（发育生物学专业论文）piggybac转座系统——哺乳动物遗传分析的新工具.pdf

图表目录 图表目录 图1 1不同转座子转座方式的比较 12 图1 2 p b 转座子的结构示意图 2 0 图2 1 检测尸曰在哺乳动物细胞中转座活性的实验流程图 3 0 图2 2 用于在哺乳动物细胞和小鼠体内检测p 曰转座活性的二元转座系统一 3 l 图2 3 在体外培养的哺乳动物细胞中尸曰的整合 3 2 图2 4 在2 9 3 细胞中不同长度p b 转座子的整合效率 3 5 图2 5 在2 9 3 细胞中不同的转座予和转座酶比例下p b 转座子的整合效率一3 7 图2 6 在2 9 3 细胞中带有不同程度缺失末端的朋转座予的整合效率 3 9 图3 1 用显微注射技术介导携带转基因的船转座子转座的实验流程图一一4 5 图3 2 朋在小鼠中的转座提高了转基因的效率 一 4 6 图3 3 尸曰转座介导的转基因在小鼠中的表达一 一 5 3 图4 1 对尸8 在小鼠中整合位点的分析一 一 一5 9 图4 2 船在小鼠生殖细胞中的转座和精确切离 一 6 l 图4 3 利用交配策略在小鼠中诱导单拷贝船转座 图4 4 在小鼠中利用不同报告基因标记尸b 转座子和转座酶 一6 6 图4 5 利用报告基因鉴别p b 插入的杂合子和纯合子 一 6 8 图4 6 雕以阳腓小鼠的突变表型 一一 7 0 图4 7o t g i p b p a j 鼠的突变表型 一 一一一 一7 l 图4 8 p b 在小鼠生殖细胞中的精确切离可回复l t g b 6 p b p a 的突变表型 7 3 图4 9 带有基因捕获元件的尸曰转座子可用于显示内源基因的表达谱 7 5 表1 1 曰转座子可进行转座的微生物和非脊椎动物 表2 i 曰在人类2 9 3 细胞中的转座位点 表2 2p b 在小鼠w 4 1 2 9 s 6 细胞中的转座位点 表3 1p b 在小鼠中的转座位点 表4 1 利用交配策略在小鼠中诱导单拷贝户曰转座的效率 表4 2 利用交配策略在小鼠中产生的新p b 插入 表4 3p b 插入导致一些小鼠的突变表型 2 2 3 3 3 3 4 8 6 3 6 5 6 8 维写表 a c n p v a c t b g h p a c m v e n u e s t f b s g m n p v g r b l 0 i r e s i t g b 6 i t r l 玎q e i l 1 o r f o t g l p b p b a b e p b l p b r p e i 缩写表 f 蜘呐强1 蛔1 1 p o l y h e d r o s i s 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 v i r u s 呦i i ip r o m o t e r b o v i n eg r o w t hh o r m o n e p o l y a d e n y l a f i o ns i g n a l c 3 a o m e g a o v i r u sp r o m o u n e t h y i n i u o s o u r e x p r e s s e ds e q u e n c et a g f e t a lb o v i n es e m m g a l l e r i am e l l o n e l l an u c l e a rp o l y h e d r o s i sv i r u s g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r b o u n dp r o t e i n1 0 i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e i n t e g r i nb 6s u b u n i t i n v e r t e dt e r m i n a lr e p e a t s b 肌动蛋白启动子 牛生长激素多聚腺苷酸加尾信号 巨细胞病毒启动子 乙基亚硝基脲 表达序列标签 胎牛血清 舞毒蛾核型多角体病毒 生长因子受体结合蛋白l o 基因 内部核糖体进入位点 整合素蛋白b 6 亚基 反向末端重复 l o n gi n t e 嘲 e n e dr e p e t i t i v ee l 锄 l 长散在重复元件 1 o p e nr e a d i n gf r a m e o o c y t e t e s t i sg e n el p i g g y b a c p i g g y b a et r a n s p o s a s e t h el e f tt e r m i n a lo f p b t r a n s p o s o n t h en g h tt e r m i n a lo f p bt r a n p o o n p o l y e t h y l e n i m i n e p h o s p h o g l y c e r a t ek i n a s ep r o m o t e r p o l y c y s t i n 2 p r o t a m i n elp r o m o t e r r a b b i t 争g l o b i np o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l r e df l u o r e s c e n tp r o t e i n r n ai n t e r f c r c n c e r m f s en a n s c r j o 虹o i l p c r s p l i c i n ga c c e p t o r s l e e p i n gb e a u t y s p l i c i n gd o n o r s u b t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t s i m i a nr i m s4 0p o l y a d e n y l a t i o ns i g n a l t e r m i n a lr e p e a td o m a i n t u b e r o u ss c l e r o s i sc o m p l e x u n t r a n s l a t e dr e g i o n 6 开放阅读框 卵母细胞一睾丸基因l p b 转座子 p b 转座酶 p b 转座子左末端 p b 转座子右末端 多聚乙酰亚胺 磷酸甘油酯激酶基因启动子 多囊肾病基因2 精蛋白l 基因启动子 兔8 球蛋白多聚腺营酸加尾信号 红色荧光蛋白 r n a 干扰 逆转录p c r r n a 剪接受体 s b 转座子 r n a 剪接供体 亚末端反向重复 猿猴病毒4 0 的多腺苷酸加尾信号 末端重复区域 结节性硬化症基因 非翻译区 a 敷 裟蒜飘一兰黑鬻篡 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外 不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果 其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意 作者签名 论文使用授权声明 日期 本人完全了解复旦大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件 允许论文被查阅和借阅 学校可以公布论文的全部或部分内 容 可以采用影印 缩印或其它复制手段保存论文 保密的论文在解密后遵守此 规定 作者签名导师签名 日期 摘要 人类基因组中约有两万八千个编码蛋白基因 另外还包含了很多尚未定位的 同样行使重要功能的非编码r n a 基因和d n a 调控元件 解读所有这些组分的 功能对于认识人类生物学及疾病具有重大的理论意义和应用价值 小鼠和人有超 过9 9 的基因同源 通过遗传分析方法研究小鼠基因对揭示人类基因功能 发现 疾病相关基因有非常重要的参考价值 然而 传统的基因剔除 e n u 化学诱变 等用于哺乳动物的遗传分析方法效率低 花费大 难以大规模地分析基因功能 转座子已在低等生物中被有效用于大规模地转基因和基因诱变分析 在对酵 母 线虫和果蝇等模式生物的基因功能研究中起了重要作用 然而 由于缺少高 效的转座系统 在哺乳动物中转座子的运用还相当有限 我们改造了一种来源于粉纹夜蛾的d n a 转座子p i g g y b a c 俨动 发现它不仅 能在体外培养的哺乳动物细胞中 而且能在小鼠体内高效转座 我们发现利用 j p 曰转座介导的插入诱变能在小鼠体内有效地破坏基因功能 作为一种基因诱变 工具 曰转座系统的优势在于 1 p b 转座子能在生殖细胞中高效转座 可用简 单的交配策略快速而高效地产生大量可稳定传代的带有单个p b 插入的动物品 系 从而绕过了传统的基因剔除等诱变方法所涉及的胚胎干细胞培养和动物手术 等环节 大大节约了成本 并可实现对没有建立胚胎干细胞系的动物的基因诱变 2 利用反向p c r 可方便地确定p b 插入所在的基因组位置 3 尸曰插入广泛分布 于基因组中 尤其偏好基因区 4 尸口插入能有效破坏内源基因功能 与传统基 因剔除诱变产生类似的表型 5 利用尸四的精确切离可实现对突变表型的回复 从而进一步确定表型和基因的对应关系 6 可在交配过程中引入可见的遗传标记 分别追踪转座子和转座酶 利用报告基因 如红色荧光蛋白基因r 即 可凭肉眼 区分p b 插入的纯合子和杂合子动物 从而提高鉴定基因型的效率 并进一步降 低了成本 7 p b 可与基因捕获技术相结合 借助l a c z 等报告基因显示内源基因 的表达谱 p b 转座系统第一次提供了在哺乳动物基因组水平高效诱变基因的工 具 有助于系统地研究基因功能 与此同时 我们分别在体外培养的哺乳动物细胞和小鼠体内建立了p b 转座 介导的转基因方法 作为一种新的转基因手段 p b 转座系统的优势主要体现在 1 整合效率高 2 负载容量大 可同时携带含有多个基因的大片段d n a3 转基 因可长期稳定地表达 4 转基因以单拷贝形式整合 更易模拟内源基因的表达状 况 5 可用非损伤性的可见标记代替p c r 等传统方法在活体中跟踪转基因 6 易于确定整合位点 因此 p b 转座系统不仅可作为哺乳动物及培养细胞的转基 因工具 也是一种潜在的非病毒类基因治疗载体 我们的实验结果为在哺乳动物和其它脊椎动物中建立一个作为多功能遗传 分析工具的高效转座系统迈出了关键性的第一步 我们希望 曰转座系统的应用 能进一步推动解析哺乳动物基因功能的进程 对人类生物学和疾病研究有所助 益 关键词 p i g g y b a c 船 转座子 哺乳动物 遗传分析 转基因 插入诱变 a b s t r a c t t h eh u m a ng e n o m ec o n s i s t so fa b o u t2 8 0 0 0p r o t e i nc o d i n gg e n e s n u m e r o u s s m a l lk n a g e n e sa n dl a r g ep i e c e so fd n a w i t hr e g u l a t o r yo ru n k n o w nf u n c t i o n s u n d e r s t a n d i n gt h ef u n c t i o no f a l l t h e s ee l e m e n t si sc r i t i c a lt ol e a r nt h eh u m a nb i o l o g y a n dd i s e a s e s h o w e v e r t r a d i t i o n a lg e n e t i cm e t h o d ss u c ha sg e n ek n o c k o u to re n u m u t a g e n e s i s a r ee i t h e ri n e f f i c i e n to rp r o h i b i t i v e l ye x p e n s i v et ob eu s e df o rl a r g e s c a l e f u n c t i o n a la n n o t a t i o no f t h em a m m a l i a ng e n o m e t r a n s p o s a b l ee l e m e n t sh a v eb e e nw i d e l yu s e da st o o l sf o rt r a n s g e n e s i sa n d i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i si nl o w e ro r g a n i s m s i nc o n t r a s l 伽可h a v e n tb e e nc o m m o n l y a p p l i e di nm i c ea n do t h e rm a m m a l sd u et ot h el a c ko fa ne f f i c i e n tt r a n s p o s i t i o n s y s t e m w eh a v em o d i f i e dp i g g y b a c ad n at r a n s p o s o nf r o mt h ec a b b a g el o o p e r m o t ht r i c h o p l u m an i a n ds h o w e dt h a ti tc a ne f f i c i e n t l yt r a n s p o s ei nc u l t u r e dh u m a n a n dm o u s ec e l l sa sw e l la si nm i c e w es h o wan u m b e ro ft e c h n i c a la d v a n t a g e so f p b a c t i n ga sam u t a g e n e s i st 0 0 1 e f f i c i e n tp bt r a n s p o s i t i o ni ng e r m l i n ea l l o w sr a p i d g e n e r a t i o no fm u t a n ta n i m a l sb ys i m p l ec r o s s i n g t h i sn o to n l yb y p a s s e se x p e n s i v e a n dt e c h n i c a l l yd e m a n d i n gm a n i p u l a t i o n ss u c ha se sc e l lc u l t u r ea n da n i m a ls u r g e r y w h i c ha r er e q u i r e df o rc l a s s i c a lg e n ek n o c k o u tm e t h o d b u ta l s om a k e si tp o s s i b l et 0 m u t a t eg e n e si nm a m m a l i a ns p a c i e sw i t hn oe s t a b l i s h e de sc e l ll i n e s p bi n s e r t i o n s c a nb ee a s i l ym a p p e db yi n v e r s ep c r w h i c hm a k e si te a s i e rt ot r a c km u t a t i o n st h a n c h e m i c a lm u t a g e n e s i s p bt r a n s p o s o nf a v o r st oh i t g e n e sg c o o m e w i d e l ya n d e f f e c t i v e l yd i s r u p t st h e i rf u n c t i o n m e a n w h i l e p r e c i s ee x c i s i o no f p b a l l o w sr e l i a b l e c o n f l m a t i o no f g e n e f o n c t i o nr e l a t i o n s h i pb yr e v e r t a n t a p p l i c a t i o no f v i s i b l em a r k e r s i nt h ep bs y s t e ma l l o w su st od i s t i n g u i s ha n i m a l sw i t hd i f f e r e n tg e n o t y p e sw i t h o u t p e r w h i c hf u r t h e ri n c r e a s e sm u t a g e n e s i se f f i c i e n c y p bc a na l s ob eu s e df o rg e n e t r a ps t u d i e s t or e v e a l e x p r e s s i o np a t t e r n so fe n d o g e n o u sg e n e s a sar e s u l t p b m e d i a t e di u s e r t i o n a lm u t a g e n e s i sp e r m i t sf o rt h ef i r s tt i m et h ee f f i c i e n tp r o d u c t i o no f m o t l l m u t a n t sf o rs y s t e m a t i c a lf u n c t i o n a la n a l y s i so f t h em o u s eg e n o m e a tt h es a n l et i m e w ed e v e l o p e dp b m e d i a t o dt r a n s g e n i cs y s t e mi nc u l t u r e d m a m m a l i a nc e i l sa n di nm i c e p bc a nc a r r yl a r g ep i e c e so fd n aa n de f f i c i e n t l y i n t e g r a t ei n t ot h eh o s tg e n o m e l a r g ec a p a c i t ya l s oa l l o w sp bv e c t o rt oc a r r yav i s i b l e m a r k e ra l o n gw i t ht h et r a n s g e n e w h i c hm a k e si te a s i e rt oi d e n t i 黟t h eu a n s g c o i c a n i m a l t h et r a n s g e n e sc a r r i e db yp be x p r e s ss t a b l ya m o n gg e n e r a t i o n s p b t l a n s p e s o n si n t e g r a t ea ss i n g l ec o p i e s w h i c hn o to n l ym i m i ce n d o g e n o u sg e n e s b u t 3 a b s t r a c t a l s oa l l o we a s ym a p p i n go ft h ei n t e g r a t i o ns i t e s a l l t o g e t h e r p bs y s t e ms a v 嚣a s 锄 a t w a c t i v et r a n s g e n i ct o o lb o t hf o rc u l t u r e dm a m m a l i a nc e l l sa n df o rl i v i n ga n i m a l s i t c a l la l s ob ec o n s i d e r e da san o n v i r a lv e c t o rf o rg e n et h e r a p y o u rd a t ap r o v i d eaf i r s ta n dc r i t i c a ls t e pt o w a r d sah i g h l ye f f i c i e n tt r a l l s p o o l l s y s t e mf o rav a r i e t yo fg e n e t i cm a n i p u l a t i o n si nm a m m a l s w eh o p ea p p l i c a t i o n o f t h ep bs y s t e mw i l ia c c e l e r a t ef u n c t i o n a la n n o t a t i o no ft h em a m m a l i a ng e n o m e a n d w i l lb e n e f i tt h es t u d yo f h u m a nb i o l o g ya n dd i s e a s e s k e yw o r d s p i g g y b a c 册 t r a n s p o s o n m a m m a l g e n e t i ca n a l y s i s t r a n s g e n e s i s i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s 4 第一章引言 第一章引言 1 1 利用遗传分析方法研究哺乳动物基因功能 2 0 0 1 年 在多国科学家的共同努力下 人类基因组序列图宣告完成 l a n d e r e t a 1 2 0 0 1 v e n t e re ta 1 2 0 0 1 这无疑是生命科学发展史上的一个里程碑式的事 件 它使我们第一次有机会系统性地了解人类基因的碱基序列 进而利用不同的 数学算法推测以前未知的基因 l a n d e re t a l 2 0 0 1 v e n t e r e t a l 2 0 0 1 然而 摆 在我们面前的是一个更大的问题 人类的每个基因各行使什么功能 完成对 基因组中各基因功能的解析 能使我们从分子水平上理解人类正常的发育过程及 疾病机理 从而更有针对性地开发预防和治疗疾病的手段 进一步提高人类的生 活质量 遗传学研究是了解基因功能最有效的方法之一 人类遗传学研究直接在病人 及其家属中筛选疾病基因 因此它是了解人类基因 尤其是疾病相关基因功能的 重要手段 但这种方法所需时问长 研究费用巨大 带有重要疾病相关基因的突 变家系也可遇不可求 由于社会伦理等方面的限制 许多实验无法在人体内直接 进行 这些困难限制了此方法的广泛应用 在模式动物中研究基因功能是世界生物医学界更为普遍的做法 小鼠 m u s m u s e u l u s 是哺乳动物中重要的模式生物之一 对小鼠基因组测序的结果表明 9 9 的人类基因在小鼠中具有同源基因 且人和小鼠的基因组在基因的结构 表 达谱以及相对排列上都具有高度的保守性 w a t e r s t o ne ta 1 2 0 0 2 很多研究显示 小鼠与人在包括发育过程 分子信号传导调控 解剖学构造以及生理和行为特征 等很多方面都非常相似 k i l ea n d h i l t o n 2 0 0 5 更为重要的是 将小鼠中很多与 人类致病基因同源的基因突变后 突变小鼠可显示出很多与病人相似的表型 上 述实践证明了人类和小鼠同源基因很可能行使相似的生理功能 因此 通过遗传 分析研究小鼠基因对揭示人类基因功能 发现疾病相关基因有非常重要的参考价 值 1 1 1 基因诱变 基因诱变技术是在模式动物中研究基因功能最常用的的遗传分析方法之一 它通过破坏动物基因组中内源基因的正常表达 根据所引起的异常表型 推测被 突变基因在正常生理状态下的功能 一般可将基因诱变分为定点诱变和随机诱变 两大类 二十年前利用同源重组原理在小鼠胚胎干细胞中开发的基因剔除 k n o c k o u t 技术作为一种定点诱变技术已成为目前在小鼠中最常用的诱导突变方法 t h o m a s 7 第一章引言 a n dc a p e c c h i 1 9 8 7 基因剔除可以特异地破坏某个基因的活性 特别适用于对 已知序列的基因进行功能研究 传统的基因剔除 c o n v e n t i o n a lk n o c k o u t 不可逆地 在整个个体破坏目的基因 而条件性基因剔除 c o n d i t i o n a lk n o c k o u t 可以在特定 组织和特定发育阶段失活目标基因 我们大量的关于小鼠基因功能的了解都来源 于基于基因剔除技术产生的小鼠模型 然而 基因剔除载体的构建 小鼠胚胎干 细胞的培养和转染以及把胚胎干细胞培育成小鼠的过程不仅对设备和技术有较 高的要求 还要花费大量的时间和金钱 小鼠的遗传背景也是一个困扰人的问题 因为遗传背景的不同可能对表型分析产生干扰 d a v i ee ta 1 2 0 0 7 现在最常用的 小鼠胚胎干细胞是源于1 2 9 s v 小鼠品系的 而最常用于表型分析的是a 冶 盯 小鼠品系 如要将突变从1 2 9 s v 品系回交至c 5 7 b l 6 j 品系 又需要花费大量额 外时问 以上原因大大制约了使用基因剔除技术研究基因功能的效率 而且到目 前为止 只有小鼠一个物种建立了可在体外培养的胚胎干细胞系 这也限制了基 因剔除技术在其它哺乳动物中的推广 化学诱变 c h e m i c a lm u t a g e n e s i s 是用于哺乳动物的随机诱变方法之一 化学 诱变剂乙基亚硝基脲 e t h y l n i t r o s o u r e a e n u 已被用于在小鼠中进行大规模的基 因突变筛选 h a r r o nc ta 1 2 0 0 2 h r a b ed ea n g e l i s e ta 1 2 0 0 0 n o l a ne ta 1 2 0 0 0 由 于e n u 的突变效率很高 一般只需筛选1 0 0 0 只左右小鼠即可找到某个特定基因 的突变 c o n c e p d o n e ta 1 2 0 0 4 因此在e n u 筛选中可以方便地破坏基因 从 而得到很多不同类型的异常表型 但是大多数情况下 e n u 造成的突变是单碱 基突变 需要通过定位克隆来获得产生某一异常表型的突变的基因 相当费时费 力 虽然一些新技术 如高通量且低成本的测序技术 s m i t se t a l 2 0 0 6 可以提高 突变基因定位的效率 但要利用该方法大规模获得小鼠基因的功能信息仍会是一 个漫长的过程 插入诱交 i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s 是另一类在哺乳动物中常用的随机诱变方 法 插入诱变通过将一段d n a 插入基因 达到破坏基因功能的目的 由于插入 的d n a 片段本身可以作为分子标记 因此很容易定位突变在基因组中的位置 同时 在插入的d n a 中可以设计一些功能元件 从而实现基因捕获 g e n et r a p 启动子捕获 p r o m o t e rt r a p 和染色体重组 c h r o m o s o m er e a r r a n g e m e n t 等很多化学 诱变所无法完成的遗传操作 c a r l s o na n dl a r g a e s p a d a 2 0 0 5 逆转录病毒介导的插入诱变已在小鼠胚胎干细胞中 f r i e d r i c ha n d 8 0 r i a n o 1 9 9 1 s k n m e se ta 1 1 9 9 2 得到应用 在过去的十几年中 有多种类型的病毒载体 被应用于大规模的小鼠基因诱变筛选q 3 h a n s e ne ta 1 2 0 0 3 m i t c h e l le ta i 2 0 0 1 s c h n u t g e ne ta 1 2 0 0 5 国外很多科研院所和生物技术公司共同努力下建立了大 量带有病毒载体插入突变的胚胎干细胞系 覆盖了6 0 0 6 的已知小鼠基因 第一章引言 h 卸 w w w i g t c c a 虽然这些突变细胞株提供了基因功能研究的宝贵资源 但 要进行表型分析 还必须把它们培育成小鼠 代价高昂 另外 逆转录病毒在整 合入基因组时存在热点 它能否有效地插入其余的小鼠基因中 仍有待考察 以上提及的基因诱变方法中 基因剔除属于反向遗传学方法 反向遗传学是 一种研究已知序列基因功能的有效方法 它从特定基因出发 通过改变基因的表 达而造成突变表型 以此研究基因的功能 但此类方法对于基因组序列中未标注 的基因或功能元件无能为力 现在已标注的小鼠的蛋白编码基因只有两万八千个 左右 其编码序列仅占整个基因组的1 5 左右 而最近越来越多的报道显示 a r a v i nc ta 1 2 0 0 6 g i r a r dc ta 1 2 0 0 6 h u t v a g n e ra ta 1 2 0 0 1 基因组中的转录区 域远比预计的多 如最近发现的p i w i 互作r n a p i w i i n t e r a c t i n gr n a p i r n a 就有 大约五万种之多1 这些非编码r n a 基因和其它很多d n a 调控元件都具有非常 重要的功能 但显然无法用反向遗传学方法对尚未定位的基因或重要调控元件进 行研究 而且 由于现有对基因结构和功能关系的认识还相当有限 难以通过序 列准确预测基因的功能 实践证明 即便通过体外生化或细胞学实验找到一些可 能有重要功能的基因 在小鼠中剔除后 仍有约5 0 的突变体无法显现突变表型 另外 实验者一般会有选择性地对感兴趣的基因进行剔除 而往往忽视那些除序 列外没有任何信息的新基因 但正是这些基因的突变 可能会产生意想不到的表 型 从而为我们带来新的生物学知识 与反向遗传学相对应 正向遗传学从突变表型出发 找到造成表型的突变基 因 进而研究被突变基因或调控元件的功能 以上提及的以自发突变表型 包括 疾病 为出发点的人类遗传学和以化学或生物学手段引发的突变表型为出发点的 随机诱变都属于正向遗传学方法 与反向遗传学相比 正向遗传学不需要任何基 因序列信息作为突变的先决条件 由于突变是随机的 往往会发现很多意想不到 的基因与突变表型的联系 从而开拓全新的研究领域 因此 利用正向遗传学方 法在基因组水平进行系统性地诱变筛选是更强有力的研究基因 尤其是未定位基 因与重要调控元件功能的遗传分析手段 由于现有的基因诱变方法的局限性 过去二十年中真正被破译了功能的小鼠 基因仅占全部已知序列基因的约1 0 a u s t i ne ta 1 2 0 0 4 若加上那些尚未定位 的基因和调控元件 这个比例其实更低 因此 我们需要开发新的遗传分析工具 它应能在基因组内系统高效地产生突变 并允许人们快速识别突变基因 且最好 能广泛适用于各种哺乳动物 9 第一章引言 1 1 2 转基因 转基因是将携带基因的d n a 片段导入基因组中的方法 通过观察由转基因 产生的生物体的表型改变 我们可以获得相关基因的功能信息 另外 转基因技 术还可用于改良生物体的性状 有巨大的经济价值 在哺乳动物细胞或动物体内最常用的转基因方法是将线性化的携带外源基 因的d n a 通过脂质体 电穿孔或显微注射等手段导入细胞中 使d n a 通过至 今仍未研究十分清楚的机制随机整合入基因组中 这种方法有很多缺点 1 整合 效率低 因此在大多数哺乳动物中用此法不能高效地培育转基因动物 2 多数情 况下线性化的d n a 会形成多拷贝的串联重复 即多联体 c o n c a t a m e r 其很难模 拟内源基因的正常生理状况 3 多联体在传代时不同转基因拷贝间易于发生重组 而造成缺失 d e l e t i o n 或由于甲基化修饰影响转基因的稳定表达 4 f 1 3 于利用此 方法很难确定转基因插入所在基因组中的位置 因此也无法对插入位点附近的染 色体环境作出评估 与单纯的线性化d n a 相比 病毒载体能使转基因更高效地整合入基因组 但其主要不足在于 1 负载容量小 即所能携带外源d n a 片段的长度有限 2 宿主也会对病毒进行甲基化修饰 使转基因表达静默 3 制备病毒操作繁琐 4 虽然用于转基因的大多是复制缺陷型病毒 但安全性仍是一个需要警惕的问题 因此 在哺乳动物中也需要开发新的整合效率高 负载容量大和使用安全方 便的转基因方法 第一章引言 1 2 转座子及其在哺乳动物遗传分析中的应用 1 2 1 转座子是一种多功能的遗传分析工具 转座子 r a n s p o s o n 是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因 子 其变更插入位置的过程被称为转座 t r a n s p o s i t i o n 根据转座方式的不同 转 座子可分为d n a 转座子 d n au a n s p o s o n 和逆转录转座子 r e t r o u a n s p o s o n 两大 类 d n a 转座子的转座遵循 切离一粘贴 c u t a n d p a s t c y 机制 即在转座酶 0 r a n s p o s a s c 的催化下 d n a 转座子从原始位置切离并插入到新的基因组位置 图 1 1 a 逆转录转座子采用 复制一粘贴 c o p y a n d p a s t e 机制进行转座 即原始 的转座子d n a 保持不动 仅转录出r n a 分子作为中间体 r n a 分子在转座子 编码的逆转录酶的催化下逆转录成d n a 并在转座子编码的整合酶的作用下插 入到新的基因组位置 图1 1 b 自从b a r b a r am c c l i n t o c k 在玉米中发现了第一个转座予以来 m c c l i n t o e k 1 9 5 转座子被发现存在于大多数的微生物和动植物类型中 从噬菌体到线虫 到昆虫和人 再到玉米和水稻 这些生物的基因组中都留下了转座子的足迹 转 座子占人和小鼠基因组序列的4 0 以上 l a n c e re t a l 2 0 0 1 w a t c r s t o nc c a l 2 0 0 2 这些都表明转座子及转座事件在基因形成和物种进化中的重要性 除了重要的理论研究价值外 转座子作为遗传分析工具在基因功能研究领域 也有很大的应用价值 它不仅能作为转基因工具 将外源基因导入受体基因组 同时 其又因为能通过随机的插入诱变使内源基因失活而成为正向遗传学研究中 的宠儿 在原核生物中 用转座子插入诱变的方法发现了很多微生物致病相关的重要 基因 h u t e h i s o ni i ie t a l 1 9 9 9 v i l e nc t a l 2 0 0 3 在非脊椎动物中 很多不同的转 座予介寻的插入诱变已被作为大规模遗传筛选的工具 它们为解析多种模式生物 中基因的功能作出了巨大的贡献 这其中包括用于酿酒酵母 s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 的t n 3 和t n 7 转座子 k u m a rc ta i 2 0 0 4 r o s s m a c d o n a l de ta 1 1 9 9 9 用于秀丽隐杆线虫 c a e n o h a b d i t i se l e g a n s 的t c l 转座子 z w a a l c ta 1 1 9 9 3 和用于 黑腹果蝇 d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 的p 因子 c o o l e ye ta 1 1 9 8 8 r u b i na n d s p r a d l i n g 1 9 8 2 等 第一章引言 a b m t t a t a c a g t a 一o r 一 t a c t g t a t u n e l p i g g y b a c 州磬三童耖t a 扣一 一m 雌簿 秒7 a 一 t tt t a a t s o 穿 叮s 叫 墨i 壁 l 堡壁i 坠 l a t n t s 砚 图1 1 不同转座子转座方式的比较 d n a 转座予的 切离一粘贴 转座方式 图示s l e e p i r i gb e a u t y 鲫转座子 左 和 p i g g y b a c 脚转座子 右 的转座过程 空心双箭头代表转座子 其内的字母代表 转座子的末端碱基 0 对逆转录转座子的 复制一粘贴 转座方式 图示l i n e 心力逆转录转座子的转座过 程 空心方框代表i n a 带阴影的方框代表r n a u t r 非翻译区 u n t r a n s l a t e dr e g i o n t s d 插入目标位点重复 t a r g e ts i t ed u p l i c a t i o n n 多聚腺苷酸 实线代表转座子的原始插入位点附近的d n a 虚线代表转座子的新插入位点附近的d n a 椭圆形代表转座中所需的酶类 s b i o s b 转座酶 p b a s e p b 转座酶 6 强核苷酸内切酶 e n d o n u c l e a s e r t 逆转录酶 r e v e r s et r a n s c r i p t a s e 1 2 汩屉 第一章引言 以p 因子为例 它作为遗传分析工具在果蝇中的应用被视为现代果蝇遗传学 的基础 果蝇也因此成为使用最方便的遗传学模式生物之 b e l l e ne ta 1 2 0 0 4 c o o l e ye ta 1 1 9 8 8 s p r a d l i n ge ta 1 1 9 9 5 果蝇转基因技术依赖于p 因子作为载 体 果蝇也因此成为多细胞模式动物中唯一能方便地获得单拷贝转基因的动物 果蝇基因插入诱变研究的成功也与p 因子等转座因子密不可分 作为果蝇基因组 计划的一个组成部分 7 0 0 6 以上的果蝇基因已有p 因子或其它转座因子的插入突 变 由此获得的突变体果蝇品系库已得到广泛应用 在研究单个基因时 研究人 员可以向品系中心索要该基因的突变体进行功能分析 在定位化学或辐射诱导的 基因突变时 研究人员可以利用该区域已有的p 因子插入诱变品系进行互补测验 来确定新突变影响的基因并定位突变所在的具体位置 由于转座因子可以在转座 酶的诱导下从插入位置上离开 切离 研究人员也可以由此诱导特定基因插入突 变的回复突变 从而验证基因功能 p 因子切离时有一定频率的不准确切离发生 研究人员可以由此获得相应基因的缺失突变 许多插入诱变品系中的p 因子携带 了l a c z 报告基因 v a e s s i ne t a l 1 9 9 1 w a g n e r b e m h o l z e ta 1 1 9 9 1 研究人员可 以通过 基因捕获 g e n et r a p 研究相应基因的表达状况 利用 增强子捕获 e n h a n c e r u a p 或 启动子捕获 p r o m o t e r t r a p 寻找在特定组织或细胞中的表达调 控元件 并可利用 蛋白质捕获 p r o t e i n a a p 搜索未知蛋白的编码区域 许多插 入诱变品系中的p 因子携带了u a s g a l 4 诱导表达系统 研究人员也可以由此 表达特定的基因 研究人员还可以从品系中心得到整个p 因子诱导的且插入位 点都已确定的突变体果蝇库 对特定表型进行遗传筛选 而不必重新诱变并定 位基因 此外 通过p 因子插入还发现了1 2 0 0 多个以前未预测到的果蝇基因 又一次显示了正向遗传筛选的独特优势 转座子在哺乳动物遗传分析中的应用在很长一段时间内都是空白 造成这一 现象的原因主要有二 第一 虽然哺乳动物基因组的很大比例都由各种类型的转 座子组成 但它们中的绝大多数都已失活 这很可能与高等动物体内发展出的对 转座子活性的抑制机制有关 s l o t k i na n dm a r t i e n s s e n 2 0 0 7 长期以来未发现保留 有转座活性的d n a 转座子 发现的少数有活性的逆转录转座子也因活性太低而 无法达到用于遗传分析的要求 第二 将在非脊椎动物中具有高活性的转座子移 至哺乳动物中的尝试并不成功 因为大多数转座子的转座需要宿主细胞提供特异 宿主因子的协助 因而转座具有宿主特异性 在新的宿主中转座子很可能丧失活 性 p 因子就是一例 h a n d i e re ta 1 1 9 9 3 直到最近的十年 一些在哺乳动物中有活性的转座系统才通过不同的方法被 开发出来 尽管它们在应用中还存在很多问题 但毕竟让我们看到了利用转座子 在哺乳动物中进行遗传分析的曙光 1 3 第一章引言 1 2 2 在哺乳动物中有活性的转座子及其应用中存在的闯题 1 2 2 1s l e e p i n gb e a u t y 毋 s b 是第一个被证明在哺乳动物细胞中有转座活性的d n a 转座子 它属于 t e l m a r i n e r 转座予超家族 该超家族是目前发现的自然分布最广的d n a 转座子 家族 其成员存在于纤毛虫 c i l i a t e 真菌 f u n g i 植物和动物的基因组中 p l a s t e r k e ta 1 1 9 9 9 1 9 9 7 年 i v i e s 等基于积累的系统发生学数据 利用生物信息学的 手段对存在于鲑鱼 s a l m o n 中的一个已失活的的转座系统进行了分子水平的重 建 唤醒了其转座活性 i v i e se ta 1 1 9 9 7 由于该转座系统已在水下 沉睡 了一 千万年 因而被取名为 睡美人 s l e e p i n g b e a u t y 船转座系统包括两个组分 转座子和转座酶 s b l o 其中转座子带有转座 所必需的顺式的d n a 序歹d c s e l