学硕士学位论文 e x p e r i m e n t a ls t u d i e so nh u m a nt e l o m e r a s er e v e r s e r r a n s c r i p t a s ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mi n s e n e s c e n c em o d a lo fh u m a ne m b r y ok i d n e y a b s t r a c t s l i l 1 c t u r ea n df u n c t i o no ft e l o m e r ea sw e l la sm e c h a n i s mo fc e l ls e n e s c e n c ea r e i m p o r t a n tr e s e a r c hs u b j e c t si nb i o l o g y a st h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rt e c h n i q u e t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt e i o m e r eo rt e l o m e r a s ea n dc e l ls e n e s c e n c eb e c o m e st h e h o ta r e ao fb i o l o g i c a lr e s e a r c h s om u c hr e s e a r c hw o r kh a sc o n f i r m e dt h a tt h e t e l o m e r es e r v e sa sm i t o t i cc l o c ka n dg e n e t i ct i m eb o m bi nc e l lr e p l i c a t i o na n dc e l l c l e a v a g e t e l o m e r a s ei sar i bn u c l e o p r o t e i ne n z y m a t i cc o m p l e xt h a ta d d st e l o m e r er e p e a t s e q u e n c e s1 一r a g g go n t ot h ec h r o m o s o m ee n d s c o m p e n s a t e sf o rt h et e l o m e r i cl o s s t h a to c g u i 鼍w i t hc e l ld i v i s i o na n ds t a b i l i z e s t e l o m e r a s ec o n s i s t so ft h r e ec o m p o n e n t s h u m a nt e l o m e r a s er e v e r s e 妇鹏c r j p t a s e h t e r t a nr n at e m p l a t a t e l o m e r e s er n a c o m p o n e n t h t r a n o t h e rs u b u n i ti st e l o m e r ea s s o c i a t ep r o t e i n t p l t h eh t ra n d t p li su b i q u i t o u s l ye x i s ti nb o t hp o r m a la n dm a l i g n a n tt i s s u e sa n dc e l l s b u tt h e h t e 盯c o m p o n e n ti su n d e t e c t a b l ei nm o s tn o r m a lh u m a nt i s s u e sa n ds o m a t i cc e l l s b u tc o m m o n l ye x p r e s s e di nh u m a ni m m o r t a lc e l l sa n de m b h oc e l l ss ot h e e x p r e s s i o no fh t e f ti st h o u g h tt o b ep a r a l l e l e dw i t ht e l o r n e r a s e a c t i v i t ya n d c o n s i d e r e da sar a t e l i m i t i n gd e t e r m i n a n to fe n z y m a t i ca c t i v 眦 d n a m e t h y l a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o no fg e n et r a n s c r i p t i o n a b e r r a n td n a m e t h y l a t i o ni sa ni m p o r t a n ta l t a m a t i v em e c h a n i s mi ns i l e n c i n gg e n e t r a n s c r i p t i o n i ti so fgr e a ti n t e r e s tw h e t h e re x p r e s s i o no fh t e ti sa l s or e g u l a t e db y m e t h y l a t i o no ft h ec p gi s l a n di nt h ep r o m o t e ro fh t e r tg e n e w eh y p o t h e s i z e dt h a t t h eh t e r tc p gi s l a n dw o u l db eu n m e t h y l a t e dt op e r m i te x p r e s s i o no fh l r e r ti ne a r l y e m b w o c e l l sa n dm e t h y l a t i o nw o u l do c c u rt os i l e n c et h et r a n s c d p t i o no fh t e r l t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd n am e t h y l a t i o no fh t e r ta n dc e l l 山东师范大学硕士学位论文 s e n e s c e n s ei ns e n e s c e n c em o d a lo fh u m a ne m b r y ok i d n e y w es t u d i e dt h el e n g t ho f t e l o m e r e t e l o m e r a s ea c t i v i t y t h em r n al e v e la fh t e r ta n dt h em e t h y l a t i o np a t e mi n h t e r tg o r ep r o m o t e ra r e a f i r s to fa 1 1 w ee s t a b l i s h e daf a s ts e n e s c e n c em o d a io f h u m a ne m b r y o 硒d n e y h u m a ne m b r y ok i d n e yc e l l sw e r ep a s s a g e du n 矧n of u r t h e r p d sw e r ea c h i e v e d c e l ln u m b e rs h o w e dl i t t l eo rn oi n c r e a s ew i t h i nap e d o do f3 0 d a y s p h a s e c o n t r a s tp h o t o m i c r o g r a p h ss h o w e dp d 4 p d 8 p d l 2 p d l 6 p d l 8a n d s e n e s c e n tp d 2 0 w h i c hi s e n l a r g e d a n df l a t t e n e di n a p p e a r a n c e c e l l s a t s u b c o n f l u e n td e n s i t yb ys e r i a lp a s s a g i n gw e r es t a i n e df o rs a p g e l t h ec e l l sw e r e p h o t o g r a p h e du n d e rp h a s e c o n t r a s to p t i c s r e p r e s e n t a t i v ep h o t o m i c r o g r a p h se r e s h o w n s e n e s c e n tc e l l sp d 2 0d i s p l a yab l u es t a i n s h o w i n gv e r yh i g he x p r e s s i o ni n c o n t r a s t i n gw i t h l o w e rl e v e l si ny o u n g e rc e l l s s o u t h e r nb l o th y b r i d i z a t i o nw a s p e r f o r m e du s i n gt e l o m e r es p e c i f i cp r o b eo f a g g g 4a n dg e n o m i cd n ae x t r a c t e d f r o md i f f e r e n tp d sf o rm e a s u d n gt e l o m e r el e n g t h r e p r e s e n t a t i v ee x a m p l eo fa t r f s o u t h e r nb l o t l a r g e r v a d a b i l i t yw a sf o u n dd u d n gp d l 2a n dp d 2 0 t h e t e l o m e r a s ea c t i v i t yi nd i f f e r e n tp d so fh u m a ne m b r y ok i d n e yc e l l sw a sm e a s u r e db y t r a pa s s a y t h et e l o m e r e s ea c t i v i l yd i s a p p e a r e dc o m p l e t e i yi np d l 6 h t e r tm r n a e x p r e s s i o nw a s m e a s u r e db yr t p c r r t p c r a n a l y s i sw a sp e r f o r m e do nt o t a lr n a 仃0 md i f f e r e n tp d s t h e e x p r e s s i o no fh t e r tw a sm u c hl o w e r i np d l2 a n d d i s a p p e a r e di np d l6 t h em e t h y l a t i o no fh t e f tp r o m o t e rs e q u e n c ew a sm e a s u r eb y m e t h y l a t i o ns p e c i f i cp c r i tw a st u r n e do u tt h a tt h ec o r ep r o t m o t e ro fh t e r tw a s p a r t l ym e t h y l a t e di np d l 6 m e t h y l a t i o np a l y e da ni m p o r t a n tp a r ti ng r a d u a t i n g9 e n ee x p r e s s i o n a n do u r r e s e a r c hw o r kw a sc e n f o u s e do nt h er o l eo fe p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o ni nt h em e c h a n i s m o fc e l ls e n 鹊c e n s e a l lt h e s er e s e a r c hm a yb ei m p o r t a n ti nc e l lc l e a v a g ea n dc e l l s e n e a c e n c e 4 k e y w o r d s t e l o m e r a s e h 1 e r td n a m e t h y l a t i o n c a t e g o r yn u m b e r q 2 5 5 山东师范大学硕士学位论文 综述一端粒酶逆转录酶 h t e r t 的分子调控机制 端粒位于线性染色体末端 维持染色体正常功能的发挥 人端粒包含长约r l o e b 的t t a g g g 重复片段 一旦其短至一定长度 细胞生长及复制能力将被限制 会导致细 胞衰老或与人类衰老相关的疾病 生殖细胞 千细胞和肿瘤细胞具有维持端粒长度的能 力 而大多数正常体细胞则没有此能力 这主要归因于端粒酶的相关成分 端粒酶逆转 录酶 e r t r n a 模板及端粒酶相关蛋白 其中h t e r t 为端粒酶活性的核心因子 丈于 8 5 的肿瘤细胞是通过h t e i 订上调转录来诱导端粒酶活性的 h t e r t 的异常表达常致人类 细胞的永生化 因而h t e r t 的表达在肿瘤中有很重要的作用 b t e r t 基因的表达与调控主要集中于转录 各种转录因子及相关的调控因子与 h t e r t 启动子相互作用 参与转录的激活和抑制作用 同时 d n a 相关区域组蛋白乙酰 化与去乙酰化 m r n a 转录后剪切 磷酸化等调节机制在h t e r t 的表达中也发挥很重要作 用 一 h t e r t 基因的基本结构 h t e r t 为单拷贝基因 定位于染色体5 p 1 5 3 3 长4 0 k b 含1 6 个外显子及1 5 个内 古子 跨3 5 k b 区域 蛋白由1 1 3 2 个氨基酸组成 启动子包含在转录起始点上游 3 3 0 第二外显子区域内 富含g c 无t a t a 盒及c p a t 盒 但有转录启动元件c c t c c c 有助 于e n a 聚合酶i i 识别转录起始位点 启动子 2 5 0 1 8 1 区为核心启动子区 含2 个e 盒和5 个g c 盒 外显子3 含有端粒酶特异性结构域单元t t 模序 h t e r t 含有7 个高 度保守的逆转录结构区 r t 分别位于各个外显子上 有5 个s p l 结合点 一7 3 6 5 6 8 8 1 1 0 有2 个e 盒 c a c g t g 1 6 5 4 4 启动子的这些特异结构在 基因表达中起关键调节作用 二 参与h t e r t 基因转录调控的相关因子 u y c m a x l d e m y c 是参与h t e r t 表达的重要分子 c m y c 与m a x 形成异二聚体 结合h t e r t 核 心启动子区一1 6 5 位的e 盒 激活启动子转录 其中在特异性细胞和组织中尚有s p l 的 参与 c 一辩c 与m a d 形成二聚体 也结合相同的位点 抑制启动子的转录 m y e m a d l 对e 盒的结合比m y c m a x 对e 盒的结合相对容易些 二者竞争性地结合启动子 从而形 5 山东师范大学硕士学位论文 成h t e r t 转录的开关效应 c m y c 作为许多细胞进程 含生长 分化 凋亡 的重要调 节子 其c 一端参与m a x 的复合作用 识别特异性d n a 靶序列 c y y c 对启动子一2 1 0 及 一3 4 的e 盒也有调控作用 p 5 3 p 5 3 作为h t e r t 表达调控中最普遍的抻制子 p 5 3 不是直接结合启动子而抑制转录 其蛋白与s p l 形成复合物 阻止s p l 结合h t e r t 启动子而抑制转录活性 p 5 3 蛋白的 d n a 核心区结合域 n 端转录域 c 一端寡聚体结合域对h t e r t 的抑制很重要 同时 p 5 3 介导的h t e r t 的转录抑制作用需一定水平的p 5 3 蛋白才能实现 p 7 3 依赖其与d n a 的结合能力 激活 f d m 2 来降低p 5 3 的蛋白水平 从而消除p 5 3 介导的h t e r t 的转录抑 制作用 在m c f 7 细胞系中 敲除p 7 3 基因会导致p 5 3 蛋白东平上升 同时h t e r t 转录 下降 1 p 2 1 作为p 5 3 转录的靶目标 使r b 家族成员去磷酸化变为转录抑制子 结合e 2 f 家庭转录因子 所以p 2 1 连接着p 5 3 途径和r b e 2 f 途径 是p 5 3 介导抑制作用的关键 点 另外 组蛋白去乙酰化活性也参与p 5 3 介导的抑制作用 h p v l 6 h p v l 6e 6 蛋白与m y c 相互作用调控h t e r t 基因表达 h t e r t 启动子区 十5 4 0 是e 6 一反应蛋白的主要元件 此区含有m y c m a x 结合位点 m a d 蛋白 c 的特异拮抗 因子 抑制e 6 介导的h t e r t 转录 当m y c 过表达时 m a d 的拮抗作用消失 e 6 不改变 m y c 蛋白表达 由m y c e 6 诱导的h t e r t 转录与m y c 蛋自t h r 5 8 及s e t 6 2 的磷酸化无关 在宫颈癌中 e 6 可通过抑制p 5 3 蛋白水平而上调h t e r t 转录活性 e 6 激活h t e r t 表达 可被p 5 3 阻断 类固醇激素 雌激素促肿瘤的一个机制就是激活h t e r i 转录活性 同时诱导端粒酶活性 尤其是 在乳腺癌组织中 雌激素受体 e r 与h t e k t 启动子的两个位点相互作用 第一个是 2 6 7 7 2 6 6 5 g g t c a a g c t g a t c 与公认的e r 结合点 g g t c a n 3 t g a c c 一致 在体外 e r 特异性结合此位点 删除此位点将诱导启动子介导的报告基因活性 第二个是 8 6 3 8 5 9 g g g c g g g a t g t g a c c 含有规范化的e r 结合转录因子s p l 序列的一半序列 g g g c g g 此结构有利于e r 和s p l 联合结合d n a 1 孕酮经过m a p 途经调控h t e r t 定 位于启动子的e t s 家庭公认的模序 c a g g a a t 是r a p 激酶作用的位点 孕酮 6 山东师范大学硕士学位论文 在乳腺癌中也显示激活h t e r t 转录 在前列腺癌细胞系中 雄激素间接对h t e r t 发挥作 用激活启动子和端粒酶活性 1 t 细胞 外周血t 细胞可以增强h t e r t 的转录及端粒酶活性 h t e r t 蛋白出现于源于胸腺和 外周血的淋巴细胞中 而与端粒酶活性无关 c d 4 t 细胞可诱导h t e r t 的磷酸化及核定 位 在未活化的新鲜分离的c d 4 t 细胞中 h t e r t 蛋白只存在于胞浆中而核中不能检出 反之 活化后的c d 4 t 细胞 胞浆及核中均能检出h t e r t 蛋白 h t e r t 大量表达于抗 c d 3 l c d 2 8 处理后的t 细胞中 其h t e r t 从浆到核的重新分布与端粒酶在胞浆和胞核中 的活性相关 e l y c 是活化t 细胞的早期基因 在t 细胞活化的早期 通过p k c 介导 的信号途径诱导e m y c 的表达 致h t e r t 的表达上调 p k c 可使端粒酶蛋白磷酸化 参 与t 细胞中端粒酶的转录后调控 o e t s e t s 是一类含有相当保守i j n a 结合域的转录园子家族 e t s i e t s 2 可经过m a p 激酶 磷酸化被活化 m a p 激酶是经e g f 表皮生长因子 受体及同源性的原癌蛋白h e r 2 n e u 活化e g f 后上调h t e r t 转录的 作用于启动子区两个并列的e t s 位点 2 2 1 4 原 癌蛋白h e r 2 n e u r a s r a f e r 8 1 均可在端粒酶 一 细胞中单独诱导h t e r t 转录 共同作用也有同样效果 e r 8 1 结合外显子l 的两个e t s 位点 2 8 8 2 9 1 3 9 0 3 9 3 声 这些位点突变会致启动子抑制 其激活途径为 瓶r 2 n e u r a s r a f 一 f a p e r 8 1 i j s f u s f 为b h l h z i p 蛋白 结合h t e r t 启动子的e 盒 5 c a c g t g 3 u s f 主要是形 成异二聚体 结合h t e r t 核心启动子区 2 3 3 4 3 8 内上游 一1 6 5 一1 6 0 和下 游 4 4 4 9 的e 盒 在e 盒依赖性h t e r t 转录中 u s f 扮演重要角色 但仅在端 粒酶 细胞系中活化h t e r t 启动子 其过表达不能激活端粒酶 一 细胞系的h t e r t 启动子转录 这可能与u s f 阻止m y e m a x 与启动子结合有关 因而在正常体细胞中不 能激活h t e r t 转录 其他重要的调控因子 a k t p k c 及a k t 激酶通过磷酸化h t e r t 而增强其转录活性 p k c 通过转录控制h t e r t 活性及蛋白磷酸化调控端粒酶活性 1 两位点分别为 2 2 0 g a r r r g g s a s 2 2 9 8 1 7 a v ri 生查堕蔓查堂堡主堂垡丝三 r g r s y s 8 2 6 w t l 结合h t e r t 启动子区 2 8 1 2 7 3 特异性结合g c g c g g g c g 位点 抑制启 动子转录 此作用仅限于肾 性腺及脾组织中 具有组织特异性 p 3 0 0 类似c a m p 反应元件结合蛋白的特异性转录因子 经蛋白一蛋白相互作用激活 h t e r t 转录 p 3 0 0 结合基本转录因子l i d 作为中介因子 联接增强子蛋自与转录园子 促进靶基因h t e r t 转录活性 另外 p 3 0 0 还与p 5 3 一起共同作用 抑制h t e r t 转录 e 2 f e 2 f 结合h t e r t 启动子的 一1 7 4 一1 7 0 及 一9 8 9 4 两个区域 e 2 f 一1 特异性结合启动子两个位点 依赖与d n a 结合域的作用 可降低癌细胞的h t e r t 启动子 活性 e 2 f 一1 在许多研究中显示健细胞分裂 结合位点的突变可增加h t e r t 转录水平 e 2 f 2 e 2 f 3 也抑制肿瘤细胞的h t e r t 转录 但e 2 f q e 2 f 5 没有此作用 t g 卜bl 在两方面调控端粒酶活性 1 t g f bl 抑制c 一蜥c c m y c 的抑制导致 h t e r t 转录下调 2 t g f bl 可以调整h t e r t 的剪切方式 从全长片段的剪切体到无 活性的b 缺失变构体 k i p d n a p k c s 结合蛋白 k i p 特异性结合d n a p k c s 也是h t e r t 定位的核蛋白 k i p h t e r t 形成复合物 改变了其他k i p 作用物的功能 致酶活性发生改变 k i p 可以 直接或间接地经h t e r t 激活端粒酶活性 h i f 1n 组织缺氧诱导因子ld 上调h t e r t h t e r t 启动子区 一1 6 5 5 1 含两 个h i f l 模序 h i f t l 直接与h t e r t 调控区作用两诱导端粒酶活性 公认的启动子区 1 6 5 1 5 8 4 4 5 1 为h 工f 1 结合部位 缺氧所致h t e r t 表达是由于增强了h i f l 在h r r e r t 启动子上的作用活性 t h eo r p h a nr e c e p t o rc o u p t f i l 核激素受体超家族转录因子之一 含有一个d n a 结合域 d b d 和一个配体结合域 l b d 在细胞生长及分化中起作用 c o u p t f i i 与启 动子的 5 8 5 3 5 区有很强的作用特异性结合 2 0 1 3 5 区域 c o u p t f l l 结合e 盒 竞 争c m y c 与e 盒的结合 抑制h t e r t 活性 t e i f 端粒酶转录元件结合因子 有2 3 5 8 b p 阅读框 编码7 8 6 个氨基酸 功能保 守 蚤白定位于核内 在h e l a 细胞中 t e i fc 端负责结合h t e r t 启动子的 5 3 1 9 0 区域 特别是 2 9 0 区 t e i p 依赖于一3 2 十9 0 区域激活启动子 p 2 7 c d k i 家庭成员 在宫颈癌细胞系中有潜在的抑制h t e r t 表达作用 p 2 7 阻断 g 些查堕蔓莶兰堕主兰垡堡奎 细胞周期g l 喝转点 其过表达会抑制h t e r t 表达及宫颈癌端粒酶活性 部分是由于抑 制h p v l 5e 7 蛋白的表达所致 s u r v i v i n 凋记亡抑制成员 在结肠癌中 s p i 和c m y c 在丝 苏氨酸位的磷酸化可 被s u r v i v i n 增强 从而加强与h t e r t 启动子的结合 同时p 1 3 激酶e 介导s p i 和c m y c 的这种磷酸化作用 最终上调h t e r t 表达 1 神经酰胺 负性调控s p i 的转录功能和 或增强s p 3 的抑制功能 神经酰胺降低s p 3 的乙酰化 s p 3 的乙酰化可诱导某些启动子的转录 1 三 甲基化作用 基因启动子区甲基化在基因表达中有一定的作用 但其调控作用机制至今尚无定 论 d e v e r e u x 等对3 7 个细胞系h t e r t 启动子区7 2 个c p g 位点的检铡 从一s 0 0 5 0 区 域 许多细胞系的启动子是全部甲基化或部分甲基化 至少在一些细胞系中 甲基化与 h t e r t 的表达及端粒酶活性有关 所有检测的细胞系中 没有显示出特异性的甲基化谱 存在于启动子或某些c p g 位点 许多不表达h t e r t 的正常体细胞也有未甲基化 高甲基 化启动子 有可能d n a 甲基化介导的调节机制并不是这些细胞系h t e r t 表达的主要机 制 这种机制可能只存在于部分组织或细胞中 癌基因的启动子高甲基化可能也会作为 抑癌机制存在 在b 细胞性慢性淋巴细胞性白血病中 h t e r t 启动子甲基化 无论是低甲基化或高 甲基化 对端粒酶活性有一定影响 与疾病分期无关 可能是低甲基化降低转录阂值 允许其他正性调控因子上调h t e r t 转录 反之 甲基化位点可能直接抑制特异性序列转 录因子 g u i l l e r e t 等检铡n 个端粒酶 细胞系 除z 株膀胱癌细胞系外 4 4 1 2 1 8 的2 7 个c p g 位点是甲基化的 4 种癌组织 端粒酶弱阳性 部分甲基化 同时在1 5 个 端粒酶 一 组织中发现高甲基化状态 他们在对h t e r t 启动子区 1 5 3 9 1 7 3 2 c p g 位点检测 在 1 4 5 0 区甲基化状态变化很大 在端粒酶 组织与细胞中 前l o o b p 高甲基化下降 后面完全甲基化 3 8 0 r 4 5 0 区也有类似高甲基化下降 甲基化分布大 不相同 h t e r t 启动子全甲基化而外显子l 仅部分甲基化 但部分甲基化区可能有重要 作用 致抑制子不能结合甲基化的d n a 位点 如果全甲基化 则r n a 聚合酶及一些转录 园子 转录复合物不能形成 h t e r t 转录就不可能 故为了转录 启动子出现甲基化和 9 山东师范大学硕士学位论文 或近外显子区高甲基化状态 h t e r t 的表达与甲基化状态尚全面或特异性位点关系 多数h t e r t 一 正常细胞 h t e r t 癌细胞 有未甲基化或高甲基化启动子 同时其他癌细胞有高度甲基化启动 子 说明 正常细胞有不依赖于启动子甲基化的紧密抑制h t e r t 表达的机制 同样h t e r t 启动子甲基化与端粒酶活性问也尚无一致关系 但甲基化在一些细胞系中下调转录仍有 一定作用 甚至在某种环境下高甲基化有助于启动子的活化 四 组蛋白乙酰化与去乙酰化 h t e r t 基因相关区域组蛋白乙酰化在其表达调控中有很重要的作用 以前认为s p i 多为转录激活子 s p 3 多为转录抑制子 现证实s p l 和s p 3 均为h t e r t 启动子的转录抑 制子 s p l 和s p 3 参与转录后调控 如磷酸化 乙酰化等 在正常体细胞中 h q a c 2 的 n 一端与s p l 及s p 3 的c 一端相互作用形成复合物 s p l 及s p 3 的n 一端域通过与h i a c 2 作用 结合h t e r t 启动子区 一1 8 8 一1 8 0 o n a 抑制调控元件 形成d n a 一蛋自复合体 加上 h o a c 作用局部组蛋白脱乙酰化 致使h t e r t 在正常体细胞中的转录沉默 t s a 作为 h i a c 的抑制剂 可以诱导h t e r t 启动子区组蛋白的高乙酰化 在端粒酶 一 细胞中直 接激活h t e r t 基因表达 在端粒酶 细胞中上调h t e r t 转录 当s p l 位点突变时 t s a 介导的转录活性丧失 可能是因为t s a 通过s p l 模序参与调控转录 其中启动子近 a t g 上游的第一个s p l 位点最为重要 因为各种因子竞争性结合s p l 位点 从而导致不 同途径的调控机制发挥作用 启动子区对各转录因子的接合强烈影响组蛋白乙酰化与 去乙酰化问的平衡 五 h t e r tm r n a 的剪切作用 h t e r tm r n a 有很复杂的剪切机制 h t e r t 启动子的5 一端 t 8 2 1 8 1 1 可能参与 h t e r t m p n a 的剪切过程 至少参与了第一个外显子的剪切 因此调控r n a 剪切的一些因 子可能会定位于这一区域 某些园子可能会结合这一序列 稳定剪切体 有利于正确剪 切 剪切是非随机的 可能有重要调节作用 其中第1 2 外显子有很重要的抑制作用 h t e r tm r n a 的选择性剪切有三种形式 a 缺失 0 缺失 插入型 a 缺失 缺少第6 外显子5 一端的3 6 个核苷酸 1 3 缺失 缺少第7 和第8 外显子 插入型 如第4 外显 子插入3 8 个核苷酸 第l l 外显子部分插入 第1 4 外显子插入1 5 9 个核苷酸 第1 5 外 山东师范大学硬士学位论文 显子全部替代 第1 4 外显子前5 0 0 个核苷酸被替代等 a 缺失导致h t e r t 蛋白的模序a 部分缺陷 b 缺失致蛋白剪切 完全缺失第7 及第8 外显子的剪切出现于月经期的子宫 内膜 在子宫内膜癌中 端粒酶 全长转录及各种剪切形式共同存在 证实在子宫 内膜组织中h t e r t 转录剪切形式与端粒酶活性相关 1 c e r e z o 等对5 2 例肺癌组织和细胞系检测 四种形式即全长片段 n 缺失 p 缺失 d1 3 缺失均有 其中5 例端粒酶 有全长片段 9 例端粒酶 一 无全长片段 4 例端粒酶 一 l c n e c s 只有b 缺失 1 4 例端粒酶 s c l c s 均有全长片段和l 例有 b 缺失 2 例有b 缺失和ab 缺失 1 1 例四种剪切均有 2 例端粒酶 一 s c l c s 只 有b 缺失 只有全长片段可提供端粒酶活性 小片段 b 及a8 缺失 无括性 同 时a 缺失变构体作为负性方式参与调控 六 h t e r t 蛋白多聚体 无活性的h t e r t 片段在体外可以形成多聚体 且n 一端被认为是多聚体分子中蛋白与 蛋白相互作用的位点之一 3 4 一个n 一端缺乏前3 5 0 个氢基酸的h t e r t 蛋白和另一个 c 一端缺乏前2 0 5 个氨基酸的h t e r t 蛋白片段 二者单独存在时没有活性僵当混合在一起 时 端粒酶活性恢复 此混合物中 两个r t 域共享氨基酸3 5 1 氨基酸9 2 7 区域 其中 氨基酸8 8 4 氨基酸9 2 7 间可能是重要的功能区 此种功能性的多聚体可反映真正的生理 作用可形成一些特殊的结合位点 促进d a 重复片段的形成 有利于d n a 片段的延长嘎 h t e r t 在肿瘤和人类老化相关疾病中有很重要的作用 其转录 调控 表达过程中 有许多转录园子 d n a 特异性结合蛋白分子 外源性基因片段及各种小分子物质参与 作用机制复杂 需要进一步深入研究 阐明其具体的分子调控机制 有助于理解人类肿 瘤的形成 同时也为肿瘤的基因治疗提供新途径 山东师范大学硕士学位论文 综述二表观遗传学及其生物学意义 表观遗传学 e p i g e n e t i c s 又称后生调节学说 表型遗传学 主要包括d n a 甲基 化和组蛋白乙酰化 能使基因表达沉默而不改变基因编码序列 其分子基础是染色质组 分的共价修饰 一是针对d n a 的修饰 在高等真核生物中只发现了c 5 一甲基胞嘧啶 这 种甲基化胞嘧啶在哺乳动物基因组中可达到5 并具有特定的分布谱式 在细胞繁殖过 程中保持相对稳定 二是对构成染色质核小体的组蛋白的修饰 具有化学多样性的特点 哪个组蛋白 如h 3 或h 4 的哪一个氨基酸残疾 如3 4 或9 号赖氨酸 和发生哪种 类型的修饰 乙酰化 甲基化 磷酸化或泛素化 都有多种可能 并且与d n a 的甲基化一 样 组蛋白的各种修饰也随着基因组区域的不同而不同 表观遗传信息由d n a 胞嘧啶甲 基化模式 d n a 结合蛋白及其共价修饰 核中染色质形成的不同结构编码 不同的d n a 甲基化 组蛋白共价修饰均编码不同的表观遗传信息 表观遗传信息协同特定转录园子 调节转录 这种能调节转录而不改变基因编码序列的表观遗传信息可以遗传 d n a 甲基他常见于细菌 植物和哺乳动物 原核生物可产生三种甲基亿碱基 n 6 甲基化腺嘌呤 n 4 甲基化胞嘧啶 c 一5 甲基化胞嘧啶 但在高等真核生物中仅发现c 一5 甲基化胞嘧啶 在哺乳动物基因组中 d n a 甲基化是指胞嘧啶和鸟嘌呤 c p g 二核苷酸中 的胞嘧啶第5 位碳原子被甲基化 此过程是在d n a 甲基转移酶 d n m t s 的催化下 以s 一 腺苷甲硫氨酸 s a m 为甲基供体 将甲基转移到c p g 二核苷酸中的胞嘧啶第5 位碳原子 上 哺乳动物基因组有5 1 0 是c p g 位点 其中7 0 9 8 0 为甲基化c p c m e t h c p g c p g 二核苷酸大部分位于异染色质 呈高度甲基化状态 其余则散布在基因组中 平均每 i o o k b 有一个0 5 k b 2 5 k b 的c p g 岛 基因组中约有一半基因 主要是管家基因和4 0 9 6 的组织特异基因的启动子区和第一个外显子富含c p g 称c p c 岛 散在的c p g 岛正常情 况下大部分是非甲基化的 乙酰化作用主要发生在组蛋白分子n 端赖氨酸残基上 由组蛋白乙酰化酶 m 和组 蛋白去乙酰化酶 h d a c 共同催化调节 组蛋白乙酰转移酶 组蛋白去乙酰化酶等组蛋白 修饰酶最主要的功能是通过造成基因组水平迅速的乙酰化p 去乙酰化循环实现基因组整 体水平的调控 目前发现的真核转录相关h a t s 有g c n 5 p 3 0 0 c b p t a f 2 5 0 m y s t p c a f 等 h a t s 把乙酰辅酶a 的乙酰基转移到组蛋白n 端特定赖氨酸残基上 中和组蛋白 所带的正电荷 使组蛋白所带的电荷减少 增建疏水性导致组蛋白 与d n a 的结合作用 山东师范大学硕士学位论文 从而使染色质构象处于开放状态 甚至核小体局部结构的暂时缺失 为r n a 聚合酶的转录 起始和r n a 链延伸提供了顺利进行的空问 有利于基因转录和表达 h d a c s 在哺乳动物中 可分为两类 一类为酵母菌转录调控子r p d 3 蛋白的同类物 包括h d a c l 3 另一类为类酵 母菌h d a i 类蛋白质 包括i 帕a c 4 6 及m a c a h i a c s 可以去组蛋白h 3 h 4 赖氨酸残基上的 乙酰基是带正电荷的赖氨酸残基暴露 带正电荷的赖氨酸残基与d n a 之间的相互作用可 限制核小饽在d n a 之间的移动 而抑制转录 因此 一般情况下转录活跃区的核小体组 蛋白呈高乙酰化状态 而不活跃区则呈低乙酰化状态 一 表观遗传学与基因表达调控 调控基因差异表达的遗传信息存在于基因组中 但基因差异表达的调控方式却不仅 仅由基因组的遗传信息所决定 同时也取决于细胞内外各种环境信号的作用 在这一过 程中 包裹于染色质中的基因组d n a 序列一般不发生改变 但一些特定b n a 区域的转录 活性却呈现动态变化 发生选择性的基因表达 这种影响基因转录活性而不涉及d n a 序 列改变的基因表达调控方式称为表观遗传调控 e p i g e n e t i cr e g u l a t