浅谈高效液相色谱在食品检测中的应用.docx

分析化学期中论文浅谈高效液相色谱在食品检测中的应用浅谈高效液相色谱在食品检测中的应用摘 要: 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，具有高效、高灵敏度、高速、高压、流动相选择范围宽等优点，因此在生物化学、药物及食品卫生领域广泛应用，是现代分离测定的重要手段。本文针对液相色谱在食品检测中的应用进行了总结介绍。关键字：高效液相色谱 食品分析 应用随着经济的快速发展，生活水平的不断提高，人们对食品不再仅仅满足于温饱，而是有了更高的追求安全健康。近年来食品安全逐渐成为备受关注的焦点，食品的种类越来越丰富，同时新的食品安全问题不断涌现，严重危害人民群众的身体健康。我人口众多，环境保护意识差，生存环境及质量不高；水源污染导致食源性疾患的发生；水质污染直接影响海产品的卫生质量；农畜业种植养殖源头污染对食品安全的威胁越来越严重；农药、兽药滥用，造成食物中农兽药残留问题突出；食品中添加不符合食品卫生要求的物质而引起的食物中毒等事件屡有发生。这就需要有一套完整的监测监督机制，建立快速调查食源性疾病和监测食品污染的措施和方法。目前很多新型专用的HPLC仪不断出现，如氨基酸分析仪、糖分析仪、离子色谱仪等相继出现。本文就高效液相色谱（HPLC）技术在食品安全分析中的应用概况作一综述。1. 高效液相色谱的介绍1.1 高效液相色谱法(HPLC)具有的优点高效液相色谱法与其他谱法相比具有以下优点：高分离率(应用10m以下规则均匀的极细颗粒为固定相，所以传质阻抗小，柱效高,一般在11035105 n/m)； 高速(采用2103 3104 kPa的高压输液泵输送液体流动相，使其具有高流速,数分钟至几十分钟可完成试样分析)； 自动化操作，重复性高；高效相色谱柱可反复使用；高灵敏度(广泛使用了高灵敏检测器,只需要试样10-710-2 g)。1.2 高效液相色谱法分类高效液相色谱法按照分离机制可分为以下4 种：1.2.1 液-液分配色谱法（liquid-liquid chromatography)LLC 根据流动相和固定相的极性不同又可分为，正向LLC： 流动相极性固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体（硅胶）表面的游离羟基发生化学反应，从而使固定相与载体键合起来)1.2.2 液-固吸附色谱法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）在吸附色谱中，试样组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。1.2.3 离子交换色谱法(ion exchange chromatography)离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。1.2.4 空间排阻色谱法（凝胶色谱法）试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时，组分分子渗入微孔的程度不同，大分子直接从间隙中越过，首先出柱，分子越小，渗入微孔越深，保留值越大，溶剂分子通常最小，最后流出。主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。2. 高效液相色谱在食品检测中的应用2.1 HPLC在食品营养成分分析中的应用2.1.1食品中碳水化合物的分析食物中的碳水化合物是人体必需的营养素之一,是人体热能的主要来源。HPLC法不仅操作简便,灵敏度高,而且可以同时测定各种糖，国际上已将HPLC法作为酒类糖份含量测定的仲裁法。【1】目前已有：Harrison 等利用石墨化碳柱色谱( GCC) 分离线性分子阱质谱联用检测的手段建立了分离和鉴定果聚糖异构体的液相色谱质谱法( LCMSn)方法【4】。许秀敏等【2】用配有示差折光检测器的HP1100，以乙腈：水 75：25 为流动相；汤丽芬等【3】用Waters NH2 柱，以乙腈：水 84：16为流动相，检测食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等都取得了很好的分析效果；采用高压排斥色谱法也能快速、简便、准确地分析出香菇中的多糖成分。2.1.2 食品中蛋白质与氨基酸的分析蛋白质相对分子质量大，在溶液中扩散系数小、粘度大、易发生变性，这使其色谱分离效果不理想，故准确灵敏地测定食品中蛋白质和氨基酸的含量具有十分重要的意义。已有研究：反相HPLC与各种柱前衍生相结合的氨基酸分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。不仅使氨基酸能在传统的荧光检测器上进行检测，也能在所有HPLC仪都配备的紫外检测器上进行检测。如Atkin 等人1971 年就使用Aminex A5树脂，Li+型，1116的固定相，以柠檬酸钾缓冲溶液（5mg 分子氟化锂，0.1ml/正辛酸和0.5mg/五氯苯酚）为流动相进行淋洗，在紫外检测器上测得蛋白质中13种重要的氨基酸成分。量具有十分重要的意义。于晓瑾等建立了用HPLC测定婴幼儿配方食品中糠氨酸的分析方法，该法采用迪马铂金ODS 色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量分析了21 种婴幼儿配方食品样品中的糠氨酸含量，结果表明糠氨酸的含量在4681467mg /100g，线性相关系数r = 0.9999，精密度RSD为2.23%，加标回收率为96.56 %106.24%，检出限( RSN=3) 为0.38g/mL，检测限( RSN =10)为1.25g /mL5。于淑新等采用Elite AAKC18色谱柱，乙腈/水为流动相梯度洗脱，结果表明奶粉中的羟脯氨酸标准品在0.0410.00mg/L范围内线性相关系数为0.9999，方法检出限为30mg/kg(RSN=10) 6。2.1.3 食品中脂肪酸的分析脂肪酸对人体健康有重要作用，通过测定食品中脂肪酸的含量，可为食品加工、贮存及合理配比等提供必要的数据。段更利7等利用LC-6A高效液相色谱仪，配有化学发光检测器(不锈钢分析柱：150mm4.6mmI.D ；顶柱：30mm4.6mm I.D ；柱填料均为ODS-80TM5 ，日本岛津)，以适当的乙腈与水配比检测出脂肪酸C16、C18、C20，且灵敏度极高，达到fmol 级。张萍8等以60% 0.2mol 磷酸盐甲醇溶液为流动相，pH2.8的条件下，采用线性反相梯度洗脱，同时分离测定出甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、戊酸等种短链脂肪酸。赖春华等采用岛津VP-ODS 色谱柱，建立了分离检测广西黄沙鳖甲鱼油中的二十碳五烯酸( EPA) 和二十二碳六烯酸( DHA) 的高效液相色谱法。测定结果表明: EPA 和DHA 在0. 025 mg /mL0. 15 mg /mL 范围内线性关系良好R2EPA为0. 9991 R2DHA为0. 9995，该法用于检测甲鱼油，回收率EPA为96. 00% 98. 67% ，DHA为92.00%98. 00%9。2.2 HPLC在食品添加剂分析检测中的应用2.2.1 食品中食用色素的检测HPLC 可同时测定多种人工合成色素和天然色素，方法简便，如采用高效液相色谱紫外吸收检测( HPLC-UVD) ，C18柱分离梯度洗脱系统可同时测定新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红和亮蓝等。张珏等采用Zorbax Eclipse XDB-C18柱以甲醇和乙酸铵( 0. 02 mol /L)为流动相进行梯度洗脱分离，经可变波长紫外检测器( VWD) 检测，外标法定量，结果显示亮蓝最低检出质量浓度为0. 12mg / kg10。此外，陈向明等选用了Utimate-C18色谱柱外标校准曲线定量测定果蔬汁饮料中番茄红素的含量，结果表明番茄红素在1. 010 -23.9105 g /L的范围内线性关系良好( r = 0.9999),检出限为6. 3108 g /L11。2.2.2 食品中防腐剂的检测用HPLC法测定防腐剂方法简便、灵敏、准确，其中苯甲酸( 又称安息香酸，BA) 、丙酸( CA) 、对羟基苯甲酸乙酯( EP) 、对羟基苯甲酸丙酯( PP) 和脱氢乙酸均可采用HPLC 法测定，紫外吸收检测器与折光示差检测器( UVD-RID) 串联可同时检测甜蜜素、BA 和CA。方法：采用0. 3% 的盐酸乙醇提取，低温下沉淀蛋白质，水定容离心过滤的前处理方法，可同时测定苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠。目前，谢柏艳等采用此法测定了食品中的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸和糖精钠，结果表明苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸及糖精钠在0. 1 20 g /mL 浓度范围内线性关系良好( r 0. 999 9) ，检出限小于0. 4 mg / kg，加标回收率在92. 6% 105. 4% 之间，重复测定相对标准偏差( RSD) 2. 0%12。王刚等建立了一种用HPLC快速测定酱油及食醋中苯甲酸和山梨酸的方法。方法：用Agillent C18色谱柱，苯甲酸和山梨酸的检测限分别为0. 90 mg / kg 和0. 85 mg / kg，样品加标回收率分别为91. 7% 和98. 7% ，测量结果RSD 为2. 77% 和3. 55% ，该法简单、快速、具有良好的准确度和灵敏度13。2.2.3 食品中甜味剂的检测HPLC法可测定食品中糖精钠、甜味素、甜蜜素、安赛蜜、甘草苷和甜菊苷等多种甜味剂的含量，测定人工合成甜味剂最常用的方法为反相高效液相色谱紫外吸收检测法( RHPLC-UVD) 、阴离子交换色谱法、离子对色谱法，常用的检测器有紫外吸收检测器( UVD) 和电导检测器( CD) ; 色谱柱为C18柱、阴离子交换柱和NH2柱。付大友等采用ZORBAX Eclipse XDBC18色谱柱，以含有0.1%乙酸的乙酸铵缓冲液和甲醇为流动相，定量测定各种白酒中安赛蜜的含量，加样回收率都在95%以上，相对偏差在5% 以下，结果表明安赛蜜的最低检出限为1.8 mg / kg，该方法稳定性好、重复性好、回收率高，用于白酒中低含量合成甜味剂的测定，前处理简单，是一种实用性很强的检测方法14。2.3 HPLC在食品安全性检测的应用2.3.1 食品中农药残留的检测随着农业的发展，农药的使用越来越普及。国家有明确的农药最大残留量标准，超过该值可能对人体造成危害，因此在食品分析中，尤其在水果和蔬菜的农药残留分析中十分重要。HPLC是分离分析热不稳定和难挥发性化合物的有效方法。目前使用的许多高沸点和热稳定性差的农药及其降解产物只能采用HPLC法分离，使用的色谱分析柱常为C18或C8。常用的检测器有紫外检测器( UVD) 、光电二极管阵列检测器( DAD) 、荧光检测器( LIF) 以及极具应用潜力的蒸发光散射检测器( ELSD) 。郑玲等建立了测定蔬菜、水果、茶叶和大豆等10种食品中四溴菊酯残留的高效液相色谱与质谱联用分析方法( HPLC MS /MS ) ，该法采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱，以甲醇为流动相进行梯度洗脱分离，串联质谱在多反应监测( MRM) 模式下测定，基质外标法定量，结果表明四溴菊酯的质量浓度在20 1 000g /L 范围内线性关系良好，相关系数为0. 999 815。2.3.2 食品中兽药残留的检测动物性食品中兽药残留是近几年国际社会研究的公共卫生问题之一，而且越来越受到国内外的普遍重视。王建华16等采用液相色谱电化学法测定了鸡肉中磺胺类药物残留量。检出限为磺胺嘧啶0.2ng，磺胺甲氧哒嗪0.06ng，磺胺甲基异噁唑0.07ng。李谦等采用液相色谱串联质谱法检测牛肉中7种磺胺类药物的残留，结果表明7种磺胺类药物均具有良好的线性关系，相关系数不低于0.998，高、中、低3 档加标回收率在92. 5%100. 6%之间，相对标准偏差为2.0%4.5%，检出限为1.04.5 g /L，该方法具有检测结果准确可靠、简便快速等优点17。2.3.3 食品中霉菌毒素的检测食品中存在多种霉菌毒素，其中黄曲毒素是生活中最为常见的一种毒素，它是食品贮存时由真菌产生的毒素，有强烈的致癌作用。赵宁18等采用高效液相色谱法，使用Agilent1100 色谱柱；在柱温30；乙腈甲醇水（112）为流动相；流速为1.0ml/min；荧光检测器；测出黄曲霉素在花生中的含量，方法重复性的RSD 为0.38%，平均回收率为78.4%。王峰莹19采用甲醇水溶液提取粮食中的黄曲霉毒素，提取液经过过滤、稀释后，用免疫亲和柱净化，以甲醇为流动相洗脱，用高效液相色谱法直接测定。方法重复性的RSD 为1.5%，平均回收率为90%105%。3.1 HPLC在其他食品分析检测中的应用3.1.1 HPLC食品中无机成份分析无机成份是食品的重要成份之一, 无机成份的分析常采用化学法、原子吸收法及离子色谱法。近几年来,也有一些HPLC法测定无机离子的报道。尹江伟等20采用UV/ VIS295 检测器,Prodigy ODS 色谱柱(5um,4. 6mmi . d 250mm) ,反相HPLC法同时测定食品中锌、铜、铅、镉,取得了令人满意的结果。3.1.2 HPLC在维生素分析分析维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类有机化合物, 必须从食物中摄取。利用HPLC仪测定维生素较分光光度法、气相色谱法简单、灵敏、重现性好, 且一次能同时分析多种维生素, 无论是水溶性还是脂溶性维生素, 都能得到很好的分析结果。近年来脂溶性维生素的分析方法发展较快, 由于HPLC技术的广泛应用, 为脂溶性维生素的分析提供了新的途径和方法。食物中此类物质的含量一般在ppm以下,利用HPLC法进行分析更为合适。最常用的检测器是紫外检测器,由于维生素A和E具有荧光性质,故亦常用荧光检测器鉴定。维生素E还可以用电化学检测器。二极管阵列光学检测器(DAD) ,它具有多波长信息和光谱特性,鉴别能力强,在食品分析中具有独特的优越性,可以同时鉴定多种脂溶性维生素。在通常的食品分析中检测脂溶性维生素最常用的鉴定器是紫外检测器, 只要条件选择适当, 往往可以同时分离鉴定多种脂溶性维生素。如Knox利用SAS硅胶柱,水:甲醇:浓硫酸(85 :15 :0. 25) 加0. 1 %十二烷基硫酸钠为流动相,紫外检测器,波长270nm鉴定了维生素B2、B3 和B6。3.1.3 食品抗氧化剂的检测食品抗氧化剂是能阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期的食品添加剂,添加在食品中的抗氧化剂必须用量得当,否则会对人体造成危害。采用RP-HPLC 法测定油炸薯条没食子酸内酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、羟基茴香醚(BHA)、4-已基间苯二酚(4HR)、二丁基羟基甲苯和2246含量。其中PG、TBHQ用50%甲醇(RP-HPLC体积分数1%的冰醋酸) 作流动相，BHA、4HR、BHT和2246用80%甲醇作流动相，检测波长为280nm，相关系数在0.99830.9996。最低检出限为1.02.0g/g，平均回收率均在85%以上。3. 结束语HPLC 是吸纳了经典液相色谱和气相色谱的优点改进和发展起来的现代分析方法，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、食品分析、药物及临床分析。目前在食品安全检测高标准的情况下，HPLC 已被广泛应用于食品分析检测领域，在食品安全中起着越来越重要的作用，为食品安全带来保障。现今科学技术日益更新，高效液相色谱仪不断更新发展，与各种检测技术的联用越来越普遍，包括液相色谱仪( LC) 、质谱仪( MS) 及与核磁共振谱仪的集成( LC-MS-NMR) 、气相色谱液相色谱联用( GCHPLC)、固相微萃液相色谱联用( SPME-HPLC) 、聚焦微波辅助萃取液相色谱联用( FAME-HPLC)等，这些色谱技术的相互结合解决了传统液相检测器灵敏度低和选择性不够的缺点，扩大了检测范围，提高了分析水平，为科学研究提供更精确、可靠的分析结果，并且简化实验步骤，节省样品的准备和分析时间，尤其适合亲水性强、挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子物质，以及食品中残留的微量、痕量有毒有害物质的分离分析，从而进一步提高食品的卫生质量及食品中残留的微痕量有毒有害物质快速准确的分离分析，保障食品安全和人类身体健康，同时促进食品出口等。今后随着食品工业的发展，以及人们对食品安全的关注，加之高效液相色谱分析技术的不断完善和发展，HPLC 必将在食品分析与检测领域得到更加广泛的应用，发挥更重要的作用。参考文献1. 邢亚东.高效液相色谱技术在食品卫生领域的应用. 现代医药卫生,2005,21(5).2. 许秀敏,高燕红. 高效液相色谱法测定食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖的含量J1 中国卫生检验杂志,2002 ,12(5) :55313. 汤丽芬,吴玉珩. 高效液相色谱法测定食品中五种糖的含量J1华南预防医学，2002,28 (3):4014. 戴军 液相色谱在糖类分析中的应用研究进展J色谱，2012，30( 2):1131155. 于晓瑾，邢江涛，仇凯，等 HPLC 法测定婴幼儿配方食品中的糠氨酸J.食品研究与开发，2012，33( 2) : 158 1616. 于淑新，赵连海，王丰琳，等 高效液相色谱法测定奶粉中羟脯氨酸含量J分析仪器，2012( 2) : 26297. 郑天等.高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用技术在食品工业上的应用.南京工业大学学报2004,26(2).8. 段更利,中