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LC故障排除系列 终版自动进样器和进样9/24/2010剧本文稿边栏附注前言Mike: 嗨，大家好！我是Mike Woodman，是安捷伦液相色谱仪器性能方面的一名应用科学家。和我在一起的是 Bill Long，来自安捷伦化学品和耗材部的一名应用工程师科学家。 Bill: 大家好！Mike: 作为故障排除系列的一部分，我们认为有必要制作一个仅仅针对自动进样器和进样方法的视频。作为色谱分析过程的一个环节，如果进样操作不正确，就有可能出现问题。Bill: 这些问题会体现在您的色谱图上，这可能需要耗费您大量的精力去修复。Mike: 是的。就像所有的故障排除一样，很重要的一点就是在我们真正了解什么是“错误的”之前，应该明白运行过程中的每个部件状态怎样才是“正确的”。这可以帮助您省去许多麻烦。当我们关注考查自动进样器的性能问题时，我们就需要考虑制造商通常指定限定的一些仪器参数。 诸如准确度、精密度、线性，以及大多数情况下，还有样品残留等等，制造商都会有明确说明。您在使用自动进样器之前，熟悉这些说明是非常有用的indicate specifications searching for “autosampler specifications” at the Agilent website。 从色谱的角度来说，获得这些参数指标的色谱条件通常会印在产品手册上，当我们需要进行一些测试时，这些就能成为对我们很有帮助的参考指导。假如您没有在产品手册上找到您所需要的内容，您可以联系您的维修工程师咨询他们常用的步骤来检查您自动进样器的状态。当然，我们可能不需要检查每一项指标参数来查明问题。 更可能的情况是我们在查看一个常规分析的样品色谱图时，遇到所不希望见到的情况。色谱峰可能太小，也可能太大，甚至完全没有色谱峰。 也有可能包括空白运行在内的所有进样分析结果中，有可能出现以前从未出现过的额外的色谱峰。或是校准曲线不呈线性或连续进样分析的重现性不符合当前分析方法的要求等等。所有这些现象都可能归因于进样器的问题。 其它更为细微的现象也可能被观察到。 在进样时，假如您经常监查液相色谱仪的压力线show on screen ，当进样针进样时您将会注意到一些压力变化甚至突变剧变，这些现象与伴随着进样器的机械动作有关。这些压力改变的模式与进样器设计密切相关，并且每次进样中的变化都趋于一致。因而压力的不正常偏离现象可能预示着进样器存在某些问题。 Mike Woodman是安捷伦公司的一名致力于LC仪器研究的应用化学家。Bill Long 是安捷伦化学品和耗材部的一名资深应用科学家。当操作和设置不当，自动进样器和进样方法就有可能成为问题的来源。查看您自动进样器的说明书，这将有助于您了解其操作参数。您可在安捷伦官网上找到这个说明书。常规日常监查仪器的压力变化也是注意考查您自动进样器/手动进样器性能的好方法。自动进样器如何工作Mike: 我们首先介绍一下自动进样器是如何工作的。当前，所有经销商销售的大多数自动进样器总体讲有两种基本的设计。 第一种设计类型通常叫做可变体积进样器 indicate autosampler on 1290 Infinity。该类型进样器的特点是具有宽范围的进样体积，并且通常自动进样针在分析运行期间保留在流路中。在屏幕上，我们展示了一张简图，用于说明可变体积自动进样器的流路。 show variable_volume_design image。 Bill: 第二种类型的自动进样器 indicate CTC Autosampler G4270，有些不太准确的叫法，为定量环式进样器。该类型进样器的进样体积范围取决于安装在旋转切换阀上各定量环的规格。通常，定量环式设计进样器的一个取样针和样品传送部件组合在分析运行期间并不处于高压流路中。 两种类型的自动进样器都有在吸取完样品进样之前自动清洗进样针的功能。 最后来看大家看到的，这是我们的手动进样器 Bill indicates manual injector。 Mike: 可变体积自动进样器一般具有比定量环式进样器更大的驻留体积。我们时常注意到，对于高速分离，或者有时称之为高通量分析，定量环式设计的进样器往往更有优势成为首选。 然而，定量环式设计由于需要在进样之前将样品从进样针运送到定量环，这就造成了较差的精密度。所以，使用哪种类型的进样器决定了您将会遇到不同的问题去处理。 Bill: 好的，那么现在让我们分析、解决您可能遇到的来自自动进样器或手动进样器的问题。让我们先从一个简单的问题开始峰型过小，或者未出现有效峰形 目前主要有两种类型的自动进样器设计：定量环进样和可变体积进样。多数新型的仪器包括Agilent 1260 和Agilent 1290，安装的都是可变体积自动进样器。峰过小Mike: 好的。假如您查看色谱图时发现峰都过小甚至峰都未出现，首先要考虑一些简单的情况。样品小瓶里有足够的样品吗？ 样品体积太小可致使取样针不能接触样品而未取到样。 检查您的切换阀和计量注射器看它们是否出现漏液。 Bill assists with demonstrating how假如您怀疑进样器有的进样准确度的有问题，有一种方法可对此进行检查。 放置一个已称重的样品小瓶 Bill assists with demonstrating how ，定量注入一定体积的液体，然后可以方便地通过重量分析来验证。假如您正在使用的是手动进样器，同时又发现峰都过小，最大的可能是进样针口处漏液 point to needle port。检查进样针口，以排除问题源自进样量的不准确带来的问题。当您的色谱峰过小时：- 检查您样品小瓶中样品的体积是否足够碰触到取样针。- 检查切换阀和计量注射器是否有渗漏。如要验证自动进样器的进样准确度，可放置一个已称重的样品小瓶并定量注入一定体积的液体，然后就可以方便地通过重量分析来验证。对于手动进样器，当峰过小时，请检查进样口是否有渗漏。峰过大Bill: 假如您的峰都过大Mike: 这一般不可能是进样器造成的,除非是进样器具有可更换了的注射器或计量头尺寸不对。当您的进样准确度检测没有问题时，您应该再重新制备一个新鲜样品进样分析考察一份新的进样结果，以消除人为误差，进而再开始查看系统的其它组件。自动进样器不太可能是造成峰过大的原因，除非是计量头尺寸不对。 重复进样时重现性差Bill: 如果重复进样的重现性很差，您首先要检查进样方法。不稳定的进样量它们能可以直接体现在色谱图上，这是一个使用手动进样器的色谱分析人员经常要面对的一个问题。这是而使用自动进样器的一个关键优势就是自动进样器消除了由于不同操作者进样时自然引入的不一致性，甚或仅是一般的人为误差。 就像我们在峰展宽视频部分讨论的，进样体积会影响峰宽。请看如这个例子所示insert injection_volumes.jpg ，它展示的是进样2 L、5 L 和10 L时的色谱峰，如此您就会理解我们所讲的意思了。 indicate peaks 2 4, first at top, then down at the bottom, where they are wider.Mike: 另一个要查看的地方，不论您是采用手动进样器还是自动进样器，当发现重现性改变时， 另一个要注意的地方就需要注意是系统的压力变化。我最近碰到的就是这样一个非常棘手的问题。我色谱峰的分离看起来十分完美，同时峰高也基本如我所预期，但保留时间却异常变动，同时峰面积的精密度也不是特别好。当我在电脑屏幕上观察压力线变化时，注意到波动来自每次进样之间每次进样的压力都不同，这是我以前未曾见到过的。 我进行了拷屏截屏并将其保存到我的日志中以备我的维修工程师查看。想看看吗，Bill？ demonstrate on chemstationBill: 当然，Mike!前面六个和最后两个样品经过了乙腈稀释indicate，进样 1 L 。在这些进样中只有一个压力特征是正常的。当沿红色的垂直线数到第5根时move arrow along 5 red lines，我们看到有四个明显峰的色谱图。进样前的压力特征显示，当进样器切换到旁路抽取样品时，压力略有下降。进样时，压力短暂进一步下降，这是由于进样器流路进样时与系统流路对接，并重新分担了一部分压力。压力随后升高并很快稳定在大约和进样器切换到旁路前一致的大小。在梯度洗脱中，由于梯度及梯度组成的不断变化，造成其压力线呈歪斜的U型。现在我们看到的是我们更换了切换阀之后的压力线。看起来问题好像不在这里。 当切换阀在旁路时，压力应略低，但在这里却明显升高了 put arrow at higher points of blue lines ，并且可以排除更换的新切换阀在旁路端口插槽处堵塞的可能性。我们现在可以知道一定是针座某个部位出现了泄漏。好，在这儿我们看到针座更换后解决了该问题。此外，当我拆下针座时，我发现其中心有液体聚集，这并非是不正常情况。在进样器操作运行中我们不可能看到这些液体。 评估压力的变化，帮助我找到问题来自进样器，最终也帮助我确定是进样器针座漏液的问题。Bill: 这真是一个极好的例子。好的，现在我们是否该说说校准曲线不成线性的问题了？进样体积影响峰宽。评估压力变化对于分析重现性问题是一个很好的手段。您可通过分析压力变化的趋势，缩小问题来源的范围。非线性校准曲线呈非线性Mike: 好的，我们现在谈谈校准曲线的问题。目前有两种建立校准曲线的方法。一种方法是通过以进样相同进样体积的进样测定一系列不同浓度的标准品溶液来制备。另一种方法是人们我比较喜欢采用的，就是制备某个浓度的标准溶液，然后通过设定自动进样器进样不同的体积来制备。 demonstrate on chemstation 现在对这两种方法褒贬不一。恒定进样量的方法需要更大多的稀释制备标准溶液的实验操作台工作，同时很有可能获得较差的相关系数，这是因为每个标准溶液制备时都有可能受一些未知误差的影响而浓度不准确。但另一方面，恒定进样量的方法对分离影响较小，因为稀释效应会打破色谱柱的平衡。您可以根据所使用不同类型的进样器的类型，选择一个合适的进样体积以保证最高的进样精密度。在说完采用不同浓度的标准溶液制备校准曲线之后，您一定猜到了我将要讲述一下采用不同进样体积的制备校准曲线的问题。我喜欢非常仔细地制备单个浓度的标准溶液，同时调整其浓度以确保它在要求的浓度范围内，并保证无需不会进样太多以致破坏色谱柱的平衡。对于建立窄浓度范围的校准曲线，像采用5水平或者更少 时show setting on screen，我认为不同体积进样法对于我的工作最为适合。Bill: 你谈的真是非常有意思，Mike，但是我不认为你没有回答了我关于非线性的问题。Mike: 你说的对，Bill，谢谢你的提醒我。不同体积进样法，用峰高定量时经常会产生非线性校准曲线，这是因为较大体积进样时会使峰稍变宽，甚至在以峰面积计算，相关系数达到“5个9”时，也会出现这种情况。很明显，我们应该避免它。不过，就整体而言，我还是认为大多数线性问题出自检测器的响应范围。 虽然示差折光检测器的响应线性良好，但它却不是非常通用的检测器。对于不同类型的UV检测器，当信号强度超过1个吸收度单位时，其响应就可能呈非线性了。对于荧光检测器，其线性响应范围一般仅有一到两个数量级。质谱检测器和蒸发光散射检测器的非线性响应行为是众所周知的。当用峰面积和峰高进行计算都出现线性问题时，我就不会再考虑进样器和进样方法的问题，我会转而开始去考虑检测的条件了indicate on screen。 Bill: 哇， Mike，你说的太绝对了。Mike: 我说的是真的，Bill。我是做推销的，谁都知道我们有时会说得有些夸张。建立校准曲线有的两种方法：- 进相同体积的一系列不同浓度的标准溶液；- 制备某个一定浓度的样品标准溶液，然后设置自动进样器进不同体积的标准溶液。大多数线性问题出自检测器的响应范围。如果用峰面积和峰高进行计算时都存在线性问题，就需要考虑检测器的条件。额外峰Bill: 额外峰的出现是一个难题，它可能源自系统的许多地方的一个难题。因此，这个问题可能特别棘手。但是开始从自动进样器开始检查是一个不错的选择。假如不是所有的色谱图中都出现额外的色谱峰时，这就很可能是自动进样器受到污染了。 Mike: 是的，那可能就是进样口或针座被一些其它样品污染了。 请尝试清洗或更换与样品和进样针头直接接触的部件 show washing taking place while voicing over。 Bill: 这种情况经常在分析如多环芳烃类化合物（PAHs）或脂溶性维生素等脂溶性样品时出现。 Mike: 鉴于我们始终要从最简单的事情做起，注意不要马上更换您可以拆卸和冲洗的部件，同时您要确保选择了合适的冲洗溶剂，尤其就像是冲洗进样针的溶剂，所选溶剂应对所测定样品中典型的脂溶性成分有良好的溶解性。色谱图中的额外峰，尤其是在采用梯度洗脱分析时，它也可能来自流动相。在极端的故障排除的极端例子中，我们常将自动进样器切换到旁路，而将泵与色谱柱直接相连demonstrate，然后运行一个空白梯度洗脱分析。show bypass_example_2.jpg.虽然由于滞后体积的差异会造成洗脱峰的出现稍稍提前，但用同样的方法运行一个空白梯度仍能观察到干扰峰的话point out peak at 11 12，这就明显说明额外峰的出现还有是自动进样器以外的原因。Bill: 是的，并且有时候那些杂质峰会出现在目标分析物附近或与之重叠，进而导致极差的精密度。 在评估精密度时，重要的是要记住此时您的检测器信号和基线质量必须非常好，同时一定要精心优化色谱峰的积分参数。积分参数如果选择不当，很容易损害导致自动进样器优异比较差的性能的展现表现。假如出现额外峰，检查自动进样器是个不错的选择。进样口或针座的污染会造成鬼峰的出现。 流动相也可能造成额外峰的出现。您可以将自动进样器切换到旁路，然后运行一个空白梯度，看是否可以解决了鬼峰出现的问题。如果确实是，那么您可以确定问题来自自动进样器。如果不是，那么就应该进一步检查流动相和系统其它部分。峰形改变Mike: 我们有时候会观察到峰形的变化，而这可能暗示意味着自动进样器内部的相关部件的堵塞或磨损。这当然是很有可能的，但是我们也应该考虑样品所用的稀释剂是否和往常相同，以及该稀释剂是否具有稀释效应可能会打破破坏色谱柱的平衡的能力原因。 当上述情况发生时，就很容易造成扭曲峰形的出现。 假如所用稀释剂是一种强有机溶剂，或者该稀释剂虽为水溶液但溶液与流动相相比是有非常不同差距很大的pH值或摩尔浓度的水溶液时，并且尤其是在进样体积又相对较大的情况下，我们能很容易地有可能观察到扭曲峰的出现的现象，正如您在这个例子中所见到的 show strong_diluent.gif。 在大多数情况下，色谱图中最早流出的色谱峰受到的影响最为显著。峰形的改变可能暗示意味着自动进样器有关部件的堵塞或磨损。样品的稀释剂也应该被考虑。 稀释效应稀释剂可能打破破坏色谱柱的平衡，进而造成峰形扭曲。小结Mike: 所以，总而言之，如果您手边有一台自动进样器，并且了解手动进样的限制和人为误差导致进样中的常见隐患，那么，您要想成为一名高效的故障排除专家，您就应该熟悉自动进样器的相关说明和