（微生物学专业论文）微紫青霉菌gxcr的ptype+atpase基因克隆与表达分析.pdf

微紫青霉菌g x c r 的p t y p ea t p a s e 基因克隆 与表达分析 摘要 铜是各种细胞进程所必需的微量元素 但过量会产生毒性 生物 体进化出精确的调控机制来维持细胞内铜平衡 处于细胞内铜平衡调 节体系重要的一个环节是铜转运p t y p ea t p a s e 本研究运用3 r a c e p c r 及电子克隆的方法克隆得到微紫青霉菌 p e n i c i l l i u m j a n t h i n i l l u m 菌株g x c r 铜转运p t y p ea t p a s e 基因c d n a o r f 大小为3 7 2 0 b p 编码一个1 2 4 0 氨基酸的蛋白质 预计分子量为1 3 2 k d b l a s m 发现 与棒曲霉 a s p e r g i l l u sc l a v a t u s 菌株n r r l1c o p p e r t r a n s p o r t i n g a t p a s e 同源 性最高 9 3 s m a r t 分析表明 菌株g x c r 的铜转 运p t y p ea t p a s e 基因编码产物存在7 个跨膜结构 含p t y p ea t p a s e 共有的保守功能域 以及p l b 型p t y p ea t p a s e 的特征保守基序h p c p x 推测g x c r 铜转运p t y p ea t p a s e 属于p m 型p t y p ea t p a s e 荧光定量p c r 及n o r t h e r n 杂交分析发现4 0 m mc u 2 明显的诱导了 g x c r 的铜转运p t y p ea t p a s e 基因的表达 诱导3 0 m i n 时表达量最 高 1 小时后表达量开始下降 在a 矿和c d 2 诱导时表达量也有不同 程度的增加 关键词 铜转运p 卯ea r p a s e 基因荧光定量p c rn o r t h e r n 杂交 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s eo fa p e n i c i l l i u m j a n t h i n i l l u mg x c rc o p p e r t ra n s p o r t i n gp t y p ea t p a s eg e n e a b s t r a c t c o p p e ri o nh o m e o s t a s i si sc o m p l i c a t e di nt h a tc o p p e ri sa ne s s e n t i a le l e m e n t n e e d e df o rav a r i e t yo fc e l l u l a rp r o c e s s e sb u ti st o x i ca te x c e s sl e v e l s c e l l sh a v e e v o l v e dm e c h a n i s m st op r o v i d ei n t r a e e h u l a rc o p p e ri o nh o m e o s t a s i s t h ek e y e n z y m ei n v o l v e d i nt h i sb a l a n c em e c h a n i s m si s c o p p e r t r a n s p o r t i n gp t y p e a t p a s e t h ee d n ao fc o p p e rt r a n s p o r t i n gp t y p ea t p a s eo fp e n i c i l l i u m j a n t h i n i l l u m n a m e dg x c r w a sd o n e db y3 r a c e p c ra n ds i l i c o nc l o n i n g i t h a r b o r e da 3 7 2 0 b po p e nr e a d i n gf r a m e o r f e n c o d e dap u t a t i v ep r o t e i no f1 2 4 0 a m i n oa c i d s i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a sa p p r o x i m a t e l y1 3 2 k d t h ee d n ao f g x c rs h o w e d9 3 i d e n t i t yw i t ht h ec o p p e rt r a n s p o r t i n ga t p a s eo f a s p e r g i l l u s c l a v a t u sn r r l1 s m a r ta n a l y s e sr e v e a l e dt h a tt h ee n c o d i n gp r o d u c th a v e7 t r a n s m e m b r a n ed o m a i n s i th a v es e v e r a ld o m a i n sc o n s e r v e di na p t y p ea t p a s e c p xm o t i fw h i c hi st h ed e f i n i n ge l e m e n to fp l r f y p ea t p a s ea n dc o n s e r v e dh i p l o c u sw e r ea l s of o u n d r e a l t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r q p c r a n d n o r t h e r nb l o ta n a l y s e sr e v e a l e dt h a t e x p r e s s i o nl e v e lo fc o p p e rt r a n s p o r t i n g p t y p ea t p a s ew a ss i g n i f i c a n t l yi n d u c e db y4 0 m mc u s t r e s s t h eh i g h e s t e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e da tt i m eo f3 0m i n e x p r e s s i o nw a sd e c l i n e da f t e r1 h o u r t h et r a n s c r i p t i o no ft h eg e n ea l s oi n c r e a s ew h e nt h ec e l lw a si n d u c e db y a g a n dc d t k e yw o r d s c o p p e r t r a n s p o r t i n gp t y p ea t p a s eg e n e q p c r n o r t h e r nb l o t 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是在导师指导下完成的 研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容 除己注明部分外 论文中不包含其他人已经发表过的研究成果 也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容 对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体 均已在论文中明确说明并致谢 论文作者签名 彀淤刍l 叼年彳月山日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 即 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并提供目录检索与阅览服务 学校可以采用影印 缩印 数字化或其它复制手段保存论文 在不以赢利为目的的前提下 学校可以公布论文的部分或全部内容 请选择发矽间 酗即时发布口解密后发布 保密论文需注明 并在解密后遵守此规定 论文作者签名 柱激奴导师签名 巷断f 月加日 徽繁青 l rg x c r 的p t y p ea t p a i 因克 t 与毒j 配铲析 第一章前言 1 1 微生物与重金属的相互作用 1 1 1 重金属在生物体中的作用与毒害 重金属广泛存在于各种生活和工业废水及固体废物中 不能被微生物降解 常通过 多种途径进入土壤并在其中累积 不断退化土壤肥力 恶化水体环境 土壤中的重金属 会通过食物链 经过逐级生物富集对人体健康产生危害 重金属指具有d 轨道电子的过渡族金属元素 自然界存在的9 0 种元素中 有5 3 种是 重金属 微量重金属是微生物生命活动所必需的营养物质 是酶的活化剂和辅基 微生 物对各种重金属的需要量极少 过量会引起毒害作用 大多数重金属对活体细胞有毒 它们和必要金属元素竞争含硫化合物和氧的结合位点 破坏核酸和蛋白质结构 干扰氧 化磷酸化和渗透压平衡 当重金属离子侵入机体后 与生物大分子 蛋白质 氨基酸和 核酸 结合 生产金属络合物或金属鳌合物 金属离子既可以取代生物大分子活性点位 上原有的金属 也可结合到该分子的其它位置 改变生物大分子正常的生理和代谢功能 使生物体表现为中毒现象甚至死亡 重金属的形态不同毒性也不同 重金属的形态包括化合态 价态 结构态和结合态 等 一般认为重金属的游离离子和一些简单无机络合物是可能的毒性态 而结合紧密的 有机络合物较少具有毒性特征 2 重金属种类不同其毒性大小也存在差异 l c s t e r 等 3 1 分别研究了5 0m g l 的重金属对连续流中微生物群落的影响 其中毒性最强的是铜 其次为镉 铅 铬 不同微生物区系对重金属的敏感程度不同 4 其敏感性顺序一般为 细菌 放线菌 真菌 杨晔等人 5 研究表明镉对细菌 真菌的抑制比较明显 对放线菌抑 制不明显 对固氮菌则有刺激作用 1 1 2 微生物对重金属的抗性及其解毒机制 在高浓度金属存在下 某些微生物仍然能存活和生长 表现出对重金属的抗性 有 些菌还通过生物转化作用或生理代谢活动使金属由高毒状态变为低毒状态 微生物对重 截鬃青 rg x c r 的p t y p ea t p a s e i 日克 童与毒盛分析 金属抗性及解毒大致可分为以下几种作用方式 1 1 2 1 生物吸附作用 在细菌 真菌和藻类细胞上有许多结构组分具有结合重金属的能力 大多数微生物 所带的阴离子型基团如 c o o h o h n h 2 s h 可通过络合 整合 离子交换 静 电吸附 共价吸附等作用与重金属相结合实现微生物表面吸附 微生物还能向胞外分泌 胞外多糖 糖蛋白 脂多糖吸附重金属 研究证实 胞外多糖可以作为重金属的有效生 物吸附剂 阻止重金属离子进入细胞 许多微生物体内的有机代谢物如柠檬酸同样具有 络合金属离子的能力 在去除重金属毒性方面发挥重要的作用 6 刀 1 1 2 2 重金属表面富集与金属晶体的形成 细胞壁与膜的表面富集是微生物抵抗重金属毒性的方式之一 由于微生物细胞壁表 面有羧基 巯基等基团 细胞膜具有各类型吸附专性蛋白 因此 重金属可在细胞壁 膜表面富集 并形成晶体 有研究认为当假单胞菌细胞内a g 向胞外运输至质膜时 会 与菌体活动产生的硫化氢发生酶触反应形成a 9 2 s 晶体从而有效地降低细胞质内的银离 子浓度 1 1 2 3 细胞膜成分与通透性改变及细胞形态变化的抗性适应 重金属对微生物质膜的破坏并非简单的机械损伤 而是对细胞酶系的改变与合成位 点的抑制 使得菌体原生质膜发生成分与通透性的改变 a v e r y 等人1 8 分别用铜 镉诱导 啤酒酵母的生物抗性 发现这两种重金属均会导致细胞膜多不饱和脂肪酸成分的增加与 通透性的增大 但菌体对这些重金属的抗性却增强数倍 但并非所有微生物细胞膜成分 与通透性的改变均是有利的 当啤酒酵母菌细胞膜的亚油酸酯增加时 s r 富集增加 流出量减少嘲 此外重金属可以诱发细胞发生各种形态变化 在某些情况下 形态效应 可能与在形态学发生过程中必需金属离子所起的作用有关系 l 0 u l 1 1 2 4 细胞内的隔离作用和解毒作用 许多真核微生物如酵母 真菌和藻类细胞能把重金属离子累积于细胞内的某些特殊 细胞器如液泡 类囊体 溶酶体中 因而能在细胞内累积高浓度的金属 通常情况下 2 截繁青霉曹g x c r 的p t y p ea t p a s el 因克l t 与表述分析 真菌累积的大部分钴 锰 镁 锌和钾离子存在于胞内小气泡中 并以离子的形式存在 或结合于多聚磷酸i 盛l t 埘 另外 许多微生物可以通过某些蛋白质催化金属离子 发挥 贮存和调节金属离子浓度的作用 研究发现在大肠杆菌属中存在可诱导的 具有结合镉 能力的蛋白质 这些蛋白质的相对分子质量比金属硫蛋白大 1 3 1 l 1 2 5 与金属离子运输有关的机制 金属离子进入细胞一般要经过胞外结合与运输到胞内两步过程 前者快速 不需要 能量 后者缓慢 依赖能量及代谢系统调控 金属运输的关键是质膜的离子梯度及膜电 位 由于一些金属在高浓度时具有毒性 因此微生物通过减少运输 阻渗作用或排出作 用构成对重金属的抗性 丁香假单胞菌中发现的c o p 系统研究得比较清楚 c o p 的抗铜 机制是c u 2 在周质空间被c o p a 和c o p c 结合 在细胞质中c u 2 被封闭 从而使细胞质 中游离的c u 2 浓度受到控制 c o p 系统的调节由c o p r 和c o p i 实现1 1 4 j 1 1 2 6 微生物对金属的转化作用 微生物通过氧化 还原 甲基化和去甲基化作用对重金属进行转化 从而实现细胞 解毒 最常见的抗汞机制就是借助质粒编码的细胞质汞还原酶的催化 将汞离子还原成 金属汞 1 5 金属汞易于挥发且毒性比汞离子小 1 1 2 7 重金属抗性的遗传学机制 金属与微生物直接相互作用的遗传学研究 目前主要局限在对细菌汞抗性和酿酒酵 母菌铜载体的探讨 决定汞抗性的基因通常位于革兰氏阴性细菌质粒上 至今 已有人 对位于革兰氏阴性细菌t n 5 0 1 和t n 2 1 转座子上的汞 m e r 基因进行了d n a 序列分析 革兰氏阴性细菌中由质粒编码的汞还原酶分为两组 原养型汞还原酶系i n e p 质粒p v s i 编码 其它汞还原酶是通过携带有转座子t n 2 1 的质粒r 1 0 0 编码 在汞离子的诱导下 由t n 5 0 1 和质粒r 1 0 0 编码的汞还原酶和有机汞裂解酶短暂地与膜中的m e r t 基因产物 接触 因此作用被还原的汞可通过简单扩散从细胞中释放出来l 酒精酵母菌对重金属 的抗性主要是因为经重金属的诱导产生了富含半胱氨酸的金属硫蛋白 1 3 1 当此类蛋白质 的编码基因以多拷贝串联重复形式出现时 菌株产生抗性 查竺 主竺苎苎竺 竺茎竺垦竺旦业垒里 苎兰苎查兰竺查兰竺竺 1 2 铜在生物体内的作用和毒性 铜是所有生物生存所必需的基本微量元素之一 在生物体的生长和发育过程中发挥 着重要作用 1 7 它以辅基的形式参与细胞内多种重要的代谢途径 是细胞色素氧化酶 多酚氧化酶 抗坏血酸氧化酶 多胺氧化酶 c u z n s o d 等蛋白质的重要辅基 参与 呼吸代谢中的氧化还原反应 瑚 铜被动物机体摄取 以酶的辅助因子形式参与氧化磷酸 化 自由基解毒 黑色素合成 儿茶酚胺代谢 结缔组织交联 铁和胺类氧化 尿酸代 谢 血液凝固和毛发形成等代谢过程 细胞内铜离子浓度过低会影响这些酶的活性及相 应的生理代谢途径 细胞内铜离子浓度超过生理需求时 铜会成为细胞毒素 过量铜能诱发包括羟基在 内的活性氧 r o s 产生 1 9 1 羟基引起生物膜中脂类的过氧化反应从而破坏膜结构 直 接氧化蛋白质 使d n a 和r n a 分子发生断裂 因此r o s 是导致癌症 神经系统疾病和衰 老的主要因子 而且抑制植物的光合作用网 随着农业生产上含铜杀菌剂的频繁使用 铜矿的过度开采及工业生产中含铜污染物 的大量排放 铜污染已成为世界性难题 研究生物体内的铜转运系统及其所涉及到的基 因有助于我们了解生物体对铜的解毒机制 1 3 铜在生物体内的平衡及代谢 由于铜是生物体必需的微量元素 但过量又会对细胞产生毒性 因此生物体进化出 精确的调控机制来维持细胞体内铜平衡 铜离子浓度的维持主要在于四个环节 铜离子 进入胞p q u v m k e 胞内运送o r a n s l o c a t i o n 合成金属蛋白 s y n t h e s i s 及清除过多铜离子 e l i m i n a t i o n 1 2 1 2 5 1 细胞主要是通过改变流入量 i n f l u x 和流出量 e m l 来保持铜离子 浓度 另外 金属硫蛋白可与过多铜离子结合 避免其破坏作用 事实上 每一环节都有 不止一种蛋白和调控蛋白在起作用1 2 6 3 0 1 3 1 细菌中铜离子的代谢模式 铜在细菌中的代谢模式主要有三种 隔离沉积模式 p 型a t p 酶模式 非 蛆甲酶排 出模式 现分别介绍如下 4 翻e 紫青霉曹g x c r 的p t y p ea t p 如e i 因克蕾与毒煞分析 1 3 1 1 隔离沉积模式 丁香假单胞菌 p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 是这一型的典型代表 3 l 丁香假单胞菌编码 铜离子代谢的基因位于高度保守3 5 k b 的质粒 p p l 2 3 d 上 这一型也称为质粒作用型 e m r d i 等p 习报导的一株耐铜瘰疬分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms c r o f u l a c e u m 也是这一类型 这 株菌中包含有一个1 7 3 k b 质粒 携带抗铜基因 p p t 2 3 d 编码6 个蛋白 c o p a c o p b c o p c c o p d c o p r c o p s c o p a 是周质蛋白 分子量为7 2 k d 序列中富含组氨酸 c 端有一铜离子结合位点h x 4 0 c x 4 h 4 m 并有多次重复的m x x m x h x x m 基序 一种 铜结合位点 c o p b 位于细胞膜外 有5 次重复的m x x m x h x x m 基序 c o p a 和c o p b 的表达受胞外铜离子浓度调控 1 0 p m 铜离子浓度诱导时表现为低水平表达 当铜离子 浓度接近毒性水平时可诱导其大量表达 c o v c 位于质膜周围 含有一个m d 凸积h 蕊d 序列 由铜诱导产生 c o p d 位于质膜内面 与铜离子转运入胞内有关 丁香假单胞菌 在富含铜离子的培养基上会形成蓝色的克隆 电镜下观察可看见高密度的物质在质膜周 围沉积 推测丁香假单胞菌铜离子耐受性产生的机制是c o p a c o p 8 c o p c 与铜离子 结合沉积 阻止过多铜离子进入细胞内 c o p c c o p d 向细胞内运送铜离子则避免了细 胞内铜离子浓度过低 c o p r 和c o p s 是一对调控蛋白 当铜离子浓度超过生理需求时 c o p s 与铜离子结合 同时水解a t p 磷酸化 结合虱j c o p r 上 使c o p r 被磷酸化 带 有磷酸基团的c o p r 与结合在c o p a b c d 的调控序列上的阻遏蛋白结合 使c o p a b c d 开始转录 c o p p j c o p s 的这种作用模式称为激活蛋白 感受蛋白磷酸激酶双组 分调控系统 t w o c o m p o n e ms e n s o r a c t i v a t o rp h o s p h o k i n a s er e g u l a t o r ys y s t e m 1 3 1 2p 4 y p ea t p a s e 模式 肠球菌 e n t e r o c o c c u sh i r a e 是这一型的典型代表 3 3 肠球菌编码的与铜代谢相关的 基因全部位于染色体上 因此这一型可称为染色体型 在肠球菌中 5 个与铜平衡有关的 基因c o p a c o p b c o p x c o p y c o p z 在同一个操纵子上 3 1 3 4 捌 c o p a 和c o p b 是 两个完整的膜p t y p ea t p a s e 分别由7 2 7 和7 4 5 氨基酸组成 n 端为铜离子结合区 c o p a 有一保守的重金属结合区g i y x t h r c y s x x c y s 这个保守区在人类m o n k 和 w i l s o n 铜转运a t p 酶上有6 个拷贝 c o p b 有三次重复的铜离子结合基序 m e t x h i s x x m e t s e r g 1 y m e t x h i s s e t 在丁香假单胞菌的周质铜结合蛋白中也存 在此序列 3 1 1 c c p a 和c o p b 可能的离子传送区都有一保守的脯氨酸 c o p a 为c p c 徽觜青叠曹g x c r 的p t y p ea t p a s e i 园吏隆与覃瞄扮析 c o p b 为h p c 此外它们还有五肽磷酸化位点 a s p l y s t h r g l y t h r c o p a 的功能 主要是在细胞内缺乏铜时将铜离子转运进细胞内 而c o p b 的主要功能是在铜离子浓度 过高时将多余的铜排出胞外 3 3 阗 干扰c o p a 基因 对肠球菌的抗铜性没有什么影响 缺失了c o p a 基因的菌在3 天后停止生长 推测是由于缺乏铜元素造成的 3 3 c o p y 为 结合铜离子的阻遏蛋白 n 端有与b 内酰胺酶阻遏蛋白类似的d n a 结合序列 c 端发 现铜离子结合区c x c x x x x c x c c o p z 可以提高c o p a c o p b 的转录水平 可 能的调控机制如下 当铜离子浓度正常时 c o p y 与铜离子结合后结合在c o p a b 的 调控子上 抑制c o p a b 的转录 当铜离子浓度过高时 与铜离子结合的c o p z 与c o p y 结合 活化c o p a b 的转录 1 3 1 2 非a t p 酶排出模式 大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l o 是这一类型的代表 与铜离子代谢相关的蛋白由质粒 p p jl 0 0 4 3 7 1 和染色体共同编码并交叉调控 故此型又称为质粒染色体共同作用型 p i l l 1 0 0 4 编码7 个蛋白 p e o a b c d e p o o r 和p c o s 染色体上可能有8 个位点 3 8 l c u t a b c d e f c u t r 和c u t s p c o e 有6 个类似c o p a c o p b 中的八肽序列 显 示它也是铜离子抗性决定因子的一部分 c u t a 位点分离出三个基因p 9 c u t a1 c u t a 2 c u t a 3 c u t a l 和c u t a 2 与铜离子耐受性相关 c u t c 的n 端有m x x m x x x m 基序 与c o p b 的铜离子结合基序m d m o 到 常类似 c u t e t 4 0 l 编码载脂蛋白n 酰基转移酶 它与 铜离子在细胞内的储存和运送有关 c u t f 4 1 的n 端有典型的脂蛋白和胞外定位信息 是一个膜外脂蛋白 p c o 和c u t 系统作用模式 c u t a 与c u t b 位于细胞膜上或膜周 参与铜 离子入胞过程 p c o a p c o b c u t d 与铜离子出胞相关 p e o c 和c u t c 主要在细胞内储存 铜离子 并将其运送至目的处 c u t e 修饰一种或多种参与形成铜离子容受性的稀少脂蛋 白 c u f f 诱导c u t c 合成 大肠杆菌中铜离子的排出是一种非a t p 酶模式 推测是由离 子浓度梯度推动进行 虽然c u t 系统散布于染色体上 但它们仍以一种协同方式起作用 p c o r p c o s c u t r c u t s 的作用方式跟c o p r c o p s 一样 当p e o r 和p c o s 缺失时 c u t r 和c u t s 可代替它们行使功能 同时调控质粒和染色体上相关基因的表达 1 3 2 真核细胞中铜离子的代谢 在长期进化过程中真核生物形成了一套完整的铜转运和稳态调节系统 1 8 t 4 2 包括铜 6 做 臼i 1 一g x c r 的p t y p ea t p a s e i 因 量与毒蓝分析 离子的摄取 细胞内转运 配至靶蛋白 以至最终排出细胞的各个过程 这一调节系统 在真核生物中具有高度保守性 其中以啤酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 研究得最 为清楚 图1 1 f i g 1 1 总结了酵母模型中铜吸收 分配和解毒过程跚 c u 2 被细胞 膜表面还原酶f r e l f r e 2 还原为c u 高亲和性铜吸收由c 垃1 和c t r 3 介导 在细胞内铜 结合到铜分子伴侣a t x l c o x l 7 和c c s 上 分别精确传送到分泌途径 线粒体和 c u z n s o d 图1 一i 啤酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中的铜转运和分布 f i g 1 1c o p p e rt r a a s p o r ta n dd i s t r i b u t i o ni ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 1 3 2 1 细胞膜上的铜离子通道 真核细胞可以迅速 双向地获取铜离子 摄入过程不需要消耗a t p 提示铜的吸收 是一个被动转运的过程 一些外界因素如组氨酸 钾离子 氯离子以及p h 值等都会对 铜的吸收产生影响 4 3 l 在啤酒酵母中 细胞膜铜离子通道以c t r c o p p e rt r a n s p o r t e r 家 族最具代表性 酵母中铜的吸收与铁的吸收一样具有高 低亲和力两套转运体系m 当 细胞内缺乏铜时启动高亲和性铜转运系统 高亲和铜运输子由c t r l 和c t r 3 基因编码 1 4 5 4 6 1 c t r i 和c 廿3 蛋白对铜结合有特异性和可饱和性 整个细胞铜吸收k i n 为1 4 州 铜过多时低亲和性铜转运系统占优势 主要指c t r 2 f e t 4 等 其机制尚未完全阐明 c a 家族蛋白具有如下一些共同的特点 具有3 个跨膜区 除c 虹1 外 跨膜区的氨基 酸序列高度保守 n 端具有较保守的铜离子结合区 其中以c t r l 研究最为深入 c t r l 含4 0 6 个氨基酸 特异性地转运c u 广泛存在于各种细胞中 其中肝 肾组织表达水 平较高 脑及其它组织仅有少量表达 蛋白结构的预测显示c t r l 的n 端位于胞膜外 7 散繁青 g x c r 的p t y p ea t p a s e 墓因克 t 与囊蓝分析 形成8 个以m x 2 m 或m x m 为特征的蛋白结构域 推测具有结合铜离子的作用 c 端位 于胞质侧 末端含有十分保守的半胱氨酸 c y s 酪氨酸 t r y 和苯丙氨酸 p h e 位点 可能是金属结合配基 c t r l 蛋白在酵母处于高铜环境时 会从胞膜上解离发生降 解 同时有内吞自溶现象 具体过程仍不明晰 利用基因打靶技术剔除了c 仃l 基因的小 鼠表现为严重的发育迟缓 原肠胚形成障碍 神经外胚层以及中胚层细胞分化迁移缺陷 等 在胚胎形成的9 5 天 1 0 5 天死亡 1 9 4 7 1 在酿酒酵母中 还存在另外一个高亲和性 铜转运系统 c 仕3 这两种高亲和力铜转运蛋白的功能相似 但结构却有较大的差异 尤其是在n 端和c 端 c t r 3 以同源三聚体的形式定位于胞膜 9 个跨膜结构域形成一个 铜离子通道完成铜离子的转运 其中c y s l 6 c y s 4 8 c y s 5 1 的突变会影响三聚体的形成 和胞膜定位1 4 8 1 此外 在融合酵母 s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e 中 还存在另外两种 高亲和力铜转运蛋白c t r 4 与c t r 5 这两种转运体形成异源复合物 共同完成铜离子的 转运 在转录水平受铜感受调节因子c u f f 的调控 2 7 1 啤酒酵母铜吸收过程有3 个低亲 和力铜转运体系 分别由f e t 4 c t r 2 p o l 和s m f l 2 1 5 1 1 基因编码 其中f e t 4 定位于胞膜 是铜离子和铁离子的共同转运体 5 2 c t r 2 定位于胞质内的囊泡 负责细胞内铜离子的再 分布 c t r 2 不能代偿c 心1 c u 3 缺陷酵母的功甜5 3 根据现有的证据 啤酒酵母至少在 转录调控和蛋白降解两个水平对高亲和与低亲和两种铜转运系统进行调节 当处于贫铜 环境时 m a c l 与c t r l c t r 3 f r e l 启动子区的两个t t t g c t c a 序列结合形成一个 m a c l 2 d n a 的三重复合体 如图l i 所示 激活了下游高亲和力铜转运体的转录和 表达 5 4 5 5 1 相反的在高铜环境中 m a c l 由于结合了铜离子而减弱了与d n a 结合的能力 上述高亲和力铜转运体的表达归于沉默 同时另一种调控因子a e e l 由于结合了铜离子 借助于一种四铜巯基簇的结构结合于c u p l c r s 5 s o d i 基因5 启动子区 间接激活 各种低亲和力铜转运体的表达 5 6 1 1 3 2 2 细胞内铜离子的运输载体 铜离子进入细胞后 立即与各种铜伴侣蛋白 5 7 郧1 结合 转运至不同的靶蛋白 协助 完成各种生理功能 由于铜伴侣蛋白的存在 正常细胞质中游离铜几乎不存在瞪9 1 一 方面 铜伴铝蛋白结合铜离子并协助运输至靶蛋白 起到了铜的转运者的作用 另一方面 维持了胞浆内铜的生理浓度 是细胞内铜稳态调节的重要一环 进入胞质内的铜主要通过 a t x l c o x l 7 和c c c 2 种铜伴侣蛋白经三条不同途径进行转运和调节 8 竺查竺 苎兰竺竺 竺 鱼堑垦竺 型竖垒 里苎 苎苎查 生兰兰竺竺 a t x l a n t i o x i d a n t1 唧 6 l 由4 托隧因编码 是一种在缺乏c u z ns o d l 时可以抑 制氧毒性的多铜抑制剂 含有7 3 个氨基酸 n 端含有一个m t c o c 基序 为c l l 结合位 点 三级结构是典型金属离子结合簇p a b 陋p 在酵母细胞中 a t x l 一c u 复合体与c c c 2 蛋白 一种质膜中的铜转运蛋白 作用 通过c c c 2 再把c l i 传递给高尔基体反面的f e t 3 蛋 白 种多铜氧化酶 负责高亲和性铁吸收 据l i n 和c o r s o n 等人的研究结果 a t x l 同时 具有解除毒作用并非由于其结合游离铜离子 而是能够直接作用于超氧化物 剔除了 a t x l 基因的细胞表现为铜的累积 证实t a t x l 在细胞铜稳态调节中的作用1 6 2 c o x l 7 c y t o c h r o m ec o x i d a s e1 7 6 3 6 5 1 是由c 缸j 7 基因编码的含6 9 个氨基酸的酸性 蛋白 含有7 个可能的金属结合半胱氨酸位点 多以二聚体和四聚体的形式存在 位于 酵母的胞质和线粒体膜间隙内 c o x l 7 接受c t r l 转运的c l l 后 将c u 运送到线粒体 传递给线粒体膜蛋白s e o l s c 0 2 通过s c o l s c 0 2 最终将c u 组装入细胞色素c 氧化酶 人 类新生儿酮症酸中毒以及致死性的心肌病变是由s c o l 和s c 0 2 杂合突变所致 6 6 6 7 第三种途径是通过c c s c o p p e rc h a p e r o n e sf o rs u p e r o x i d ed i s m m a s e 即l y s 7 蛋白 6 8 1 含2 4 9 个氨基酸 可能有两个结构域 一个类似于a t x l 的金属结合区m r c 诞 另一个与c u z ns o d i 序列相似 l y s 7 蛋白把c u 特异性地传递到胞液中一个主要的抗 氧化酶c u z ns o d l c c s 的这种传递过程具有专一性 1 3 2 3 铜转运a t p 酶 处于细胞内铜稳态调节体系核心环节是一种铜转运a 即酶 主要功能是负责将多余 的铜排出胞外 人麴v i e n k e s d i s e a 辩和w i l s o n sd i s e a s e 的致病基因a t p 7 a 和j 俯7 b 分别编 码2 个膜结合p 型a t p 酶m n k 2 1 和w n d 和肠球菌的c o p a 蛋白一样 m n k 的n 端含6 个连续重复的铜结合区g m t c x x c a t p 7 a 的m r n a 在肌肉 肾脏 肺 脑大量表达 在肝脏表达量很小 低铜浓度时 m n k 蛋白定位于高尔基体 t r a n s g o l g in e t w o r k t o n 其作用是释放铜到分泌途径 提高铜离子浓度会刺激h 甜k 蛋白由t g n 转到质膜 通过 向胞外排铜维持细胞内铜平衡1 6 9 m n k 的转移是需要能量的 可逆的 这一过程不需 要合成新的蛋白 而且m n k 蛋白水平和m r n a 转录保持恒定 与c u 化学性质类似的a g 也能刺激m n k 的转移 m n k 蛋白的重新定位至少需要n 端6 个金属结合区中的2 个 7 0 1 此外c 端2 个亮氨酸是m n k 从质膜回到t g n 时所必需的口 w n d 蛋自在肝脏排泄铜及 结合铜到血浆铜蓝蛋白 w i l s o n sd i s e a s e 病人的肝脏和脑积累铜 导致肝硬化 w n d 蛋 9 查竺 查竺竺苎竺 竺 g 望垦竺 垒堡垒 苎兰 查 兰苎竺竺 白位于肝脏和脑细胞的t g n 上 也可从t g n 转移到细胞质的小泡囊上旧 1 3 2 4 铜离子的排泄途径 这是细胞内铜稳态调节的最后一环 也是目前知之最少的一个环节 有学者认为 a t p t b 直接参与了铜经肝细胞胆管面排出的过程 但也有利用免疫组化技术分析认为 a t p 7 b 未与细胞膜结合 因此存在另外的a t p 依赖性铜转运的过程 1 4 铜转运p t y p ea t p a s e 研究进展 1 4 1p t y p e a t p a s e 结构和功能 p t y p ea t p a s e 总科 s u p c r f a m i l y 是利用a t p 水解释放出的能量 通过主动运输 在逆离子浓度梯度条件下将特定的离子跨膜运出细胞外 大类蛋白 一般为一单链 大 分子的催化单体 分子量在7 0 2 0 0 k d 之间 其底物包括各种阳离子f 捌 p t y p ea t p a s e 作用时形成一个磷酸化中间体 因此命名为p t y p e 受微量的钒酸盐抑制 有许多共 同的保守结构区 7 4 7 5 植物p t y p ea t p a s e 结构上有一单一亚单位 8 1 2 个跨膜结构区 1 m n 一和c 端暴露在细胞质中 有一包括磷酸化和a t p 结合位点在内的位于细胞 质中大的中心功能结构域 p t y p ea t p a s e 根据所运输的离子不同分为5 个主要的类型 7 5 1 p l a a t p a s e 主要运输k p l b a t p a s e 主要运输c u a g c u 2 c d 2 z n 2 p b 2 c 0 2 p 2 a a t p a s c 主要运输c a 2 m n 2 包括s e r c a 泵 虢b a t p a s e 主要运输c a 2 包括p m c a 泵 p 2 c a t p a s e 主要运输n a k h k p t y p ea t p a s e 参与细胞多种基本活动进程 如为次级运输体制造和维持电子梯度 植物和真菌中的i a r p a s e 动物中的n a k a t p a s e 为细胞信号提供能量 c a 2 a x p a s e 运输重要的微量元素 z n 2 c u 2 a t p a s e 细胞累积过多离子时 负责将这些离子排出细胞外 尽管在某些细菌和古生物基因组 如伯氏疏螺旋体b o r r e l i ab u r g d o r f e r i 和极端嗜热 i 描p y r o c o c c u sh o r i k o s h i i 没有发现p t y p ea t p a s e 7 6 1 旦p t y p ea t p a s e 仍然是真核生物 1 0 查竺 主堡查苎竺 鱼堑墨竺呈 竖垒 兰塑兰 圭竺兰查竺竺 必不可少的一类离子泵 在全基因组测序的真核生物中 拟南芥的基因组中鉴定出4 7 个 p t y p ea t p a s e 是至今在单个生物体中发现最多p t y p ea t p a s e 的物种 粟酒裂殖酵母 s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e 中有1 4 个 酿酒酵母 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 有1 6 个 秀丽隐杆线虫 c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s 有2 1 个 黑腹果蝇 d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 有1 4 个 原核生物大肠杆菌 e s c h e r i c h ic o l i 中鉴定出4 个p t y p ea t p a s e h t t p w w w p a t b a s e k v l d k 所有的p t y p ea t p a s e 有4 个高度保守的功能区 表明它们有共同的基础结构 4 个保守的功能区分别是 磷酸化作用区 d k t g t 基序 其中的天门冬氨酸残基能发生磷酸化形成高能磷酸中 间产物 转运阳离子到膜对面 磷酸酯酶膜转导区 t g e 基序 主要将a t p 水解产生的能量转移至阳离子转运区 a t p 结合区 在羧基端含d g d 基序 连接a t p 结合区与参加阳离子结合和转导的跨膜区的保守功能域 m x g d g x n d x p 结构 1 4 2p 1 8 a t p a s e 的分类 p l b a t p a s e 是p t y p ea t p a s e 的一个亚族 存在于各种生物中 在细菌 古细菌 真 菌中都有发现 负责c u a g c i l 2 c d 2 z n 2 p b 2 c 0 2 重金属离子的跨膜运输 7 5 7 7 8 0 l 对维持细胞内金属离子平衡起主要作用 根据系统发育分析和底物特异性 p l b a t p a s e 分4 类 这4 类的信号序列也有所不同 这4 类分别是 p l b l 运输c u p i b 2 运输 搿 p l b 3 运输c u 2 p l b 4 运输c 0 2 当金属离子的化学性质相似时 p m a t p a s e 会转变其底物专一性 如c u a t p a s e 能运输a 暑 z n 2 a t p a s e 可以运输c d 2 p b 2 1 4 3p l b a t p a s e 在生物体中的作用 早期的生命形式中 p 1 b a t p a s e 的主要作用可能是细胞质中的金属解毒 随着生物 的进化 一些p 1 b a t p a s e 转为为需要金属作为辅基的酶运送金属离子 p i b a t p a s e 赋予 细菌和古生物对重金属的耐受性 在高等真核生物 它们主要负责金属微量元素的吸收 分布和清除 总的来说p l b a t p a s e 在生物体中的作用主要表现在两方面 一是将生物体必需的微量金属元素运输到细胞内正确的区室 c o m p a r t m e n t 和目标 散 睛囊 曹g x c r 的p t y p ea t p a s e i 囡克 t 与囊j 鞋铲析 蛋白 保持细胞内金属离子浓度平衡 这方面的机制在酵母和细菌中有详细说明 二是营养和金属解毒作用 一些p l b a t p a s e 在植物营养中起着将微量元素运输到细 胞各处的功能 当外部金属离子浓度过高时 它们起着解毒作用 将金属离子泵出质膜 或将金属离子捕获储存在液泡中i g l 1 4 4p m a t p a s e 的分布 p m a t p a s e 与其它p t y p ea t p a s e 亚族不同的一点是它存在于所有的生物界中 p i b a t p a s e 首先在原核生物中被鉴定 如金黄色葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 质粒 p i 2 5 8 1 8 2 目蓿根瘤菌 r h i z o b i u mm e l i l o t o i s 3 1 肠球菌i s 4 e n t e r o c o c c u sh i r a e 在这些生 物体中p l b a 订a 的作用是维持金属特别是铜和锌的体内平衡 已报导的古生物基因组中 7 9 州也鉴定出p l b a t p a s e 古生物的p l b a t p a s e 表现为不同的 底物特异性与相当大的结构稳定性 8 5 8 7 嗜超高温硫酸根还原古细菌 a r c h a e o g l o b u s f u l g i d u s 有2 个p m a t p a s e c o p a 和c o p b 分别运输c u c u 2 说明生物体在不同的氧化还原状况下 利用不同类型的p 1 b a t p a s e 排出不同形 态的铜 8 5 8 6 真菌和动物基因组含有2 个编码c u a t p a s e 的基因 7 5 7 9 1 研究得最为深入的是人类 的2 个p l b a t p a s e a t p 7 a 手i a t p 7 b 这2 个基因突变导致m