海洋细菌的分离与培养5.doc

海洋细菌的分离与培养 制药工程 王 凯指导教师 曲田丽摘要：本文自青岛城阳区海西村海域距离海岸50m处采集海泥和海水样品，采用平板稀释分离方法进行海洋细菌分离，共分离出4种海洋细菌分别为X1、X2、X3、X4。再以6种病原细菌，6种病原真菌为供试靶标菌进行生物活性测定，结果表明，所分离的海洋细菌X4对番茄早抑病菌抑菌效果最好，最高抑菌率达84.7%。关键词:海洋细菌；分离；培养；活性测定Isolation and Cultivation the Marine Bacteria Pharmaceutical engineering Wang kai Tutor Qu TianliAbstract: The mud and sea water of this experiment was come from the city of Haixi Village of Chengyang Qingdao sea，where away off the coast 50m, then use separation-plate -dilution method and flat culture isolated four species of bacteria. Then use six bacteria, six fungi as the bacteria tested target for bacteria bioassay. At last the marine bacteria had best effect on Alternaria solani,the inhibitory rate was 84.7%. Key word: Marine bacterium; Separation; Raise; Active determination 1 引言1.1农药的研究现状20世纪，人工合成的化学物质已遍及人类生活的各个角落，化学合成药剂成为药物的主流，合成药剂的出现，天然产物药剂被冷落了很多年，但实践证明，化学合成作为发现新药的工具目前存在这很大的局限性，如在新药的研发中筛选物质比较盲目、能源消耗大、药剂毒性大、作用单一、抗菌谱窄以及残留量大和造成环境污染等问题，它们虽然对人类的生活和健康做出了巨大的贡献，但也让人类为此付出了沉重的代价。与此同时，近年来制药工业新药产出率持续低落。随着人们对生态农业和环境意识的提高，化学防治的种种弊端已越来越引起人们的关注，同时随着人类发展观可持续发展以人为本，消费观注重提高生活质量，医疗保健观-整体上提高自身免疫力的发展变化，特别是伴随绿色革命回归自然的时代到来，人们对药剂的选择有了重大转变，并已开始认识到充分利用天然物质是最佳选择。天然产物在新药发现中占有非常重要的地位。 我国农业部农药检定所颁布的农药登记资料要求中与生物防治有关的农药种类包括：（1）生物化学农药:主要包括信息素、激素、天然植物生长调节剂和昆虫生长调节剂、酶等；（2）微生物农药:自然界存在的用于防治病、虫、草、鼠害的真菌、细菌、病毒和原生动物或被遗传修饰的微生物制剂；（3）转基因生物农药:指防治农药管理条例中所述的有害生物或调节植物抗逆性、抗除草剂的利用外源基因工程技术改变基因组构成的农业生物。其登记有特殊要求；（4）天敌生物农药:指商品化的除微生物农药以外具有防治农药管理条例中所述的有害生物的生物活体。其中微生物农药是目前发展最为迅速的生物农药之一，在农业生产中得到日趋广泛的重视和推广应用1。1.2海洋微生物在农药中的应用1.2.1海洋微生物的研究进展浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，海洋生物有49个门类，至少16万种以上。海洋生物资源的最大特点在于它能够通过生物个体的繁殖、发育、生长和新老交替，使资源得到更新、补充，具有一定的自我调节能力。因而有人称它为“再生性资源”或“可补性资源”。海洋的面积占地球面积的71%。海洋独特的自然条件:高压、低营养、无光照、局部高温、高盐等,使得海洋微生物具有特殊的代谢途径和遗传背景,从而具有产生特殊结构和功能活性物质的能力2。据研究发现,约27 %的海洋微生物都能产生抗菌活性物质;从海洋真菌分离出的次级代谢产物70 %80 %具有生物活性。许多海洋微生物能产生新结构的活性物质。Koyama 等从一株未鉴定的海洋真菌中得到一种新的二萜: Phomactin H；Robert等从海洋来源的真菌Aspergilla us carneus 的代谢产物中分离到7种活性化合物,其中5种是新化合物(aspergillicins A-E)3。目前,在海洋微生物及其代谢产物中发现了许多特异、新颖、结构多样、陆地微生物很少产生的活性物质,有些物质的结构类型在陆生生物中从未发现过,因此海洋微生物成为又一个具有巨大开发潜力的天然药物宝库。海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力，目前已从海洋微生物(包括海洋细菌、海洋细菌和海洋放线菌)中分离到许多海洋生物活性物质，这些物质化学结构丰富多样，许多分子结构新颖独特，是陆地生物所不具有的。因此，人们对从海洋环境中极其多样性的微生物中开发到新的特效药寄予极大的希望。对海洋细菌的分离与培养研究，能发现几种具有生物性的农药先导化合物，为后期的农药新品种的研发奠定基础4。海洋生物目前还属于一块新开发的领域，是未来人类获取药物的一个重要来源，海洋细菌作为一个重要分支，其发展潜力巨大。浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，目前的研究表明，海洋微生物不仅在海洋生态环境和物质循环中具有及其重要的作用，也是各种新型生物活性物质的潜在来源。海洋微生物的开发，极其关键的一步就是将特定环境里的资源菌株分离出来。1.2.2进行海洋微生物分离培养研究的意义 微生物对抗生素的耐药性是治疗人类细菌性疾病的一大难题。寻找更为有效的抗生素成为各国研究者的研究热点。目前，海洋以其独特的生境条件成为新抗生素的重要来源。国外在上世纪四十年代就开始了对海洋微生物抗菌活性物质的研究，50年前从海洋生物中发现并成功研制了第一个新抗生素头抱菌素，开创了开发海洋新抗生素的先河。近几年，由于海洋生物技术的发展，从海洋生物中提取的抗感染活性物质更是层出不穷。日本学者发现约27%种属的海洋微生物具有产抗菌活性物质的能力；还检测了海洋微生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母等8种细菌和真菌的抑菌作用，结果发现，海洋中14.1%的细菌、44.0%的防线菌，0.5%的真菌具有不同的抑制作用5。研究海洋微生物的培养与分离不仅可以为人类提供更多更好的物质来源，还可以为人类的医药事业作贡献。现代化生物技术在海洋微生物多样性研究中的应用，克服了传统分离培养方法的限制。同时，也应看到，现代生物技术不仅所需费用较高，而且方法本身还存有不足，已有研究表明，纯培养条件下得到的微生物的测序结果与直接对样品检测的结果相差很大。因此，在对利用现代生物技术所取得的结果进行理论探讨时，应该时刻考虑到方法的代表性和稳定性。同时，还应对传统的微生物分离培养得到的结果，做出了合理的判断和解释，只有这样，才能寻找更好的分离培养的方法。近来，我们发现海洋微生物的资源的开发与利用更有助于医药、农药的发展。资源比陆生生物丰富的多，投资发展海洋微生物科技,可能会产生新的化合物,对药物开发具有重要意义。陆源天然产物一直以来是人类丰富的药物资源，但随着对陆地资源的深入研究，从中发现新的药物先导化合物已变的越来越困难，而传染性病菌对传统抗生素的抗药性正在迅速发展，特别是新病原菌和新病毒不断出现，因此人们逐渐把注意力转向一个尚未开发的巨大天然资源宝库海洋，特别是对从海洋微生物中找到新的特效药物寄予极大的希望。1.3 海洋细菌在农药中的开发和应用目前，已知的大多数生理活性化合物的产生是菌株特异的，故可直接培养分离到的菌株以取得新生理活性化合物。对新药的开发而言，从海洋细菌中筛选具有活性的菌株是一项重要的前期工作，而对海洋细菌的分离培养就是前期工作的关键。由海洋细菌代谢物提取的农药，抗菌谱广、毒性低，有极好的防治效果，是一种无公害的农药，具有很大的发展前景。海洋细菌及其代谢产物中寻找控制病原菌的生物农药成为新农药研究的一个重要方向。在农药开发研究方面国外科学家取得了不少进展如Capon等从澳大利亚维多利亚西南海岸附近海滩采集到的样本中分离到海洋放线菌MST-MAl90，从其培养液中分离到2个新的芳香酰胺lorneamidesA-B，表现出杀真菌和杀线虫的活性。同时我国的林永成和周世宁研究组从南海海泥中筛选出拟诺卡菌属的No.110并分离出5种环二肽，具有明显的抑菌能力6。2002年由中国科学院沈阳应用生态所和华北制药集团爱诺有限公司联合开发成为生物农药宁康霉素。经室内抑菌试验，结果表明，宁康霉素对供试植物病原菌玉米纹枯病菌、苹果轮纹病菌和灰霉病菌等抑菌效果十分显著，田间试验对番茄灰霉病、黄瓜灰霉病、葡萄灰霉病、苹果轮纹病、梨黑星病、葡萄毛毡病和棉花黄萎病等作物病害生物防治效果突出。宁康霉素是纯微生物制剂，与化学农药相比，具有无毒高效的优点，属于对环境友好型的绿色新型生物农药，在生态农业中具有广阔的应用前景7。张海龙等采用稻瘟霉活性筛选体系进行菌种筛选，发现海洋细菌Alter nalia sp. 的发酵液对稻瘟霉分生孢子有很强的抑制和诱导变形作用。对该菌株发酵液中的代谢产物进行活性追踪分离，得到了6个化合物。近来，越来越多的研究表明许多具有开发前景的海洋生物活性物质并不是由海绵、海藻等动植物自身产生的，而是由与其共生或者腐生的微生物产生的。海洋细菌作为海洋微生物的一个重要组成部分，其代谢产物的多样性正日益受到重视。如从海洋链霉菌鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种的代谢产物中，不仅发现了新抗生素8510，而且也发现了肌醇胺霉素和春日霉素，过去它们都是由陆栖微生物产生的。其中春日霉素是一种重要的农用抗生素，抗菌谱广、毒性低，对稻瘟病等有极好的防治效果，是一种无公害的农药8。1.4 海洋细菌的分离与培养目前国内外对来自沿岸、近海区域的样品，最常用的细菌分离方法是将样品采用无菌海水进行一系列的稀释，在吸取一定量某几档稀释度的均液涂布于培养基上分离培养；对远海、深海的样品，特别是深海中，由于异样细菌密度较小，在培养前需将样品中的微生物浓缩到超滤膜上，再将超滤膜进行分离培养9。早期一直认为海洋细菌难以培养和分离鉴别，对其活性物质的研究难有作为，进步缓慢。近来，海洋细菌研究技术取得重大的，有些是突破性的进展。主要有两方面：一是培养技术，例如发现采用稀释培养法能使人们得以分离获得海水中大量存在的寡营养细菌，极大的丰富了人们对海洋浮游细菌的认识。二是海洋来源营养物样品采集地的基质经高温灭菌后直接用于分离培养基的制备，取得很好的效果10。海洋细菌培养的关键是分离培养基的选择，其极大的影响所获海洋细菌的种类结构。在培养基的制备时要注意培养基成分的选择，注意培养基周围的环境对细菌的影响。同时海洋细菌的分离要在无菌环境，因此从制备培养基时开始，整个培养过程必须按无菌操作要求进行，否则外界细菌污染标本，会导致错误结果；而培养的致病菌一旦污染环境，就会引起交叉感染，特别要避免空气中陆地微生物的污染。进行分离与接种时要减少流动气流。选择正确的贮藏方法，注意贮藏过程中时间的记录，以便按时移种。但目前海洋微生物的分离研究仍有某些技术上的难题，还有数量巨大的海洋微生物至今末被认识和研究，这些正有待于在海洋药物的开发过程中去解决。 在过去的几十年里,人们对海洋细菌产生的次级代谢产物的兴趣与日俱增，并且人们从中分离到不少具有强烈生物活性的或结构新颖的化合物。人们证实大约70%80%的从海洋细菌分离到的次级代谢产物都有生物活性。目前，海洋微生物大多数属于“难培养”微生物，陆地微生物所采用的分离手段和方法对海洋微生物未必适用。要想细正对海洋微生物及海洋细菌有所了解，成功分离并对其实现大规模培养，是有效地大规模开发海洋药物资源的前提11。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1 样品采集：从青岛城阳区海西村海域距离海岸50m处采集海泥和海水样品，静置7d左右，备用。2.1.2 培养基的选择NA固体培养基配方，胰蛋白胨5 g、牛肉膏2 g、葡萄糖5g、海盐20g、琼脂20g。用l 000ml海水配制，调pH为7.5 ,0.11-0.15MPa灭菌20min。NA液体培养基配方，胰蛋白胨5 g、牛肉膏2g、葡萄糖20g，1 000 ml陈海水，调pH 为7.512 , 0.11-0.15MPa灭菌20min。PDA固体培养基配方，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉10 g，1 000 ml陈海水，pH为7.5 , 0.11-0.15MPa灭菌20min。2.1.3 供试靶标菌2.1.3.1 供试真菌番茄绵腐病菌 （SeptoriatriticiRob.et Desm）葡萄白腐病菌 （corriella dipladiella） 葡萄黑痘病菌 （Elsinoe ampelina）番茄早疫病菌 （Alternaria solani）苹果腐烂病菌 （Cytospora） 青霉病菌 （Penicillium italicum） 2.1.3.2 供试细菌番茄溃疡病菌 (Clavibacter michiganensis )黄瓜角斑病菌 (Pseudomonas syringae)茄青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)辣椒疮痂病菌 (Pseudomonas syringae)白菜软腐病菌 （Erwinia carotovora）猕猴桃溃疡病菌 （Pseudomonas syringae）以上菌种由中国农业大学种子病理及杀菌剂药理研究室提供。2.1.4 主要仪器与设备培养皿；接种环；接种针；移液枪，涂布棒，试管，锥形瓶250ml，烧杯，玻璃棒 YXQG02型电热式高压灭菌锅 （山东新华医疗器械股份有限公司）SW-CJ-2FD医用型净化工作台 （苏净集团安泰公司制造）AE200电子分析天平 （美特勒托利多仪器上海有限公司）CS1011A电热鼓风干燥箱 （广东省医疗器械厂）可调万用电炉 （山东省龙口市先科仪器公司）THZ-82恒温震荡器 （国华企业）D8523CTL2H格兰仕微波炉2. 2 实验方法2.2.1 海洋细菌的分离与培养采用土壤稀释法法对海洋土壤中的细菌进行分离。称取1g海洋淤泥用9ml无菌海水进行稀释，即浓度为10-1，再用移液枪移取10-1的悬液1ml，放入9ml的无菌水中，如此重复，配制成10-210-5的海泥悬液。分别取1.0ml10-110-5的稀释液用涂布棒涂布于分离培养基上，30培养23d后共得4种海洋细菌（以X1、X2、X3、X4表示），将所得的海洋细菌用接种环挑取形成的单菌落，在细菌培养基上划线分离,置于30下恒温箱内培养。 2.2.2 海洋细菌对病原细菌抑制活性的测定 将滤纸片制成直径为5mm的圆片，放入培养皿中于140干热灭菌1h。分别将海洋细菌和靶标细菌活化12h后制成菌悬液。将滤纸片放在培养基上，分别取10l海洋细菌菌悬液和10l靶标细菌菌悬液滴在已灭好菌的滤纸片上，每皿2片，相距一定距离。置于30温箱中培养，24h后测量抑菌圈大小。计算海洋细菌对靶标菌的抑制生长率。2.2.3 海洋细菌对病原真菌抑制活性的测定采用平板培养法，海洋细菌在培养基平板30下活化48h.用海洋细菌的液体培养基制成菌悬液，摇床培养12h，用麦克比浊法确定最终菌悬液浓度为备用。供试真菌在PDA平板上25活化5d，使其形成一定直径菌落，用打孔器(5mm)制取菌饼，将菌丝面朝下接菌于PDA平板中央。将高温灭菌的双层滤纸片(5mm)在菌悬液中浸湿，均匀摆放在PDA平板上，每皿3片，距离均匀，以放置浸湿无菌水纸片的PDA平板为对照，27下黑暗培养4d后测量真菌菌落直径，并计算抑制生长率13。生长抑制率（%）=(对照菌落直径-菌饼直径)mm(处理菌落直径-菌饼直径)mm100%(对照菌落直径-菌饼直径)mm3结果与分析3.1海洋细菌对细菌的抑制活性的实验结果用海洋细菌对6种细菌进行抑菌活性测定的结果（见表1）。表1海洋细菌对病原细菌的抑菌试验供试靶标病原细菌海洋细菌对供试靶标病原细菌的抑菌圈（mm）X1X2X3X4番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis黄瓜角斑病菌Pseudomonas syringae茄青枯病菌Ralstonia solanacearum辣椒疮痂病菌Pseudomonas syringae 白菜软腐病菌Erwinia carotovora1210猕猴桃溃疡病菌 Pseudomonas syringae 注：“”代表无抑菌圈 所有对照滤纸片均无抑菌圈产生。表1结果表明所分离的海洋细菌X1和X2对靶标病原细菌白菜软腐病菌有一定的抑制作用，抑菌率为70.5%和66.7%，对其他病原细菌均没有活性。3.2海洋细菌对真菌抑制活性的试验结果用海洋细菌对6种有活性的真菌进行了抑菌活性试验（详见表2）。表2海洋细菌对真菌抑菌试验结果 海洋细菌海洋细菌供试靶标菌番茄绵腐病菌Septoriatritici葡萄白腐病菌corriella dipladiella葡萄黑痘病菌Elsinoe ampelina番茄早疫病菌Alternaria solani苹果腐烂病菌Cytospora 青霉病菌Penicillium italicumX1测量直径（mm）2423123026162930 10抑制率%346215X2测量直径（mm）173125203027283524续表2海洋细菌对真菌抑菌试验结果 海洋细菌海洋细菌供试靶标菌番茄绵腐病菌Septoriatritici葡萄白腐病菌corriella dipladiella葡萄黑痘病菌Elsinoe ampelina番茄早疫病菌Alternaria solani苹果腐烂病菌Cytospora 青霉病菌Penicillium italicumX2抑制率%24.475.331X3测量直径（mm）283522303229292928抑制率%35.475.331X4测量直径（mm）2938273236333432抑制率%54.984.737.4注：“”代表无抑菌圈 所有对照滤纸片均无抑菌圈产生。分离出的四种细菌都有一定的抗真菌活性，其中海洋细菌X4对番茄早疫病菌抑菌效果最好，最高抑菌率达84.7%，X1对苹果腐烂病菌的抑制效果最差，抑菌率为15%。没有细菌对番茄绵腐病菌和青霉病菌产生抗菌作用。 在所分离的海洋细菌中，抑菌效果最好的是X4，平均抑制率达59%；最差的是X1，平均抑制率只有37%。 4结论与讨论为了从海泥和海水样品中筛选到抗菌活性物质产生菌株，首先要对海洋微生物进行分离。分别配制了分离海洋细菌和真菌的两种培养基，然后用稀释涂平板法进行分离。在分离到的海洋微生物中，有四种细菌，只分离到一种真菌。同时为了扩大具有生防效果的海洋微生物筛选的种类还可以从以下几个方面进行研究取样场所：应该在不同的时间与不同的海域采集除海泥和海水之外的其他生物如不同的海洋鱼类，并以这些海洋鱼类的鳃、胃肠道为材料，分离共附生微生物。海洋细菌的分离与培养方法：除了要如本试验所做的方法之外，还可以分别对各个平板中菌落的生长状况进行观察并计数;所有的平板还需要额外培养两周左右，以保证长势较慢菌株的生长。待挑选出单菌落后，进行二次划线分离，确保纯化后，扩大培养，以进行下一步试验。同时对已发现具有活性的菌种应可用以下方法进行菌种鉴定首先可进行菌株细胞形态观察然后再进行菌株生理生化特性的测定：如氧化酶试验、接触酶试验、葡萄糖氧化发酵、淀粉水解测定、硝酸盐还原试验、硫化氢产生试验、柠檬酸盐利用试验等，接着可进行 16S rDNA基因序列扩增，最后再基于16S rDNA序列比较的系统发育分析。还可以用非致病菌作为指示菌，采用MIC测定实验(液体两倍稀释法)对代谢产物进行活性研究。本研究只是对从海泥中分离培养出的细菌做了简单的研究，对于所分离出的细菌的具体名称与品种以及性质，还有在何种的条件下细菌的抑菌率最高，对其他病菌的抑制效果，分离出的海洋细菌最适宜的生长条件等，都要在以后的研究中继续进行。同时对于其他的病原细菌有无活性也都要在以后继续研究。致谢本论文是在曲田丽老师的悉心指导下完成的，在整个实习的过程中曲老师在学习和生活等各个方面给予了极大的关怀和帮助，曲老师做事认细，治学严谨的科研态度，给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅，在此对曲老师表示我的敬意和最衷心的感谢! 本论文是在农药实验室完成的。在此期间得到了罗兰老师，杨从军老师的认真指导和帮助，同时在实验过程中得到了才秀华老师在试验仪器使用方面的巨大帮助，在此表示衷心的感谢。感谢研究生师姐李圆圆的帮助。在试验过程中，还得到了2003级同学王传富和郭中华的热心帮助，在此表示深深的谢意!最后，再次向关心、帮助我的老师及同学表示衷心的感谢！参考文献: 1 郁庆福. 现代卫生微生物学.北京:人民卫生出版社, 1995: 33-342 Ooi V E. Liu F. Immunomodulafion and anticanceractivity polysaccharide-protein complexes J, Curr. Med.Ch