林木蛋白质工程总复习.doc

观止矣林木蛋白质工程总复习名词解释定点突变：在已知结构的天然蛋白质分子多肽链内的确定位置上，进行一个或少数几个氨基酸残基的改变，如置换、删除或插入氨基酸。蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质一级结构发生改变的过程。DNA改组技术：在单个基因中引入突变，使结构相关的几种基因进行体外重组，共同进化出一种新的蛋白质。基因融合：不同的基因或者基因片段序列构成一个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后，获得由不同功能蛋白质拼合在一起的新型多功能蛋白。易错PCR：通过改变正常PCR体系中某些组分的数量和质量，随机引入错误碱基而创造序列多样性的DNA序列文库，从而利用PCR技术简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法。熔球态：蛋白质从线形的肽链折叠为特定立体三维结构过程中的过渡态。具有天然二级结构，但三级结构却不完整；比天然态有较多的疏水区域暴露；当熔球态变性到伸展态时，温度跃迁消失。X射线晶体衍射：当一束单色X射线入射到晶体分子时，一部分射线穿过晶体，一部分散射并相互抵销，一部分在某些特殊方向上的X射线产生强衍射，并由与计算机相连的检测器检测，从而计算出原子间的距离、键角、分子的立体结构等。分子筛层析：以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质因所受的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。离子交换层析：蛋白质是两性分子，在一定pH条件下带有电荷，不同的蛋白质带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶的作用力的差别把蛋白分开的层析方法叫离子交换层析。亲和层析：利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。等电聚焦（IEF）：根据蛋白质等电点不同，人们将两性电解质添加到聚丙烯酰胺凝胶中，在电场作用下，不同pH的两性电解质在凝胶中成梯度分布。带有电荷的蛋白质样品在此凝胶中移动，当其移动到与其等电点相同的pH梯度后静电荷为零，在凝胶中不再移动，通过这种方法把不同等电点的蛋白分开。蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白与蛋白、酶与底物、蛋白与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。噬菌体展示技术：最近新兴起的一种基因表达筛选技术，将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白融合，伸展在噬菌体表面，可直接用来检测表达产物的某些活性。简答什么是蛋白质的折叠？答：是一个从一级结构生成三级结构的复杂过程。包括多肽链中两个氨基酸残基的接触、螺旋-链-环的转变、二级结构的初步形成、疏水塌缩、侧链簇集、折叠中间体的形成、脯氨酸的顺反异构等。简述蛋白质分子设计的分类。答：（1）定点突变或化学修饰：在已知结构的天然蛋白质分子多肽链内的确定位置上，进行一个或少数几个氨基酸残基的改变或进行化学修饰，如置换、删除或插入氨基酸。最广泛使用，又叫“小改”；（2）拼接组装设计法：对来源不同的蛋白质结构域进行裁剪、拼接、组装，以期望能转移相应的功能，获得具有新特点的蛋白质。又叫“中改”；（3）从头设计全新蛋白质：从头设计一个全新的、自然界不存在的蛋白质，使之具有特定空间结构和预期功能。又叫“大改”。简述蛋白质的分子生物学改造。答：（1）通过基因突变的方法：包括定点突变法，即在已知蛋白所对应的DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，通过改变基因最终达到改造蛋白质的方法。定向进化法，即在实验室模仿达尔文自然进化选择的关键步骤，如突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。（2）通过基因融合的方法改造：不同的基因或者基因片段构成一个新的杂合基因，经合适的表达系统表达后，获得由不同功能蛋白质拼合在一起的新型多功能蛋白的方法。简述原核生物表达载体的一般特点。答：（1）都具有复制起始点，绝大多数载体利用pBR322或pUC质粒来源的复制起始点，该起点决定了细胞内质粒的拷贝数。（2）都有选择性基因：至少含有一个选择性基因，保证对转化体的筛选和培养过程中受体细胞质粒不丢失。（3）强的、可诱导的启动子：原核生物启动子包括了RNA聚合酶的识别位点和结合位点。（4）强的转录终止序列：有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。（5）核糖体结合位点：位于启动子下游、翻译起始密码子上游，该SD序列结合位点对原核细胞mRNA翻译起始非常关键。（6）适合的多克隆位点：可以将目标基因插入到表达载体；用于构建或改造载体。简述影响热稳定性的因素。答：影响热稳定性的因素有很多，如堆积、寡聚化、氨基酸插入和删除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋倾向、极性表面积、氢键和盐桥。（1）对于同一种蛋白质来说，不是一种因素而是多种因素共同作用导致热稳定性增加。（2）螺旋的稳定性和含量对蛋白质的热稳定性有影响。（3）每种蛋白质都有自己的方式来增加稳定性和保持活性。简述核磁共振测定蛋白结构的原理。答：所谓NMR是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。某些原子是具有磁性的自旋球体，若没有磁场的作用，这些自旋原子核的极性是任意的，在磁场作用下，原子核呈极性排列，与磁场同向（能量低）或反向（能量高）。在一定频率的电磁辐射作用下，能量低的原子核吸收能量而转变方向与磁场方向相反。结合有这些原子的蛋白质放置在一个稳定磁场中，并接受高强度的电磁辐射。在一定频率的电磁辐射的作用下，这些自旋核就会吸收能量从低能级跃迁为高能级。如果外在磁场停止作用，这些原子核重新回到最初态，会发射相同频率的电磁波，这些电磁波可被检测到，通过分析所释放电磁波，就可确定原子核的位置和种类，以及绘制成物体内部的精确立体图像。简述蛋白质的粗分级方法。答：（1）盐析（硫酸铵分级沉淀）：在蛋白溶液中加入大量中性盐，与蛋白争夺水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白分子表面的水膜，从而引起蛋白沉淀，但通常不会导致蛋白变性。（2）有机溶剂分级沉淀：可与水混合的有机溶剂对水的亲和力很大，在水溶液中加入有机试剂会使水的介电常数降低，降低蛋白质分子间的电荷相互作用；另一方面，破坏蛋白质颗粒的水化膜，从而引起蛋白质沉淀。利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。有机溶剂易于去除，但也易于引起蛋白变性。（3）超速离心法：在强大的离心力作用下，蛋白溶液中不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而把溶液和沉淀物质分开，颗粒越小所需离心力越大、离心时间越长。（4）透析：利用半透膜对蛋白溶液中不同分子的选择透过作用，可将蛋白质与其他小分子物质分开。（5）超滤法：利用压力或离心力使溶液小分子物质通过超滤膜，而大分子则被截留，从而把蛋白质混合物分为分子大小不同的两部分。（6）结晶法：当某种蛋白在溶液中由于沉淀剂的作用而聚集沉淀时，有可能形成特定结构的晶体。由于蛋白晶体难于得到，本法只适于特定蛋白的分离纯化。简述酵母双杂交技术原理。典型的真核生长转录因子都含有二个不同的结构域： DNA特异结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，后者可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。只有这两个结构域同时存在时，转录激活因子才能激活基因的表达。将AD与BD分别与待测蛋白（X、Y）构建成融合蛋白，若两个待测蛋白间能发生互作，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子，并激活相应报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可确定待测蛋白分子间是否发生相互作用。论述详述蛋白质的空间结构。每一种蛋白质都有其独特的空间结构，这种三维结构通常被称为蛋白质构象。在多肽链卷曲折叠的过程中会形成不同层次的蛋白空间结构，最终形成具有生物学功能的稳定构象。（1）一级结构：即多肽链中氨基酸残基的排列顺序，是蛋白质最基本的结构，并决定了更高级的结构。（2）二级结构：一段连续的肽单位借助于氢键排列成的具有周期性结构的构象，是多肽链主链局部区域的规则结构，不涉及侧链的构象和与多肽链其他部分的关系。天然蛋白质二级结构主要包括：螺旋、折叠、回折、环肽链、无规则卷曲等。-螺旋：由氨基酸残基围绕一个固定的轴螺旋排列，从N端出发，螺旋上每个氨基酸残基的C=O与后面第四个残基的-NH之间形成H键，每圈螺旋由3.6个氨基酸残基构成，氨基酸残基的侧链伸向外侧。-折叠片层：由几条链构成的层状结构，每条链像一条折叠的纸片，当一股链的C=O与另一股链的-NH以氢键相连并组成片层时形成稳定构象。回折：肽链发生180反向弯曲，有利于蛋白折叠和球状结构的形成。最常见的有转角、转角等。环肽链：当相对稳定的螺旋和折叠组合成蛋白完整的三维结构时，必须有环状肽链即环肽链连接，环肽链具有不同长度和形状，常是蛋白质中有重要功能的结构域。例如：环。无规则卷曲：泛指那些不能被归入折叠片层或螺旋的多肽区段，这些区段没有规则结构，常是酶的活性部位和其他蛋白质特异的功能部位。（3）超二级结构：相邻二级结构组合在一起，彼此互做，形成规则排列的组合体。同一结构模式出现在不同蛋白质中，这些组合体称为超二级结构。（4）结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白的功能单位。（5）三级结构：蛋白多肽链在各种二级结构基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。（6）四级结构：许多蛋白质含有2条或2条以上多肽链，每一条多肽链都有其完完整的三级结构，称为亚基，亚基与亚基之间呈特定的三维空间分布，并以非共价键相链接，这种蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。论述蛋白质分子设计的程序或步骤。答：（1）收集相关蛋白质的结构信息：收集待研究的蛋白一级结构、立体结构、功能结构域及与之相关的同源蛋白质等相关数据。（2）建立所研究蛋白的结构模型：如果PDB或文献报道中有待研究蛋白的三维结构，则直接采用；若PDB中没有收录又未见文献报道，需通过蛋白质X射线晶体学及核磁共振法测定蛋白三维结构，或者通过结构预测法构建该蛋白的三维结构模型。（3）结构模型的生物信息分析：分析待研究蛋白的三维结构特点、功能结构域和分布、结构中存在的二硫键数目和位置等。（4）选择设计目标:确定功能非常重要的位点和区域，尽量选择小的改动，维持原有结构。（5）序列设计：所选序列应尽可能地不同于天然结构的序列，充分考虑氨基酸形成特定二级结构的倾向性。（6）预测结果：选好氨基酸残基后，需通过理论预测方法预测出所设