（植物学专业论文）回复吸水与失水过程中发状念珠藻的光合作用及活性氧代谢.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st i 邺f 5 摘要 发状念珠藻 n o s t o c f l a g e l l i f o r m e b e r k c u r t i s b o m e t f l a h 俗名发 菜 是一种世界性分布的陆生经济蓝藻 在我国主要分布于北部和西北部的 干旱 半干旱地区 其食用和药用价值早在几百年前就为我国人民所熟知 我国学者也对其进行了大量研究 取得了不少进展 目前 对发状念珠藻的 形态结构 生化组成 光合作用 固氮作用 生态特征 人工培养及早期发 育等都有一定认识 在过去二十多年里 不断增长的市场需求导致了对发状 念珠藻的过度采挖 同时也严重破坏了分布区本已十分脆弱的生态平衡 我 国北方近年来频繁发生的沙尘暴也与此有直接关系 为此 国务院己于2 0 0 0 年6 月1 4 日下令禁止采集和销售发状念珠藻 并将其保护级别提升为国家一 级 本文综述了陆生念珠藻的耐干旱机制 并在此基础上研究了发状念珠藻 的活性氧代谢及外源氧化剂对其光合活性恢复的影响 探讨了干燥脱水与回 复吸水过程中发状念珠藻的光合作用变化及相关机制 主要实验结果如下 利用抗坏血酸氧化酶法没有检测到抗坏血酸的存在 干燥保存3 年的发 状念珠藻体内超氧化物岐化酶 s o d 仍具较高活性 其活力相当于充分恢 复活性材料的7 8 随着干燥时间的延长 s o d 活力下降 利用 2 7 一d i c h l o r o h y d r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e d c f h d a 处理2 h 通过其在细胞内 的氧化检测活性氧的产生 干燥保存材料中d c f 的产生速率是3 8 1i n m o l d c f g 于重 h 比充分吸水和人工风干的材料中均高 野外干燥及人工风 二f 的发状念珠藻细胞内活性氧的产生与其防御系统间的平衡被打破 外源氧 化剂尤其是单线态氧能够降低发状念珠藻光合活性的恢复速率 氧化逆境在 二f 旱诱导的光合机构损伤中可能起重要作用 含水量影响发状念珠藻的p s i i 光化学活性 其p s i i 活性在回复吸水过程 中得以逐步恢复 回复吸水过程中 发状念珠藻的光合色素含量无显著变化 可变荧光在光合活性恢复过程中逐渐升高 初始荧光在回复吸水初期较高 但在其后的恢复过程中急剧降低 7 7 k 荧光光谱在回复吸水o 5 h 后得以迅速 恢复 其后的变化主要涉及6 9 5 n m 处的荧光改变 藻胆蛋白的重新装配与连 硕士学位论文 m a s t e r st i 正s s 接可导致6 4 5 6 8 5 n m 处荧光强度的降低 但回复吸水o 5 h 到2 4 h 之间未检测 到这种变化 这也表明回复吸水过程中初始荧光的降低主要与p s i i 的活化或 修复 育关 回复吸水过程中发状念珠藻的光合活性恢复需要光照和蛋白质的 重新合成 发状念珠藻光合活性恢复过程由三部分组成 黑暗中可恢复的部 分 光下无需蛋白质合成的部分以及光下需要蛋白质合成才能恢复的部分 关键词 蓝藻 叶绿素荧光 蓝细菌 干燥脱水 发状念珠藻 光合作用 p s l l 活性 活性氧 回复吸水 7 7 k 荧光 i i m 删a s t e r s t h e s i a b s t r a c t n o s t o c f l a g e l l i f o r m e b e r k c u r t i s lb o m e t f l a h i sa ne d i b l et e r r e s t r i a l b l u e g r e e na l g aw i t hg r e a t e c o n o m i cv a l u ei ti sd i s t r i b u t e dw o r l d w i d ea n di n c h i n am a i n l yi nt h ea r i do rs e m i a r i da r e a so fn o r t h e ma n dw e s t n o r t h e r np a r t s d u r i n g t h ep a s tt w e n t yy e a r s an u m b e ro fs t u d i e sh a v eb e e nc a r r i e do u ti nc h i n ao n t h ee c o l o g y p h y s i o l o g y m o r p h o l o g y r e p r o d u c t i o n c u l t u r ea n dr e s o u r c e so fn f l a g e l l i f o r m e u n f o r t u n a t e l y i t sr e s o u r c e sh a v eb e e no v e r e x p l o i t e dd u et ot h e i n c r e a s i n g m a r k e td e m a n d s 0 v e r e x d l o i t a t i o no ft h i s s p e c i e s h a s s e r i o u s l y d a m a g e d e x t e n s i v er a n g e so f v e g e t a t i o ni nw e s t e r na n dw e s t n o r t h e mc h i n a a s a c o n s e q u e n c e t h es t a t e c o u n c i lo ft h ep e o p l e sr e p u b l i co fc h i n aa n n o u n c e di n j u n e2 0 0 0t h ep r o h i b i t i o no ff u r t h e rc o l l e c t i o na n d t r a d i n gi n f l a g e l l i f o r m e s oa s t oh a l tt h ep r o g r e s so fd e s e r t i f i c a t i o ni nn o r t h e r nc h i n a i t sp r o t e c t i o nd e g r e eh a s a l s ob e e ne l e v a t e dt ot h ef i r s t r a n k t h em e t a b o l i s mo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si n f l a g e l l i f o r m ea n de f f e c t so f e x o g e n o u so x i d a n t s o ni t s p h o t o s y n t h e t i cr e c o v e r yw e r ei n v e s t i g a t e d t oo b t a i n i n s i g h ti n t o o x i d a t i v es t r e s si nd e s i c c a t i o na n di t s p o s s i b l ed a m a g i n gi m p a c to n p h o t o s y n t h e t i ca d p a r a t u s n oa s c o r b a t ea c i dw a sd e t e c t e dw i t ha s c o r b a t eo x i d a s e i n f l a g e l l i f o r m es u p e r o x i d ed i s m u t a s e s o d r e m a i n e da c t i v ee v e na f t e r 3 y e a r so fd r y i n gs t o r a g ea n d i t sa c t i v i t yw a s7 8 o ft h a ti nf u l l yr e c o v e r e ds a m p l e s t h es o d a c t i v i t yd e c r e a s e dd u r i n gd e s i c c a t i o no ri nd r y i n gs t o r a g e i n t r a c e l l u l a r a c t i v eo x y g e np r o d u c t i o nw a ss t u d i e db yi n c u b a t i n gs a m p l e si nb g nm e d i u mf o r2 ha n dm e a s u r i n gt h eo x i d a t i o no f2 7 d i c h l o r o h v d r o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e t h e p r o d u c t i o nr a t e o fd c fw a s3 8 11n m o ld c f gf d w t h 1 i nd r i e df i e l ds a m p l e s a n dw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni nf u l l yr e c o v e r e ds a m p l e so ra i r d r i e ds a m p l e s t h eb a l a n c eb e t w e e ni n t r a c e l l u l a ra c t i v eo x y g e np r o d u c t i o na n dt h ed e f e n s es y s t e m m i g h tb r e a kd o w ni na i r d r i e da n dd r i e df i e l ds a m p l e s t r e a t m e n tw i t he x o g e n o u s o x i d a n t ss l o w e dt h e p h o t o s y n t h e t i cr e c o v e r ye s p e c i a l l yw i t h s i n g l e t o x y g e n o x i d a t i v es t r e s sm i g h t p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nd e s i c c a t i o n i n d u c e dd a m a g e s t ot h e p h o t o s y n t h e t i ca p p a r a t u s t h e p h o t o s y n t h e t i cr e s p o n s e o fn o s t o cf l a g e l l 的r m e t od e s i c c a t i o na n d r e h y d r a t i o n w a si n v e s t i g a t e di nt h i s p a p e r t h ei n i t i a l v a r i a b l ea n dm a x i m a f l u o r e s c e n c ei n c r e a s e df r o mt h eb e g i n n i n g f u l l yh y d r a t e d r e a c h e dt h em a x i m u m t t i a taw a t e rl o s so fa b o u t3 5 a n dt h e nd e c r e a s e dw i t hf u r t h e rw a t e rl o s s t h e f 1 f v a l u ea n dt h ea r e ao v e rf l u o r e s c e n c ei n d u c t i o nc u r v er e a c h e dt h em a x i m u m a t aw a t e rl o s so fa b o u t7 0 p i g m e n tc o n t e n t so fc h l o r o p h y l la p h y c o c y a n i na n d a l l o p h y c o c y a n i nw e r ec o n s t a n td u r i n gt h ep h o t o s y n t h e t i cr e c o v e r y af a s ti n i t i a l p h a s eo fr e c o v e r yw a sc o m p l e t e dw i t h i nh a l fa nh o u ra n df u r t h e rc h a n g eo f7 7 k f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r aw a sm a i n l yr e l a t e dt ot h ef l u o r e s c e n c el e v e la t6 9 5 n m t h ed e c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e so f p h y c o b i l i p r o t e i n sw a sn o td e t e c t e d f r o mo 5t o2 4h t h ei n i t i a lf l u o r e s c e n c ew a s h i g ha tt h eb e g i n n i n go fr e l a y d r a t i o n a n dd e c r e a s e ds h a r p l yi nt h er e c o v e r y i t sd e c r e a s ew a sm a i n l yr e l a t e dt ot h e a c t i v a t i o no rr e p a i ro fp si ir a t h e rt h a nc h a n g e si nt h ec o u p l i n ga n da s s e m b l yo f p h y c o b i l i s o m e s t h ec h a n g e so fv a r i a b l ef l u o r e s c e n c ea n df f 卅v a l u ec o r r e l a t e d w e l lw i t ht h e r e c o v e r y o fp si i a c t i v i t yd u r i n gr e h y d r a t i o n f l a g e l l i f o r m e r e q u i r e dl i g h ta n dt h ed er t o v op r o t e i ns y n t h e s i st of u l l yr e c o v e ri t sp h o t o s y n t h e t i c a c t i v i t y i nd a r k n e s s f f mr e c o v e r e d3 4 i nd r i e df i e l ds a m p l e sb u t1 8 9 i n s a m p l e sd r y f o rt w o d a y s w h e nl i g h t w a s p r o v i d e d i nt h e p r e s e n c e o f c h l o r a m p h e n i c 0 1 i tc o u l d r e c o v e r10 i o r 3 9 5 r e s p e c t i v e l yi n d r i e df i e l d s a m p l e so r i ns a m p l e s d r yf o rt w od a y s k e yw o r d s b l u e g r e e na l g a c h l o r o p h y l l f l u o r e s c e n c e c y a n o b a c t e r i u m d e s i c c a t i o n n o s t o cf l a g e l l i f o r m e p h o t o s y n t h e s i s p si i a c t i v i t y r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s r e h y a t i o n 7 7 kf l u o r e s c e n c e 第一部分 第一章 文献综述 陆生念珠藻的耐干旱机制 前言 干旱是一个重要的逆境因子 干旱逆境对植物生长发育与生理生态的 影响 张永强 姜杰2 0 0 1 对生物体的损伤 蒋明义1 9 9 9 以及植物对 干旱的适应 抗性反应 如 气孔调控 张岁歧等2 0 0 1 水分胁迫信号的 识别与转导 杨洪强等2 0 0 1 渗透调节与保护性物质的累积 李春香等 2 0 0 1 王伟1 9 9 8 水分胁迫蛋白的产生 李妮亚等1 9 9 8 r i d e 等1 9 9 3 等都颇受关注 而抗旱相关基因的诱导表达 c o l m e n e r o f l o r e se t a l1 9 9 9 及其基因工程 赵恢武等2 0 0 0 更具诱人前景 已有不少文章对高等植物干 旱诱导 水分胁迫 蛋白的作用进行了探讨 李妮亚等1 9 9 8 r i d e 等1 9 9 3 刘娥娥等2 0 0 1 关于高等植物对干旱的适应机理已有报道 王霞等 2 0 0 1 还有人试图从分子水平上阐释植物抗水分胁迫的机制 熊清等 2 0 0 0 截止目前 人们在种子耐脱水方面的研究己取得了不少进展 黄雪 梅等2 0 0 0 宋松泉等1 9 9 9 汪晓峰等2 0 0 1 但是 除了种子与极少数复 苏植物外 绝大多数高等植物不能耐受极端干旱 陆生念珠藻作为一类特 殊生物类群 对干旱的耐受能力极强 它们能在极度干燥条件下存活数十 年甚至上百年 复吸水后仍可迅速恢复代谢活性 c a m e r o n1 9 6 2 现有研 究表明 陆生念珠藻耐干旱的机制是结构 生理和分子水平上众多相互作 用的综合反映 p o a s1 9 9 9 1 念珠藻概述 1 1 形态学 念珠藻是丝状蓝藻 细胞呈扁球形 桶形或腰鼓形 一般具有间位生 的异形胞 孢子球形或长圆形 在两个异形胞间成串产生 胡鸿钧等1 9 8 0 1 念珠藻可以形成形状 大小 气味 质地 颜色各异的群体 即原植体 藻丝在原植体中排列紧密 形成规则有序的三维分布 p o t t s 2 0 0 0 原植体 外包被有公共胶质鞘 呈丝状 叶状 泡状和拟球状 胡鸿钧等1 9 8 0 最 小的念珠藻原植体由几根藻丝组成 而n o s t o cp r u n i f o r m e 的原植体湿重竟 达2 6k g d o d d s1 9 9 5 念珠藻原植体具一定颜色 从暗绿色到黑色 从 黄绿色到红褐色不等 p o u s2 0 0 0 1 2 分布 念珠藻分布广泛 在寒冷的两极 干燥的沙漠 甚至6 0 一7 0 的温泉 中都可见到它们的踪迹 由于能够固氮 它们还可以成为寡营养生态环境 或新生陆地的拓殖植物 念珠藻的常见代表种普通念珠藻n o s t o cc o m m u h e 地耳 是喀斯特溶岩地区的特征性植物 p o t t s1 9 9 9 2 0 0 0 而发状念珠 藻n o s t o cf l a g e h i f o r m e 发菜 则多分布于干旱 半干旱地区 p o r t s2 0 0 0 g a o1 9 9 8 q i ua n dg a o1 9 9 9 q i ua n dg a o2 0 0 1 在某些山区的冬泡田中 还可见到拟球状念珠藻n o s t o cs p a e r o i d e s 葛仙米 生长 李敦海等2 0 0 0 1 3 繁殖 念珠藻有多种繁殖方式 l 单细胞从藻丝上脱离形成新群体 2 营养 细胞转变为厚壁孢予以度过不良环境条件 在条件适宜时萌发形成新群体 3 通过藻殖段形成新群体 4 大群体 出芽 形成小群体 d o d d s1 9 9 5 g a o1 9 9 8 1 4 念珠藻与人类的关系 念珠藻对人类既有有利的一面 也有其不利影响 首先 念珠藻是光 合自养生物 能够进行光合放氧 其次 念珠藻多具固氮能力 可以提高 土壤肥力 并充当新生陆地的先锋植物 再者 念珠藻的酚类提取物可以 抑制 些病原体 d o d d s1 9 9 5 也有研究表明 c o m m n g 可以降低小鼠血 清中的胆固醇 h o r i e t a l 1 9 9 4 另外 像n f l a g e l l i f o r m e 早已是席间珍 品 在我国的食疗历史悠久 但过度搂采已导致分布区水土流失严重 g a o 1 9 9 8 近几年我国北方频发的沙尘暴天气与此也不无关系 有些念珠藻也 会损毁建筑物 破坏体育跑道 甚至使饮用水产生异昧 给人们的生活带 来不便 2 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s 2 陆生念珠藻的耐旱性 植物能在一定的干旱条件下生长 就必然对干旱有一定抗性 抗旱性 是植物在干旱环境中生长 繁殖或生存的能力 以及在干旱解除后迅速恢 复的能力 刘友良1 9 9 2 如果将干旱定义为一个纯粹的环境因子并用耐性 代替抗性 那么植物对干旱的反应可以分为避旱和耐旱 k r a m e r1 9 8 3 避 早性就是植物在土壤水分严重亏缺之前完成生活史的能力 典型代表是荒 漠一年生植物 刘友良1 9 9 2 耐旱性又可分为延迟脱水与耐脱水 k r a m e r 1 9 8 3 由于本文讨论的是长期干旱条件下陆生念珠藻保持生活力的耐干旱 机制 而延迟脱水的各种机制在这种条件下最终要耗尽 所以唯有耐脱水 对陆生念珠藻才有真正意义 即原生质忍耐脱水而无永久伤害的特性是陆 生念珠藻耐早性的主要内容 21 细胞的水分关系 水分对于维持细胞功能和结构的完整性是不可或缺的 水分子是原生 质的组分 定量水分的存在是原生质保持活力的必要条件 不同类型耐 早细胞的最低含水量各异 这可能与细胞中亲水性和疏水性物质的相对含 量有关 在细菌细胞中发现的最低含水量是0 0 3 9g 1 干重 高等植物的种 子最低含水量可达0 0 2 9g 1 干重 而 c o m m u n e 细胞经冰冻和干燥处理后 最低含水量为0 0 6 9g 干重 p o t t s1 9 9 4 0 1 9 风干的 c o m m u n e 藻团 回复吸水3 0 m i n 后 藻体鲜重可超过2 0 9 p o t t s1 9 9 6 在水分缺乏时 某 些糖对蛋白质 质膜及整个细胞的稳定起重要的保护作用 对念珠藻而占 在极端缺水的条件下 似乎只有海藻糖 蔗糖等少数双糖具保护功能 p o t t s 1 9 9 4 2 2 干旱对授物的生理影响 当植物的失水大于吸水时 细胞和组织的紧张度下降 植物的正常生 理功能受到干扰 这种状态称为水分胁迫 刘友良1 9 9 2 干旱是造成水分 胁迫的主要原因之一 在干旱条件下 水分亏缺首先引起植物生理活性上的变化 不同的生 理过程对水分的敏感性不同 随着水势下降它们受到的影响也不一样 细 硕士学位论文 m a s f e r s1j i s i s 胞生长速率对缺水最敏感 刘友良1 9 9 2 例如轻度水分胁迫即引起细胞生 长减慢 细胞壁合成及蛋白质合成的下降 当组织水势降至一0 5 m p a 一 1 0 m p a 时 叶绿素的合成和硝酸还原酶活性下降 并出现逆境激素脱落酸 a b a 的积累 随着水势的进一步下降 不同物种中可出现不同程度的 气孔关闭 c 0 2 同化下降 呼吸下降 以及脯氨酸和糖的累积等反应 刘友 良l 9 9 2 2 3 干旱对植物的伤害及伤害机理 随着干旱程度的加剧 水分亏缺对植物体造成伤害 从细胞水平来讲 干旱使细胞质浓缩 细胞核凝集 质膜相变温度升高 细胞壁压力增加 长期干旱会导致蛋白质 d n a 及质膜组分被氧化 p o t t s1 9 9 9 在细胞水平 上 干旱伤害的对象主要是蛋白质 核酸 脂类和质膜 2 3 1 虿白质水分子在维持蛋白质结构中起重要作用 l o m m a s 等 1 9 9 4 建立了一个蛋白质一溶剂界面模型 用以阐述蛋白质和水分子闻的相互作 用 该模型认为在蛋白质表面的初级水化层之外有永久性的水结构 水分 子的三维分布与蛋白质的形状密切相关 特别要指出的是 在水分含量变 化时水分子在蛋白质表面和内部某些部位的运动会加剧 因而有些水分子 在蛋白质脱水时更易被移走 这可以解释为什么有些蛋白质在脱水时易于 遭到破坏 耐干旱细胞内的蛋白质要么比其它敏感细胞中的相应蛋白稳定 要么 与其它敏感细胞中的蛋白无异 但可借助于一个或多个外界因子 包括细 胞中的其它组分 而保持稳定 通过对a j c o m m u n e 和 c o m m u n eu t e x 5 8 4 的研究发现 确实有一些蛋白质在干旱条件下仍保持稳定 s e h e r e ra n dp o t t s 1 9 8 9 在干旱条件下 念珠藻的固氮酶活性虽立即停止 但铁蛋白并未消 失 p e a te t a l 1 9 8 8 短时间的干燥即可导致念珠藻天线色素复合体 即藻 胆蛋白 的结构发生变化 长期干燥则使藻胆色素蛋白分解 s c h e r e ra n d p o r t s1 9 8 9 这说明有的蛋白质在干旱期间对于维持细胞的结构稳定以及复 吸水后代谢功能的恢复是不可少的 而有的蛋白质则可在复吸水后重新合 成 目前 有关干燥蓝藻细胞中能够起稳定作用或在干燥期间起保护作用 的蛋白的存在尚缺乏证据 p o r t s1 9 9 9 4 2 3 2 核酸在干旱诱发的细胞伤害中核酸是主要的受损对象 d n a 损 伤可能通过化学修饰作用 交联作用或碱基移换实现 伤害累积的结果是 每个细胞中的染色体拷贝数增加 大量的染色体拷贝使核质强制性凝集 从而可能为干旱条件下的念珠藻细胞提供了一种保护机制 p o t t s1 9 9 4 对3 7 c 下干燥保存1 0 年的念珠藻进行研究发现 细胞中染色体组去嘌 呤率为1 野外生长的念珠藻由于环境温差大去嘌呤率会更高 p o t t s1 9 9 9 然而 经过1 0 0 多年干燥保存的念珠藻仍保持有生命活力 c a m e r o n19 6 2 这表明肯定有其它因素在蛋白质和核酸的稳定中起了重要作用 有人从干 噪的 c o m m u n e 细胞中分离出了m r n a 并在体外同源或异源翻译系统中 进行转译 结果都显示出较低的转译率 这说明它们可能被修饰过 j i g e ra n d p o t t s1 9 8 8 对采自野外的 c o m m u n e 的研究发现 其细胞内含有两种基 因组d n a 一种超甲基化 另一种甲基化不足 这两种组分与不同类型的 糖复合物联系 但这些修饰对干燥细胞的活力有何影响还不清楚 p o t t s 1 9 9 9 2 3 3 脂类和质膜磷脂是构成质膜的主要脂类成分 以卵磷脂为例 1 0 一1 2 个水分子在其周围与磷酸基团形成氢键 在正常水分条件下 细胞 质膜处于一种液晶相的流动状态 如果发生水分丢失 磷脂双分子的极性 头部就聚集在一起 质膜向凝胶相转变 导致烃链间的范德华力增加 于 是质膜的相变温度升高 其中值t 可从一l o 升至6 0 h i l le ta l1 9 9 7 细胞在室温下复吸水 质膜又可从凝胶相转变为液晶相 在这个转变过程 中 质膜经历凝胶相与液晶相共存的状态 此时它的屏蔽作用减弱 即质 膜的通透性增高 从而造成溶质外渗并给细胞带来毁灭性伤害 h i l le t 甜 1 9 9 7 但含有多羟基的糖类物质可以缓解这种伤害 c r o w e e la 1 1 9 9 2 2 3 4 伤害机理干旱 干燥 对念珠藻细胞造成的伤害主要来自于活 性氧自由基所引起的氧化作用 p o r t s1 9 9 4 自由基是代谢过程中产生的带 有多余电子的化学活性很高的分子 离子或基团 如1 0 2 0 2 o h h 2 0 2 等 在生物体中存在着自由基清除剂 如超氧化物歧化酶 抗坏血酸 谷 胱甘肽 过氧化氢酶 过氧化物酶等 正常水分状况下生物体内自由基的 产生与清除之间处于动态平衡 当组织缺水时 细胞中电子传递受阻 自 5 由基生成增加或细胞清除自由基的能力减弱 平衡就被打破 当自由基浓 度超过了伤害闽值时 蛋白质 核酸 类脂分子即遭到氧化破坏 在干燥 保存1 3 年的普通念珠藻 c o m m u n e 细胞中发现有一种含铁的超氧化物歧 化酶 f e s o d 仍保持较高的含量 s h i r k e ye t a l 2 0 0 0 最近 我们在充 分吸水 吸水后干燥 以及长期干燥保存的发状念珠藻 f l a g e h i f o r m e 中也 均发现有较高的s o d 活性 它们可能对细胞免遭活性氧破坏起一定保护作 用 不饱和脂肪酸是构成念珠藻细胞膜脂的主要组分 其含量增加是抗寒 性增强的重要标志 在 c o m m u n eu t e x 5 8 4 细胞中 构成质膜磷脂的脂肪 酸有5 8 为二十碳三烯酸 2 0 3 3 p o r t s1 9 9 4 1 9 9 9 发状念珠藻细胞 的膜脂中不饱和脂肪酸含量可占总脂的7 3 其膜脂及脂肪酸在干燥 吸 水过程中始终保持很高的稳定性 w a n g e t a l2 0 0 0 由于不饱和脂肪酸的双 键是对自由基最敏感且最易发生氧化作用的部位 如果自由基引起了膜脂 的过氧化 质膜的完整性就受到破坏 从而造成细胞内含物泄漏 刘友良 1 9 9 2 在极度干旱条件下 念珠藻也能抵御这种氧化伤害 因此必须有相 应机制来维护膜的完整性 3 对陆生念珠藻耐干旱机制的探讨 3 1 海藻糖与水分置换假说m a t e r r e p l a c e m e n th y p o t h e s i s 在许多遭受水分胁迫的细胞中均可发现海藻糖和蔗糖的积累 特别是 在耐早细胞中双糖的累积更为明显 有时甚至可达到细胞干重的2 0 p o t t s 1 9 9 4 双糖在水分胁迫下对质膜及大分子具有保护作用 这种保护作用可 通过水分置换假说来解释 该假说认为多羟基化合物 例如海藻糖 可通 过羟基取代水分子而分布于质膜表面 从而在干旱期间减少细胞脱水引起 的质膜破坏效应 c r o w ee ta l 1 9 9 2 在低等生物中 不论是从化学计量方 面还是从保护效应角度来看 海藻糖似乎比蔗糖更有效 海藻糖能在细胞 脱水及干燥保存过程中保护质膜 一方面是由于它可以降低脱水细胞质膜 的t 值 另一方面是因为它可形成玻璃化转变温度相对较高的碳水化合物 6 硕士学位论文 m a s i e r s l i i e s i s 玻璃体 以抑制质膜融合 p o t t s1 9 9 4 在干燥状态下 质膜完整性的保 持可能是细胞耐干旱的中心机制 c a r p e n t e r a n dc r o w e1 9 8 9 而海藻糖对质 膜完整性的维持起关键作用 因此可以说海藻糖是念珠藻耐干旱的 法宝 f p o r t s1 9 9 4 海藻糖的羟基还可在蛋白质分子表面与极性基团以氢键结合 从而在水分胁迫下取代水 防止脱水造成的蛋白质 酶 变性 c r o w e e ta l 9 9 2 3 2 胞外多糖 e x t r a c e l l u l a rp o l y s a e e h a r i d e e p s 与玻璃体 念珠藻细胞外有大量e p s 累积 尽管它们不能降低质膜的t 值 却能 增强海藻糖和蔗糖等物质对质膜的稳定作用 h i l le la 1 1 9 9 7 质膜破坏主 要由质膜小泡的融合引起 离体试验已证实e p s 能阻止质膜小泡的融合 h i l l e ta f 1 9 9 7 因此e p s 也是陆生念珠藻耐干旱的重要因素 可溶性糖促使极少量的水分与溶质形成 玻璃体 可能是耐旱细胞中 广泛存在的保护性生理过程 当细胞中的水分降低到一定程度时 高等植 物的种子进入一种玻璃化状态 汪晓峰等2 0 0 1 在 c o m m u n e 细胞中人 们也观察到了玻璃体转化现象的存在 p o u s1 9 9 6 w a n ge t a l 2 0 0 0 在发 生水分亏缺的生物体内 有些糖 如海藻糖 山梨糖醇 果糖 蔗糖 葡 萄糖等 能形成透明的 玻璃体 其中海藻糖系统具有较高的玻璃体转化 温度 p o t b1 9 9 4 c r o w e e ta l 1 9 9 2 在 玻璃化 状态下 化学反应被限 制到了极点 膜脂的过氧化也被部分抑制 玻璃化 的这种热力学转化特 性使之能够在0 9 0 c 条件下对质膜起保护作用 p o r t s1 9 9 4 在自然条 件下 c o m m u n e 分泌的糖能通过形成多糖 胶被等形式发生物理形态上 的变化 可从玻璃态的固体转变为橡胶样的粘质流体 这种玻璃体的转化 在气温和水分含量变化时发生 p o t t s1 9 9 6 3 3 紫外光吸收色素 u v a b s o r b i n gp i g m e n t s 在 c o m m u n e 的e p s 中至少存在两种吸收紫外光的色素 其中 s c y t o n e m i n 为念珠藻特有 是由吲哚基和酚基组成的二聚体 s c y t o n e m i n 为黄褐色 脂容性 分子量为5 4 4 d a 在4 0 0 n t o 处有一个较宽的吸收峰 它的出现可能对念珠藻在干旱条件下的生存具有重要意义 另一类吸收紫 外光的色素由类孢粉素氨基酸 m y c o s p o r i n 1 i k ea m i n oa c i d s m a a s 和发色 7 硕士学位论文 m s 1 1 e r s i i e s i s 团组成 m a a s 为无色水溶性 最大光吸收在3 1 0 3 6 0 n m 之间 不管是单 独存在 还是以结合形式存在 s c y t o n e m i n 和m a a s 都起到防护紫外辐射 的作用 p o t t s1 9 9 4 2 0 0 0 这对于经常处于强日照和干旱条件下的 c o m m u n e 是非常必要的 34 水分胁迫蛋白 w a t e rs t r e s sp r o t e i n w s p 耐干旱细胞中水分胁迫蛋白或干旱诱导蛋白 d r o u g h t i n d u c e dp r o t e i n 的出现令人关注 高等植物和念珠藻细胞在于旱胁迫条件下都大量合成 w s p 例如 l e a 蛋白 l a t e e m b r y o g e n e s i s a b u n d a n tp r o t e i n 是一类在植 物胚胎发育晚期种子脱水时丰富表达的蛋白 r i d e 等 1 9 9 3 发现 当强 烈脱水的小麦幼苗复吸水时植物组织的存活与该蛋白的累积有一定相关 性 李妮亚等 1 9 9 8 在冬小麦幼苗中诱导出一种与l e a 蛋白类似的4 1 5 k d 蛋白 它为细胞内束缚水提供结合衬质 从而使细胞在脱水时不致受到较 大损伤 采自野外不同地点的 c o m m u n e 细胞经反复干燥一复吸水诱导后 也会累积一族蛋白 它们的分子量为3 2 3 9 k d p i 值在4 3 4 8 之间 但是室内培养的 c o m m u n e 细胞中无法诱导出此类蛋白 s c h e r e ra n dp o t t s 1 9 8 9 在长期干旱条件下 w s p 比其它可溶性蛋白稳定 而且此类蛋白中 对氧化破坏或修饰敏感的氨基酸残基 酪氨酸 蛋氨酸 赖氨酸 很少 由于w s p 在念珠藻细胞中大量出现 因而它们可能在干旱期间保护念珠藻 细胞的结构 但有研究表明w s p 的保护作用并不明显 某些w s p 多肽可能 只是在含木糖的e p s 的修饰中起作用 p o t t s1 9 9 9 3 5 泛素 钙 硅与多磷酸体 蛋白质降解是细胞内环境稳定的重要特征 有研究发现 泛素可以调 节念珠藻细胞固氮酶的铁蛋白周转 p o r s1 9 9 6 在 c o m m u n e 群体中钙和 硅的含量较高 胶被中钙积累较多 尤其在表膜处最多 它们的存在对于 细胞在于燥状态下保持活力或不被附生菌侵入及复吸水后的活力恢复可能 有一定作用 p o r s1 9 9 6 此外 复吸水的 c o m m u n e 细胞核质中有一个明 显的多磷酸体出现 它可能对干燥细胞恢复活力也有一定作用 p o n s1 9 9 6 这几个因素在陆生念珠藻的耐干旱中可能不起决定性作用 但它们的出现 也不容忽视 因为任何生理功能的表现都是整体协调作用的结果 r 3 6 基因表达与调节 干旱诱导特定基因的表达与调节是许多研究关注的焦点 c o l m e n e r o f l o r e se ta l1 9 9 9 赵恢武等2 0 0 0 念珠藻细胞中w s p 的合成就是干旱诱 导的结果 复吸水后念珠藻基因表达最显著的特征是有严格的代谢功能恢 复次序 首先是呼吸作用 其次是光合作用 再是固氮作用 g a o1 9 9 8 q i u a n dg a o1 9 9 9 s c h e r e re la l1 9 8 4 念珠藻细胞回复吸水时脂类的从头合成 迅速启动 说明进行脂类合成的装置在干旱期间仍具有功能 在一9 9 5 m p a 渗透压条件下 细胞内a t p 库与蛋白质合成装置分别经3 0 m i n 和2 h 迅速干 燥而不受影响 p o t t s1 9 9 9 由于m r n a 的半衰期很短 而且核酸对干旱诱 导的伤害很敏感 因此保护与r n a 结合的蛋白 如核糖体蛋白 转录因子 r n a 聚合酶 就非常重要 经固定和干燥处理后 n o s t o cu t e x 5 8 4 细胞的 r p o c l c 2 转录本迅速失去活性 该基因编码r n a 聚合酶的b 和f 3 亚基 x i e e ta l1 9 9 5 在一9 9 5 m p a 条件下干燥保存2 4 h 的n o s t o cu t e x5 8 4 细胞回 复吸水 6 0 m i n 以后r p o c l c 2 转录本即可恢复到对照水平 因而在干旱期间 细胞的r n a 聚合酶全酶必须保持稳定 以便在回复吸水时迅速启动r p o c l c 2 基因的转录 免疫印迹实验也已证实在干燥细胞中存在r n a 聚合酶蛋白 x i e p 口 1 9 9 5 4 结束语 陆生念珠藻的耐干早机制在许多方面不同于高等植物 高等植物在水 分胁迫条件下 细胞内通常会累积大量的渗透调节物质 如 脯氨酸 甜 菜碱等 李春香等2 0 0 1 刘友良1 9 9 2 或合成逆境激素 如 脱落酸 乙 烯等 对细胞进行保护 刘友良1 9 9 2 h a r t u n g a n dg i m m l e r1 9 9 4 在盐胁 迫下念珠藻细胞中也有脱落酸积累 李敦海2 0 0 0 但它在耐干旱方面是 否具有作用尚待深入探讨 w s p 是在干旱诱导下产生的一类可溶性蛋白 它们的出现是细胞对干旱的响应 在高等植物中 w s p 具有保护细胞结构 和调节渗透压的作用 它们也可能是植物适应胁迫所必需的酶 在 c o m m u n e 细胞中w s p 的保护作用似乎并不明显 w s p 与念珠藻耐干旱的关 9 系尚需进一步研究 对念珠藻的耐旱相关基因进行精确定位与转基因研究 对干旱条件下保护性产物与原植体防护结构的功能进行精确分析 不仅有 助于从分子水平上理解念珠藻耐干旱的原因 而且可以为耐干旱的转基因 研究提供重要的试验依据和材料 海藻糖是念珠藻在干旱条件下生存的关 键性保护物质 但它在高等植物中却很少存在 利用基因工程手段 将海 藻糖代谢的相关基因导入高等植物细胞并使其表达 就有望获取耐旱的转 基因植株 在这方面已有成功的例子 赵恢武等2 0 0 0 另外 对耐旱相关 的环境诱导因子进行深入研究 对耐旱相关的其它生理机制进行深入探讨 以及对水分逆境与盐胁迫 温度胁迫 紫外辐射等逆境间的关系进行阐释 都将有助于推动对陆生念珠藻耐干旱机制的研究 1 0 硕士学位论文 m a s 5e r s 1 1 1 e s i s 第二部分实验部分 第二章干燥脱水过程中发状念珠藻的活性氧代谢及外 源氧化剂对其光合活性恢复的影响 1 前言 发状念珠藻 n o s t o c f l a g e l l i f o r m e b e r k c u r t i s b o r n e t f l a h 是一种耐早 植物 主要分布于长期处于缺水状态的环境中 但短期降水或在夜间吸收露水 即可达到水分饱和 w h i t t o ne la l1 9 7 9 g a o1 9 9 8 p o t t s2 0 0 0 干旱影响植 物的生长 发育 代谢 以及光合产额 干旱引发的一个相应后果即氧化胁迫 活性氧的累积 并由此造成细胞结构的破坏 已有实验表明 多种植物体 内超氧阴离子 0 2 在水分逆境条件下含量升高 干旱胁迫导致叶片类囊体的 氧化伤害增强 t a m b u s s i e ta 1 2 0 0 0 而细胞内的抗氧化防御系统决定着细胞 能否继续正常行使功能 f o y e re t a l1 9 9 4 干燥保存1 3 年的 c o m m u n e c h e n 1 9 8 6 细胞中 具活性的f e s o d 含量在可溶性蛋白中居第三位 s h i r k e y p