（临床检验诊断学专业论文）血小板功能实验分析前质量控制的研究.pdf

、-l-一， 盘1-ji， 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“忠诚、敬业、和谐、创新”的学风，本人声明：所呈交的论 文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证 书而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 日期：勿向- ，2 中 日期：切口，矿 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医 进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文 以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除 外) 。 论文作者 指导教师 日期：3 , o l o 一乡中 日期：2 a 口，吵 q 念， 2 l b 曰 ， 厢 ，专笠 名名 签签 者师作教 文导论指 ，z1， 目录 _ i828324 中文摘要( 1 ) 英文摘要( 3 ) 一前言( 5 5 )一刖舌“”“( ) 二材料与对象( 6 ) 三实验方法( 7 ) 四实验结果( 1 1 ) 五讨论( 2 5 ) 六结论( 2 9 ) 参考文献( 3 0 ) 文献综述( 3 2 ) 攻读学位期间发表文章情况( 4 6 ) 致谢( 4 7 ) 军医进修学院硕士学位论文 血小板功能实验分析前质量控制的研究 中文摘要 探讨富血小板血浆( p r p ) 量、血小板( p l t ) 浓度、诱导剂浓度及储存 时间、混匀次数、时间、温度、抗凝剂种类及血浆钙离子浓度对血小板聚集、 血栓弹力图( t e g ) 、血小板膜糖蛋白参数检验结果的影响，进而为建立血小 板功能检验全面质量管理体系提供实验依据。 收集5 1 9 名门诊体检志愿者静脉血液，在上述实验条件下( 不同p r p 量、 血小板浓度、诱导剂浓度、储存时间、混匀次数、时间、温度、抗凝剂种类 及血浆钙离子浓度) ，采用血浆比浊法进行血小板聚集率( n = 3 9 4 ) 检测，全 血复钙法进行血栓弹力图( n = 9 4 ) 检测，流式细胞术进行血小板膜糖蛋白 ( n = 3 1 ) 检测。 血小板聚集试验是一项影响因素众多的常规分析手段。血小板聚集实验 p r p 用3 0 0 u l 测血小板聚集，花生四烯酸( 从) 、二磷酸腺苷( a d p ) - 5 0 冰箱储存7 月、1 3 月，- 5 0 c 解冻后诱导剂从、a d p 储存于5 c 冰箱2 4 h ， 对血小板聚集检测结果无影响；血小板聚集率随p l t 浓度的增高而增高，血小 板浓度2 5 0 x1 0 9 几为比浊法血小板聚集的适宜浓度， 3 9r e t o o l l ) c a ni n h i b i tt h ep l a t e l e ta g g r e g a t i o n ；t h ee f f e c to f d i f f e r e n ta n t i c o a g u l a t a n t so np l a t e l e ta g g r e g a t i o na n dg l y c o p r o t e i n sa c t i v a t i o ni s s i g n i f i c a n t ，s o d i u mc i t r a t es e e m st ob et h eb e s ta n t i c o a g u l a n tf o rp l a t e l e t s a g g r e g a t i o n m i x i n gt i m e so f b l o o d s a m l ei nk a o l i nt u b es h o u l db ef i x e da t3 - 5 t i m e si nt h et e s to ft e g ，o rt h et e s t i n gr e s u l to fra n dm a o fc ka r en o t i n c o m p a r a b l e ；b l o o ds a m p l ef o rt e g t e s ti ss t o r e di nal o wt e m p e r a t u r es i t e ， w h i c hc a ne n h a n c et h ea c t i v i t yo fb l o o dc o a g u l a t i o nf a c t o r s 、f i b r i n o g e na n d p l a t e l e tf u n c t i o na c t i v a t e db ya a a n da d p ；s a m p l ei ss t o r e di nah i g ht e m p e r a t u r e s i t e ，w h i c hc a ne n h a n c et h ea c t i v i t yo fb l o o dc o a g u l a t i o nf a c t o r sa n d r e d u c e a c t i v i t yo fp l a t e l e ta c t i v a t e db ya d p ；t h ee f f e c to fs a m p l ea tr o o mt e m p e r a t u r e f o r8 ho nt h ep a r a m e t e ro f r c k 、k 、a c k 、m a c k 、k a 、m a aa n dm a a a i sn o t s i g n i f i c a n t ，t h ea c t i v i t yo fp l a t e l e ta c t i v a t e db ya d p ( m a i d , p ) r e d u c e s a st i m e e l a p s e s ；s ob l o o ds a m p l ea f t e rd r a w n f o rt e gt e s ts h o u db es t o r e da tr o o m t e m p r e t u r ea n db ef i n i s h e di n1 2 h c a l c i u mc i t r a t ei t s e l fm a y i m p a i rc o a g u l a t i o n d y n a m i c s b l o o dc o a g u l a t i o nf a c t o r sa n dp l a t e l e t c o a g u l a t i o na n a l y s e su s i n g b l o o dt h a th a sb e e ne x p o s e dt oc i t r a t ea n dr e c a l c i f i e dd on o ty i e l dr e l i a b l e d e p i c t i o n so ft h en a t u r a ld y n a m i c so f b l o o dc o a g u l a t i o np r o c e s s e s ；t h ec a 十 c o n c e n t r a t i o no f2 1m m o l ls e e m s t ob et h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nf o r t h r o m b o e l a s t o g r a p h yb y r e c a l c i f i c a t i o nm e t h o d t h ee f f e c to fd i f f e r e n t a n t i c o a g u l a t a n t so ng l y c o p r o t e i n sa c t i v a t i o ni ss i g n i f i c a n t ，c t a d h a sl e s se f f e c t o ns e l f - a c t i v a t e dp l a t e l e ti nf l o wc y t o m e t r ya n ds e e m st ob et h eb e s ts p e c i m e n a n t i c o a g u l a t i n gm e t h e d k e y w o r d s ：p l a t e l e t sa g g r e g a t i o n ；t h r o m b o e l a s t o g r a p h y ；f l o wc y t o m e t r y ； q u a l i t yc o n t r o l 4 军医进修学院硕上学位论文 _ _ - - _ j - 一刖吾 近年来，评价血小板功能检测方法学( 如流式细胞术测血小板膜糖蛋白、 血栓弹力图和传统的血浆血小板聚集等) 报道日益增多，血小板聚集是血小 板参与止血和血栓形成的重要环节，在诊断先天性和获得性血小板疾病方面 很有价值。血栓弹力图( t h r o m b e l a s t o g r a p h ，t e g ) 则能提供由凝血启动 到纤维蛋白形成，血小板聚集，纤维蛋白联结和血块形成至溶解的连续、实 时的全部信息。血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判 断，利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表 达，可灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。但由于实验方 法学、检测仪器与试剂、质量控制措施、操作人员素质多方面的影响，临床 工作中获得准确有意义的血小板功能试验结果是较困难的。首先，与普通凝 血实验不同，它无普及的室内或室间质控物可用；大部分测试需新鲜血液标 本，许多实验室用健康志愿者血对照来建立正常范围，或同时测已知正常标 本来确保每项测试试剂可行性；大部分血小板功能试验如血小板聚集仍未标 准化：不同实验室通常使用不同渠道、不同浓度范围的诱导剂。正常血小板 功能很大程度依赖钙离子，因此通过螯合钙离子来抗凝血标本又产生了问题 一血浆钙离子变化影响检测结果。血标本的质量、处理温度和标本放置时间 长引起的老化问题在血小板分析过程中也可产生假性结果。同时血小板本身 易人为活化，也易降低敏感性。在临床实验室检测中，我们发现这些试验的 检验结果受上述因素影响很明显，其检测结果的稳定性和可比性却明显存在 不足。我们就此进行了探讨，以期为改善这些试验的分析前质量控制水平、 提高其诊断价值提供试验依据。 军医进修学院硕上学位论文 二材料和对象 1 仪器与试剂 c h r o n o - l 0 6m o d e l 7 0 0 血小板聚集仪及配套试剂( 美国c h r o n o _ l o g ) ； t h e r m oi e cc l 4 0 离心机( 美国t h e r m o 公司) ；s y s m e xx e 一2 1 0 0 血球分析仪 ( 希森美康公司) ：a b l 7 0 0 血气分析仪及试剂( 丹麦a b l 公司) ；t e g 一5 0 0 0 型血栓弹力图仪及配套试剂( 美国h a e m o s c o p e 公司) ；b e c k m a nc o u l t e rf c 5 0 0 流式细胞分析仪及配套试剂( 贝克曼公司) ；枸橼酸钠、肝素、e d t a 和c t a d ( c ： 枸橼酸钠；t ：茶碱：a ：腺苷；d ：双嘧达莫) 抗凝管( b d 公司) ；1m l 、1 0u 1 、 1 0 0u l 移液器。 2 检测对象 门诊体格检查健康( 凝血功能和血小板功能正常) 志愿者5 1 9 名，男3 0 9 名，女2 1 0 名，年龄2 2 - - 7 5 岁，平均5 4 岁。受试者完全随机化分组，分别 进行以下检测： ( 1 ) 富血小板血浆( p r p ) 量对血小板聚集的影响，二磷酸腺苷( a d p ) 诱导血小板聚集试验2 6 例，花生四烯酸( 从) 诱导血小板聚集试验4 6 例； ( 2 ) p r p 血小板浓度对a d p 诱导血小板聚集的影响，a d p 诱导血小板聚集试 验3 8 例，从诱导血小板聚集试验2 8 例；( 3 ) 诱导剂浓度对血小板聚集的 影响，a d p 诱导血小板聚集试验1 7 例，从诱导血小板聚集试验1 4 例：( 4 ) 从、a d p 储存时间对血小板聚集的影响，从一5 0 储存0 月、7 月对血小板聚 集率的影响2 9 例，a d p 一5 0 。c 储存0 月、1 3 月对血小板聚集率的影响2 9 例， 一5 0 解冻后诱导剂从、a d p 冰箱5 保存0 、2 4 h 对血小板聚集的影响1 1 例； ( 5 ) 标本室温放置时间对血小板聚集的影响，a d p 诱导血小板聚集试验3 6 例及p h 测试1 7 例，从诱导血小板聚集试验3 0 例；时间、温度对a d p 诱导 血小板聚集的影响1 0 例；( 6 ) 不同c d + 浓度对血小板聚集影响，低钙对血 小板聚集的影响及血c a 2 + 浓度检测1 4 例，高c a 2 + 浓度对血小板聚集影响( a d p 诱导2 9 例，从诱导1 3 例) 及血浆c a 2 + 浓度检测2 l 例；( 7 ) 不同抗凝剂对 血小板聚集的影响3 9 例；( 8 ) 混匀次数对t e g 参数c k 的影响3 0 例； ( 9 ) 时间、温度对血栓弹力图参数的影响1 3 例：( 1 0 ) 抗凝剂枸橼酸钠对弹力图 的影响2 1 例：( 1 1 ) 不同钙浓度对弹力图参数的影响3 0 例；( 1 2 ) 不同抗 6 军医进修学院硕士学位论文 凝剂对血小板膜糖蛋白表达的影响3 l 例；清晨空腹采集受试者静脉血，3 8 枸橼酸钠与静脉血的比例为1 ：9 ，肝素与静脉血的比例为6 8 u s p ：4m l ，e d t a 与静脉血的比例为3 6 m g ：2m l 。 3 统计学处理 应用s p s s1 3 0 统计软件进行数据处理和分析。检测数据以i j 表示， 单因素实验2 组测试数据的比较应用配对t 检验；多组测试数据之间的比较 应用单因素方差分析，两两比较应用w e l c h 法或d u n n e t t st 3 检验；二因 素实验( 如温度、时间对血小板聚集和t e g 影响) 一般线性模型的单变量分 析；咫0 0 5 表示差异有统计学意义。 三实验方法 1 p r p 量对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。采集静脉血5 4 m l + 人，枸橼酸抗凝，标本8 0 0r m i n ( 离心半径1 9c m ) 离心5m i n ，分离富含 血小板血浆( p r p ) ，剩余标本4 0 0 0r m i n ( 离心半径1 9c m ) 离心8m i n ， 分离贫血小板血浆( p p p ) ；x e 一2 1 0 0 血球计数仪计数p r p 血小板数，并将血 小板数目调至2 5 0 x1 0 9 几左右，p r p 混匀后，取2 个血小板聚集杯，分别注入 3 0 0 u l ( 杯底加垫) 、5 0 0 u l ，以自身p p p 调零，上机加入花生四烯酸( 从) ( 终 浓度0 7m m o l l ) 或二磷酸腺苷( a d p ) ( 终浓度1 0u m o l l ) 诱导剂，测血 小板聚集率，收集数据。 2 p r p 血小板浓度对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。采集静脉血 8 m l 人，枸橼酸抗凝，标本离心( 同上) 分离p r p 、p p p 后，x e 一2 1 0 0 血球计 数仪计数p r p 血小板数，按p r p 数目用自身p p p 配制成4 0 0 x1 0 9 l 、3 0 0 x 1 0 9 l 、2 5 0x1 0 9 l 、2 0 0x1 0 9 l 、1 8 0x1 0 9 l 、1 5 0x1 0 9 l 、1 0 0x1 0 9 l 、7 5 1 0 9 几、5 0 1 0 9 几浓度梯度的血浆，上机加入a d p ( 终浓度1 0u m o l l ) 或 从( 终浓度0 7m m o l l ) 作为诱导剂测血小板聚集率，收集数据。 3 诱导剂浓度对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。采集静脉血 5 4 m l 人，枸橼酸抗凝，离心分离p r p 和p p p ，x e - 210 0 血球计数仪计数p r p 血小板数，并将血小板数目调至2 5 0 1 0 9 l 左右，并将p r p 混匀，取6 只血 军医进修学院硕士学位论文 小板聚集杯，注入p r p 3 0 0 u l 管，从( 0 4 、0 5 、0 7 、0 8 、1 0 、1 5m m o l l ) 或a d p ( 3 、5 、7 、8 、1 0 、1 5u m o l l ) 各浓度上机测血小板聚集率，收集数 据。 4 从、a d p 储存时间对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。将1 0m g a a 油滴用7 0 0u l 小牛血清溶解，用移液器充分吹打或振荡器振荡1 0m i n ，配制 成含从5 0m m o l l 牛奶样的制剂；2 5m ga d p 用5m l 生理盐水充分溶解； 再分别按日需量，用0 5m 1 的离心管分装储存于一5 0 c 冰箱；采集志愿者静 脉血2 7 m l 人，枸橼酸抗凝，离心分离p r p ，x e - 2 1 0 0 血球计数仪计数p r p 血 小板数，并将血小板数目调至2 5 0x1 0 9 几左右，分别用储存o 月、7 月从，0 月、1 3 月a d p 作为诱导剂，上机测血小板聚集率；将诱导剂a a 、a d p 从- 5 0 冰箱解冻后置于5 c 冰箱，再分别用5 c 冰箱储存0 、2 4 h 的a d p ( 终浓度 1 0u m o l l ) 或从( 终浓度o 7m m o l l ) 作为诱导剂，上机测血小板聚集率， 收集各组数据。 5 不同时间、温度对血小板聚集的影响 5 1 标本室温放置时间对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。采集静 脉血8 m l 人，枸橼酸抗凝，抽血开始计时，将枸橼酸钠管轻轻混匀后，离心 ( 同前) 分离p r p 和p p p ，将p r p 混匀，取6 只血小板聚集杯，每杯注入p r p3 0 0 u1 ，将p r p 置于室温2 5 ，分别于1 5 、4 、6 、8 、1 0 、2 4 h 测血小板聚集率， 加入诱导剂a d p ( 终浓度1 0u m o l l ) 或a a ( 终浓度o 5m m o l l 或1 0m m o l l ) 反应1 0m i n ，记录血小板聚集率，收集数据。 5 2 时间、温度对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。l o 名健康志愿 者，年龄2 2 - 3 7 岁，平均2 5 岁，清晨空腹抽静脉血，抽血开始计时，采集 1 7m l 人，将枸橼酸钠管轻轻混匀后，离心( 同前) 分离p r p 和p p p ，p r p 上x e 一2 1 0 0 血球分析仪测血小板数，p r p 血小板计数高者用自身p p p 将数目 调至2 5 0 x1 0 9 l 左右，将p r p 混匀，取2 1 只血小板聚集杯，每杯注入p r p3 0 0 u1 ，随机分3 组7 只组，分别置于温度2 5 c 、3 4 、4 c ，再分别于0 ( 立即) 、 2 、3 、4 、5 、6 、8 h ，测试杯底加杯垫，以自身p p p 调零，加入诱导剂a d p ( 终 浓度1 0u m o l l ) ，反应1 0m i n 记录血小板聚集率。 6 不同抗凝剂对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。采集静脉血1 l m l 8 军医进修学院硕r j ：学位论文 人，将枸橼酸钠、肝素和e d t a 抗凝标本8 0 0r m i n 离心5m i n ，分离p r p ， 剩下标本再4 0 0 0r m i n 离心8m i n ，分离p p p ；p r p 上x e - 2 1 0 0 血球分析仪 测血小板数，并将数目调至2 5 0 1 0 9 几左右，以自身p p p 调零，加入诱导 剂从( 终浓度0 7m m o l l ) 或a d p ( 终浓度1 0u m o l l ) 反应1 0m i n 记录血 小板聚集率，记录从、a d p 血小板聚集率。 7 不同钙离子浓度对血小板的聚集的影响 7 1 低钙对血小板聚集的影响：1 4 名健康志愿者，清晨空腹抽静脉血， 采集1 8m l 人，取9 支枸橼酸钠抗凝管，1 支注入3 o m l ，1 支注入2 7 m l ， 2 支注入2 4 m l ，2 支注入1 5 m l ，3 支注入0 9 m l ，抗凝剂与血量比例分别为 1 ：1 0 ，1 ：9 ，l ：8 ，1 ：7 ，1 ：5 ，1 ：3 ，将枸橼酸钠管轻轻混匀后，离心( 同前) 分离p r p 和p p p ，p r p 上x e 一2 1 0 0 血球分析仪测血小板数，将数目调至2 5 0 x 1 0 9 l 左右，将p r p 混匀，立即上机，以自身p p p 调零，加入诱导剂从( 终 浓度o 7m m o l l ) 或a d p ( 终浓度1 0u m o l l ) ，反应1 0 m i n ，记录从、a d p 血小板聚集率。 7 2 血浆钙对血小板聚集的影响：采用血浆比浊法。枸橼酸钠抗凝标本 离心( 同前) 分离p r p 和p p p ，p r p 上x e 一2 1 0 0 血球分析仪测血小板数，将数目 调至2 5 0 x1 0 9 l 左右，将p r p 混匀，再取1 0 个血小板比色杯，每杯沿杯壁注 入混匀的p r p3 4 0ul ，然后分别加入浓度0 2m o l l 的c a c l 。0 、5 、8 、1 5 、 2 0 、3 0 、6 5 、1 0 0 、1 2 0 、1 5 0ul ，立即上机，以自身p p p 调零，加入诱导剂 a d p ( 终浓度1 0um o l l ) 或从( 终浓度0 7m m o l l ) 反应1 0m i n ，记录从、 a d p 血小板聚集率。 8 混匀次数对t e g 参数c k 的影响：空腹取静脉血，采集2 7m l 人，枸 橼酸钠抗凝。t e g 试剂从4 冰箱取出恢复至室温。在2 台t e g 仪的4 个通 道各装上1 个反应杯，枸橼酸钠管颠倒混匀5 次，取2 只高凝土管，每管沿 管壁注入混匀抗凝血1m l ，静置4 - 一6m i n 后，用移液器取其中1 高岭土管 抗凝血o 3 4m l 加入反应杯立即测试( 混匀0 次) ；再将该高岭土管颠倒混 匀5 次，取o 3 4m l 加入反应杯立即测试( 混匀5 次) ；再将第2 只高岭土 管颠倒混匀1 0 次，取0 3 4m l 加入反应杯立即测试( 混匀1 0 次) ；再将第 2 只高岭土管颠倒混匀5 次，取o 3 4m 1 加入反应杯立即测试( 混匀1 5 次) ， 9 军医进修学院硕十学位论义 记录反应时间( r ) 、凝固时间( k ) 、a 角( qa n g l e ) 和最大幅度( m a ) 。 9 时间、温度对血栓弹力图参数的影响：健康志愿者1 3 名，女5 名，男 8 名，年龄2 2 - 3 7 岁，平均2 7 岁，清晨空腹采静脉血3 9 m l 人，抽血开始计 时。枸橼酸钠抗凝7 管，肝素抗凝5 管。将7 管枸橼酸钠抗凝血轻轻混匀， 再全倒入1 无菌塑料杯，轻轻混匀，再取1 6 个l m l 离心管，注入抗凝血1 1 m l 管；同样方法，将5 管肝素抗凝血混匀，分装成1 6 个离心管，1 2 m l 管。先 取1 枸橼酸钠抗凝血和1 管肝素抗凝血在抽血0 5 h 上机测试作为零对照，再 将剩下1 5 个枸橼酸钠抗凝管和1 5 个肝素抗凝管随机分3 组( 5 个枸橼酸钠 离心管和5 个肝素离心管为1 组) ，分别置于4 。c 冰箱、2 5 室温、3 4 c 水浴 箱，在分别于1h 、2 h 、4h 、6h 、8h 上机测试，分别记录c k ( 枸橼酸抗 凝血、高凝土激活) 、a ( f 激活物只激活血样中纤维蛋白原) 、a a ( 没被药物 抑制能被花生四烯酸激活的血小板功能) 和a d p ( 没被药物抑制能被二磷酸 腺苷激活的血小板功能) 4 通道的参数：r 、k 、a 角和m a 。 1 0 抗凝剂枸橼酸钠对弹力图的影响：采用血栓弹力图描记术。清晨空腹 采静脉血，分别往枸橼酸钠抗凝管注入2 7 m l ，高岭土管注入l m l 静脉血。 立即将高岭土管静脉血颠倒混匀5 次上机测试( k ：高岭土) ；再取1 只高岭 土管，枸橼酸钠管轻轻混匀后，取l m l 抗凝血注入高岭土管，颠倒混匀5 次 后立即上机测试( c k ：枸橼酸钠、高岭土) ，分别记录r 、k 、a 角和m a 。 1 1 钙离子浓度对血栓弹力图参数的影响：清晨空腹采静脉血5 4m l 人。 t e g 试剂从4 冰箱取出恢复至室温。在3 台t e g 仪的6 个通道各装上1 个空白 杯，分别加入浓度o 2m o l l 的c a c l 。5 、8 、1 5 、2 0 、3 0 、6 5ul ；再取3 只高 岭土小管，每管沿管壁注入颠倒混匀5 次后的抗凝血1m 1 ，静置4 - - 6m i n ，颠 倒混匀3 次，再将3 只小管内抗凝血移至1 个塑料试管内，将试管颠倒混匀2 次。 然后r 甸t e g 仪6 个通道上加钙的杯内沿杯壁分别注入高岭土激活的抗凝血0 3 4 m 1 ，开始t e c n 定，记录反应时间、凝固时间、q 角和最大幅度，上血气分析 仪检测全血c a 2 + 浓度。 1 2 不同抗凝剂对血小板膜糖蛋白的影响：采用流式细胞术。清晨空腹 采静脉血，第一管用作其它检查，然后c t a d 管、枸橼酸钠、肝素和e d t a 采 血，于采血3 0m i n 之内完成三种抗体染色，加血样后轻轻混匀，室温暗处孵 1 0 军医进修学院硕士学位论文 育1 5 - 2 0m i n ；各管中加入2 8 0 c1 多聚甲醛固定液0 5 m l ，充分混匀，2 - 8 0 c 阴暗处放置3 0m i n ，2 4 h 内上机分析。开机f c m 测定校准流式细胞仪后，在 c e l l q u e s t 软件环境中，将流式细胞仪的前向角散射( f s c ) ，侧向角散射( s s c ) 及三色荧光( f l l 一f l 3 ) 的检测信号均设置为对数放大，以c d 6 1p e r c p 阳性为获 取条件，在c d 6 1 v s s s c 点图中设门找出血小板群，在单个血小板和血小板微 颗粒所在位置圈门，计数门内5 0 0 0 1 0 0 0 0 个血小板，获取各管的试验数据。 四实验结果 1 p r p 3 0 0 、5 0 0 u l 对血小板聚集的影响：见表1 。配对t 检验，3 0 0 u l 、 5 0 0 u l 组值之间差异无统计学意义( p o 0 5 ) ，p r p 用3 0 0 u l 、杯底加垫测血小 板聚集，对检验结果无影响。 表l3 0 0 、5 0 0 u l p r p 对血小板聚集的影响( ，i s ) 2 p r p 血小板浓度对从、a d p 诱导血小板聚集的影响：a a 诱导血小板聚 集随血小板数增高而增高，从诱导血小板聚集对血小板数要求高，聚集发生 呈“全或无 式，血小板浓度2 5 0 1 0 9 l 组与4 0 0 1 0 9 l 、3 0 0 x1 0 9 l 、 2 0 0 1 0 9 l 、1 8 0 1 0 9 几组值之间差异无统计学意义( p 0 0 5 ) ，与p l t 1 5 0 1 0 9 几以下的各组差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，与p l t 1 8 0 1 0 9 几以下的各组差异有统计学意义 ( p o 0 5 ) 。( 见表3 ) 。 5 0 7 5 1 0 0 1 5 0 1 8 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 1 2 6 _ + 1 0 6 “ 1 0 4 4 - 9 3 ” 1 0 4 8 7 ” 2 3 6 _ + 1 4 8 ” 2 2 1 _ + 1 3 5 ” 2 6 3 + 1 2 8 * 3 3 3 1 6 2 ” 3 2 1 - + 1 5 9 3 4 5 - + 1 5 9 * 4 2 0 _ + 1 3 6 “4 1 3 _ + 1 3 4 梯4 4 4 1 1 3 4 6 4 - + 1 2 4 。4 5 1 + 1 2 2 4 6 9 9 5 4 8 3 1 2 7 4 7 5 1 2 9 4 9 1 4 - 1 0 4 4 9 9 - + 1 2 9 4 9 6 - + 1 3 3 5 2 6 - + 1 4 3 5 2 7 - + 1 3 9 5 3 8 - + 1 0 9 4 0 0 5 5 3 + 9 9 一一- 相关性p o 0 5 p o 0 5 p o 0 5 ，r = o 4 9 2 8 ) 。( 见表 4 ) ；血小板聚集率随a d p 浓度逐渐增高而增高，a d p 浓度与血小板聚集率呈 线性相关( p o 0 5 ) ，1 5 h 组与6 h 、8 h 、1 0 h 、2 4 h 组值之间差异有统计学意义 ( p o 0 5 ) ，1 5 h 组与6 h 、8 h 、l o h 、2 4 h 组值之间差异 有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 表9 标本室温放置时间对血小板聚集的影响( ，i s ) 注：与1 5 h 组比较，( 料：) 表示尸0 0 1 ，( 木) 表示尸0 0 5 5 2 时间、温度对a d p 诱导血小板聚集的影响：标本放置时间、温度对 a d p 诱导血小板聚集率有明显的影响，标本放置时间和温度之间存在交互效 应( p 0 0 5 ) 。2 5 组与3 4 、4 c 组值之间差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，与6 h 、8 h 组之间差异有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；4 c 组a d p 聚集率受低温作用后增高，随标本放置时间的延长又 有降低的趋势，( 见表1 1 ) 。 军医进修学院硕士学位论文 表l o 温度对a d p 诱导血小板聚集的影响( n = l o ) 温度 a d p 聚集率( ，i 5 ) 2 5 4 3 5 1 4 6 3 4 3 l - 5 1 6 0 ” 4 c5 4 9 1 3 4 ” p t o o l ，t m o o l ， t 水t m 0 0 5 注：与2 58 c 组比较，( 料) 表示p 0 o l ；t 表示温度因素，t m 表示时间因素 t 木t m 表示温度与时间的交互效应。 表i i 时间对a d p 诱导血小板聚集的影响( n = 1 0 ) ( 。孑s ) 分3 温度组综合 3 4 。c 组2 5 。c 组4 。c 组 组a d p 聚集率a d p 聚集率 a d p 聚集率a d p 聚集率 0 h 4 8 4 1 4 34 8 5 1 4 84 8 1 1 5 34 8 6 1 4 2 2 h4 7 6 1 6 13 8 0 1 5 0 ”4 7 2 1 5 05 7 5 1 3 3 ” 3 h4 7 0 1 7 43 5 2 1 4 4 ”4 7 2 1 5 85 8 7 1 4 5 ” 4 h4 5 0 1 7 83 0 4 1 2 9 ”4 7 2 1 5 0 5 7 3 1 4 8 ” 5 h4 3 o 1 6 2 ”2 8 2 1 2 44 4 o 1 0 95 6 1 1 1 7 ” 6 h 3 9 o 1 8 2 ” 2 3 8 1 2 6 ”3 8 8 1 3 l ” 5 4 3 1 4 - 8 8 h3 3 4 + _ 1 8 8 ”1 6 4 1 1 0 ”3 1 8 + _ 1 3 1 “5 2 o 1 1 5 p t o o l 。t m o o l o o l 0 o l o o l t ，i ct m 0 0 1 注：与0 h 组比较，( ，i ：i ：) 表示p o o l ，( ，i c ) 表示p o 0 5 ；t 表示温度因素， t m 表示时间因素，件t m 表示温度与时间的交互效应。 6 不同抗凝剂对血小板聚集的影响：见表1 2 不同抗凝剂对血小板聚集 有明显的影响。枸橼酸钠抗凝标本从诱导血小板聚集率与肝素抗凝相当，a d p 诱导聚集比肝素抗凝低( p 0 0 5 ) ；e d t a 抗凝标本血小板几乎不聚，从、a d p 诱导聚集率与枸橼酸纳组聚集率之间差异有统计学意义( p o 0 1 ) 。 1 6 军医进修学院硕上学位论文 表1 2不同抗凝剂对血小板聚集的影响( n = 3 9 )( ，i s ) 注：与枸橼酸钠抗凝组值比较，( 料) 表示p 0 0 1 ，( 木) 表示p o 0 5 7 不同钙离子浓度对血小板的聚集的影响 7 1 低钙对血小板的聚集的影响：见表1 3 从、a d p 诱导血小板聚集都 受c a 2 + 明显影响。血浆c a 2 + 浓度在0 0 4 - - , 0 1l m m o l l 时，血小板聚集率随钙 离子浓度的降低而降低，其中a d p 诱导血小板聚集最明显，在钙离子浓度0 0 8 m m o l l 时聚集率明显下降，钙离子浓度0 1 0 m m o l l 组与0 0 8m m o l l 、0 0 6 m m o l l 、0 0 4 m m o l l 组差异均有统计学意义( p o 0 5 ) ，r 和k 有明显的影响，r 和k 都随混匀次数的增加而缩 短，5 次与0 、1 0 、1 5 次组值之间差异有统计学意义( 均p 0 0 5 ： 标本置于4 c 环境下，时间对c k 参数k 、a 、m a 无影响( p 0 0 5 ) ，对r 有影响( p 0 0 1 ) ，r 值随标本放置时间的延长而缩短，0 5 h 组与4 h 、6 h 、 8 h 组之间差异均有统计学意义( 均1 9 o 0 5 ) ；标本置于4 c 环境下，时间对k 、m a 。均有影响，k 、m a 参数受4 c 温度作用后，k 值缩 短，m a 。值增大，0 5 h 组与lh 、2h 、4 h 、6 h 、8 h 组之间差异均有统计学意 义( 均p 0 0 5 ) ：标本 置于4 c 环境下，时间对m a m 无影响( p 0 0 5 ) ，对抑制率有影响( p o 0 5 ) ；m a ：从激活的血小板强度 9 4 标本置于2 5 、3 4 、4 ，时间对a d p 各参数的影响：见表2 1 。 标本置于2 5 c ，时间对参数m a 御和抑制率均有影响，m a 憎值随时间的延长而 降低，0 5 h 组与1 h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 组之间差异均有统计学意义( 均p 2 h 变化更为显著。故标本采集在1 - 2 h 内完成对测 试结果影响不明显：标本置于3 4 ，时间对参数m a 肼和抑制率有影响，0 5 h 组与l h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 组之间差异均有统计学意义( 均p o 0 5 ) 。 表2 2 温度对c k 各参数的综合影响( i s ) ( n = 1 3 ) 温度分+ rc i kc i 【q “ 组(min)(min) ( 。) ( r a m ) 2 5 3 4 8 5 1 4 2 4 0 6 5 4 6 8 15 5 9 4 8 7 9 1 3 ” 2 5 + 0 55 3 0 8 4 5 6 3 4 5 4 c7 7 1 6 “ 2 4 4 - 0 65 2 4 9 35 5 2 4 6 军医进修学院硕七学位论文 注：t 表示温度因素，t i m e 表示时间冈素，t , t i m e 表示温度与时间的交互效应， t * t i m e 0 0 5 则不存在交互效应；与2 5 组比较( 料) 表示 p 0 0 1 ，( 木) 表示p o 0 5 ；m a c k ：反应最大血小板强度。 9 6 标本放置8 h ，温度对