（无机化学专业论文）荧光染料与牛血清白蛋白的作用研究.pdf

摘要 摘要 血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质 具有许多重要的生理 功能 能和许多化学物质以不同方式结合 并携带这些物质通过血液在 体内进行转运 运输 分配和代谢 蛋白质测定在临床医学和生命科学 研究中具有重要意义 小分子配体同生物大分子的作用是研究生命现 象和药物作用机理的一个基本问题 荧光探针是研究上述问题简单易 行的方法 一些染料小分子可与生物大分子结合 且其光谱呈现出能 量转移特征 即发生荧光的加强或淬灭 从这种现象可以得到许多信 息 特别是可用来测定生物分子与某些基团 如蛋白质的芳香氨基酸 到配体 之间的距离 因此常被称为 光谱尺 这种方法是染料作 为探针来探测蛋白质的信息 目前 这个研究领域正受到科研工作者 越来越广泛的重视 本文建立了一套测定荧光染料与蛋白质相互作用 的方法 主要测定它们的结合常数 作用类型 能量转移和蛋白质的 构象等 本文在研究过程中主要采用紫外光谱法 荧光光谱法 研究了荧 光素 铬黑t 铬蓝黑r e r i o c h r o m e b l u e b l a c k 结晶紫 c r y s t a l v i o l e t 台酚蓝 t r y p a nb l u e 阿尔新蓝 a l c i a nb l u e8 g x 等六 种染料与牛血清白蛋白 b s a 的作用机理 观察它们在p h 7 4 的 t r i s n a c i h c l 缓冲溶液中与牛血清白蛋白 b s a 会生成不同的缔合 物 给体 受体问发生了能量转移 进一步求出它们在不同结合数下 的生成常数k 及它们的能量转移效率e 值 给体一受体之间的距离等 摘要 还应用同步荧光光谱研究了染料和蛋白质的结合模式 并应用紫外光 谱监测了它们的最大吸收峰变化情况 结果表明 牛血清白蛋白有两个色氨酸残基 它们都可能与染料 分子发生结合和能量转移 从六种染料对牛血清的荧光光谱来看 它 们有着类似的作用 它们的生成常数均在1 0 5 以上 据此可说明它们 的结合较牢固 从能量转移效率和给体 受体问的距离r 来看 牛血 请对铬蓝黑r 的能量转移最大 而r 又最小 说明能量转移效率是和 相互之间的距离成正比 从生成常数大小来看 结晶紫的k 旺 和 k aq 最大 但能量转移效率e 却最小 可见结合的稳定与能量转移 并不成正比关系 给体 受体作用距离的增加 会大大降低能量转移 效率 而能量转移效率的大小与药剂对生物大分子的影响 两者问的 作用强度有直接关系 因而对药剂功能的研究有参考价值 我们通过研究发现荧光染料与白蛋白的结合比较牢固 它们的结 合区域是非特异的 本文的实验结果支持了前人在多数情况下染料与 大分子结合比较牢固 它们的结合区域是非特异的结论 关键词 血清白蛋白 染料 给体与受体 相互作用 a b s t r a c t a b s t r a c t s e r u ma l b u m i ni st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni nb l o o d a n di th a sm a n y i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s d i f f e r e n tk i n d so fc h e m i c a ls u b s t a n c e s c a nb ec o m b i n e dw i t hs e r t l ma l b u m i ni nd i f f e r e n tw a y s a n dt h e ya r e t r a n s p o r t e d d i s t r i b u t e da n dm e t a b o l i z e di nb o d yt h r o u g ht h eb l o o d t h e d e t e r m i n a t i o no fp r o t e i nh a sv i t a l s i g n i f i c a n c ei nt h ec l i n i c a lm e d i c i n e a n di nt h el i f es c i e n t i f i cr e s e a r c h e s s t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o no fs m a l l m o l e c u l em a t c h e d b o d yw i t h b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l ei sab a s i c q u e s t i o no fs t u d y i n gt h eb i o l o g i c a lp h e n o m e n aa n da c t i o nm e c h a n i s mo f m e d i c i n e t h ef l u o r e s c e n c ep r o b ei sa n e a s ya n df e a s i b l em e t h o do f r e s e a r c h i n gt h a tq u e s t i o n s o m es m a l ld y em o l e c u l ec a nc o m b i n ew i t h b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e a n dt h e i rs p e c t r u m si n d i c a t et h a tt h ee n e r g y t r a n s f e r t h ep h e n o m e n o no ff l u o r e s c e n c e s t r e n g t h e n s o r q u e n c h e s o c c u r r e n c e m u c hi n f o r m a t i o nm a yb e o b t a i n e df r o mt h i sk i n d o f p h e n o m e n o n w h i c hs p e c i a l l ym a yd e t e r m i n et h ed i s t a n c eb e t w e e nt h e b i o l o g i c a lm o l e c u l ea n dc e r t a i ng r o u s e s f o re x a m p l eb e t w e e np r o t e i n f r a g r a n t a m i n oa c i da n d m a t c h e d b o d y t h e r e f o r e i ti sc a l l e d t h e s p e c t r u mr u l e r i ti sam e t h o dt op r o b et h ei n f o r m a t i o no ft h ep r o t e i nb y d y ep r o b e a tp r e s e n t s c i e n t i s t sa r ep a y i n gm o r ea t t e n t i o nt ot h i sr e s e a r c h f i e l d t h i sp a p e rh a ss e tas e to fm e t h o d st od e t e r m i n et h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nf l u o r e s c e n c ed y ea n db s a m a i n l yd e t e r m i n e st h e i rc o n s t a n to f c o m b i n i n g t h ee n e r g yt r a n s f e ra n dt h ep r o t e i nc o n f o r m a t i o na n ds oo n t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fb s aw i t h f l u o r e s c e i n c h r o m i u mb l a c kt e r i o c h r o m eb l u eb l a c kr c r y s t a l v i o l e t t r e p a n sb l u e a n da l c i a nb l u e8 g xi nf l u o r e s c e n ta n du l t r a s p e c t r u m d y ea n db s aa r ea b l et of o r md i f f e r e n ta s s o c i a t i o ni nt h e p h 7 4t r i s n a c l h c i c u s h i o ns o l u t i o n t h ee n e r g yt r a n s f e rb e t w e e n d o n o ra n da c c e p t o r f u r t h e r m o r e w eh a v ea l s og o tt h ee n e r g yt r a n s f e r r i n g e f f i c i e n c yea n dt h ed i s t a n c eo fd o n o ra n da c c e p t o ra n ds oo n t h e c o n f o r m i n go fb s ah a sb e e ns t u d i e db ys y n c h r o n i z a t i o nf l u o r e s c e n c e s p e c t r u m a n dt h e i rb i g g e s ta b s o r p t i o np e a kc h a n g es i t u a t i o nh a sb e e n s t u d i e db yu s i n gu l t r a v i o l e ts p e c t r u m t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tb s ah a st w ot r y p t o p h a nr e m n a n tb a s e s t h e y a r ea l lp o s s i b l yt ob i n dd y em o l e c u l e a n dt h ee n e r g yt r a n s f e r a c c o r d i n g t ot h ef l u o r e s c e n c e s p e c t r u mo fs i xk i n d s o fd y e sw i t hb s a t h e i r f u n c t i o ni ss i m i l a r t h e i ra s s o c i a t i o nc o n s t a n tki sa b o v e10 5 t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a tt h e i r b i n d i n g i sr e l i a b l e l o o k e df r o mt h e e n e r g y t r a n s f e r r i n ge f f i c i e n c ya n dt h ed i s t a n c eo fd o n o ra n da c c e p t o r t h ee n e r g y t r a n s f e r r i n ge f f i c i e n c yo fb s aw i t he r i o c h r o m eb l u eb l a c kri sb i g g e s t b u tt h ed i s t a n c eo fb s aa n de r i o c h r o m eb l u eb l a c kri ss m a l l e s t i ti s e x p l a i n e dt h a tt h ee n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c yc o m p a r ew i t ht h ed i s t a n c eo f d o n o ra n d a c c e p t o r a n d t h e y a r ed i r e c tr a t i o l o o k e df r o mt h e i r a s s o c i a t i o nc o n s t a n tk k 2 a n dk a 4 1o fc r y s t a lv i o l e ti sb i g g e s t b u t a b s t r a c 1 1 e n e r g y t r a n s f e r e f f i c i e n c y eo fc r y s t a lv i o l e ti s a c t u a l l y s m a l l e s t o b v i o u s l yb i n d i n gs t a b i l i t yc o m p a r e sw i t ht h ee n e r g yt r a n s f e ra n dt h e y a r ei n a d e q u a t ed i r e c tr a t i o t h ei n c r e a s i n gd i s t a n c eo fd o n o ra n da c c e p t o r c a nr e d u c et h ee n e r g yt r a n s f e r r i n ge f f i c i e n c yg r e a t l y b u tt h ef u n c t i o n i n t e n s i t yb e t w e e nt h ee n e r g yt r a n s f e r r i n ge f f i c i e n c ya n dt h ei n f l u e n c eo f m e d i c a m e n tt ob i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l eh a v ed i r e c tr e l a t i o n s t h u si t h a sr e f e r e n c ev a l u et om e d i c a m e n tf u n c t i o nr e s e a r c h w ef i n dt h a ti ti saf i x e dc o m b i n a t i o nb e t w e e nf l u o r e s c e n c ed y ea n d b s aa n dt h e i rc o m b i n i n ga r e ai s n o n s p e c i f i c w h i c hp r e d e c e s s o r s h y p o t h e s i si ss u p p o r t e dp o w e r f u l l yb yt h ee x p e r i m e n td e s c r i b e di n t h i s p a p e r k e y w o r d s s e r u m a l b u m i n d r e s d o n o ra n da c c e p t o r i n t e r a c t i o n v 第一章引言 第一章引言 1 1 血清白蛋白的结构 功能及光谱性质 生命活动涉及到许许多多种物质的参与 相互作用和转化 其中最重要 最基 本的物质当属核酸与蛋白质等生物大分子 核酸在生物休内的含量虽少 但携带着 生命活动一切必要的遗传信息 蛋白质在体内的含量比核酸大的多 不仅量大 而 且种类繁多 生物体就是靠种类繁多的蛋白质来完成其生物功能的 血清白蛋白 s a 是血浆中含量最丰富的蛋白质 容易较大量 高纯度地制备 为研究蛋白质的理化 性质 生物学功能 在体内代谢 临床应用及遗传变异等方面提供了极好的蛋白质 样品 本节简要介绍血清白蛋白的理化性质 结构 生理功能及光谱性质 1 1 1 血清白蛋白的结构 2 3 1 蛋白质分子有不同的结构层次 一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三 级结构 四级结构 蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸序列 一级结构决定高级结构 决定蛋 白质的生物学功能 从4 0 年代起 许多研究者就致力于白蛋白氨基酸序列的测定 但直到7 0 年代末才对牛血清白蛋白 b s a 人血清白蛋白 h s a 鼠血清白蛋白 r s a 的氨基酸序列基本弄清楚 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质 分子量约为6 6 5 0 0 h s a 肽 链含有3 5 个半胱氨基酸残基 仅3 4 位上有一个疏基 其余都为二硫键 二硫键中 有8 对组成交叉二硫键 只有接近n 端的是一个单个二硫键 二硫键对维系蛋白质 空间结构的稳定性起着重要作用 h s a 含有十八个酪氨酸残基 t y r 在2 1 4 位上含 有一个色氨酸残基 t r p n 端为门冬氨基酸残基 a s p c 端为亮氨酸残基 l e u b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质 其氨基酸序列与h s a 非常类 似 b s a 肽链也含有3 5 个半胱氨基酸残基 仅3 4 位上有一个疏基 其余都为二硫 键 二硫键中有8 对组成交叉二硫键 只有接近n 端的是一个单个二硫键 与h s a 不同的是 b s a 在1 3 4 及2 1 2 位上都含有一个色氨酸残基 t r p 因此两者的荧光 性质略有不同 蛋白质二级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部的有规则的构象 如 一螺 旋 3 o 一螺旋 矿螺旋 矿折叠 俨转角以及三股螺旋等 还包括无规则卷曲以及非 氢键维系的规则结构和侧链的构象 血清白蛋白氨基酸残基中约4 8 排列为n 一螺旋 5 为口一折叠 其余卷曲回折成球状分子 荧光染料与牛血清白蛋白作用的光谱研究 h s a 和b s a 的三维晶体结构有三个类似的结构域 i i i i i l 每个结构域又 含有两个亚结构域 a b 和c 以槽口相对的方式形成圆筒状结构 每个亚结构域又 分为三个螺旋 x y z 凡乎所有疏水性氨基酸都包埋圆筒腔内部 构成疏水性腔 每个结构域本身都是紧密装配的 但结构域之间的关系相当松懈 形成裂缝 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白中亚基的种类 数目 空间排布以及亚基间的 相互作用 1 1 2 血清白蛋白的理化性质 j 血清白蛋白在血浆中含量约为4g 1 0 0m l 血浆 占血浆总蛋白的6 0 s a 是血 浆蛋白质中少有的非糖蛋白之一 人血清白蛋白h s a 在p h 7 4 条件下 具有1 8 个 净负电荷 离子强度0 1 5 时 等电点在4 7 在p h8 6 时 电泳分析得单一区带 a o k i 和f o r s t e r 提出白蛋白存在同分异构体 他们将p h4 5 时电泳图谱的白蛋白称 为n 型 n o r m a l 即正常型 而将p h3 5 4 5 条件下电泳于n 型之前的白蛋白命 名为f 型 f a s t 这两种蛋白型体能够可逆的互相转变 f 型蛋白是n 型蛋白的伸 展构象 蛋白分子中的螺旋倾向于分开 分子变长的膨胀构象 n 型是白蛋白在 p h 4 0 时的稳定形式 在p h8 附近 蛋白转变为另一种膨胀的b 构象 1 1 3 白蛋白的生理功能 白蛋白是血液缓冲系统的组分之一 具有营养作用 是维持血液胶体渗透压的 主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体 具有重要的生理意义 1 血液缓冲剂 血浆白蛋白象其它蛋白一样具有两性性质 能与酸碱结合 白蛋白等电点低于 正常血液p h 它是弱酸 一部分以酸的形式存在 另一部分与阳离子 主要是n a 结合成弱酸盐 这两部分形成缓冲对 构成血液总缓冲系统的较少部分 2 营养作用 在生命活动中 组成组织和器官的蛋白质 经常不断地进行新陈代谢 血浆蛋 白质在体内分解产生的氨基酸可参与氨基酸代谢池 用于组织蛋白等合成 参与维 持体内蛋白质的动态平衡 自蛋白对细胞具有较高的价值 3 维持血浆胶体渗透压和液体交换 正常人血浆渗透压在3 7 时 约为7 7 个大气压 血浆中蛋白质浓度大于组织 液 故具有较高的渗透压 血浆与组织液渗透压差称为血浆的有效渗透压 正常约 为1 5 m m h g 它有从组织问隙吸收水分进入血循环的作用 在证常人体微循环中 血浆与组织液问不断频繁的交换液体及溶于水的营养物质和代谢产物 在新陈代谢 第一章引言 中起重要作用 4 运输功能 血清白蛋白是血浆蛋白质中具有广泛结合能力的蛋白质 能结合内源性和外源 性物质 能结合大 中 小分子的化合物 也能同难溶于水和溶于水的物质相结合 具有重要的生理意义和临床意义 j 血清白蛋白能与许多化合物结合 可能与它的 构象适应性 有关 在生理条 件下 白蛋白的结合部位易变 几乎能以相同能量产生不同的构象 因为它的螺旋 内维系力量较弱 当与某化台物结合时 螺旋分开 肽链内残基侧链方位改变 导 致分子表面活性基团适宜分布 新的结合位点随之产生 发生构象变化和协同效应 白蛋白分子表面结构疏松 对于白蛋白在血浆中起着运输载体及解毒剂的作用可能 具有重要意义 1 1 4 血清白蛋白的变 眭1 4 蛋白质变性后 其物理性质 如溶解度 结晶能力 紫外吸收光谱 荧光光谱 化学性质 如水解速度 与某些试剂反应的能力等 以及生物性质 如酶的催化活性 抗体与抗原的专 结合能力等 都会发生变化 变性可以涉及次级键 二硫键的断裂 但不涉及一级结构的变化 能够引起蛋白质变性的因素很多 1 温度 蛋白质在5 0 6 0 c 的溶液中 经过一段时间 往往发生热变性 热变性 仅仅涉及次级键的变化 2 酸 碱 大多数蛋白在p h4 1 0 之间是稳定的 超过这个范围 就发生变性 这种变性作用是通过静电作用来实现的 不同种蛋白对酸碱的稳定性不同 3 表面活性剂 表面活性剂 十二烷基硫酸钠 s d s 溴化十六烷基三甲胺 c t a b 很容易与蛋白质结合 这类变性剂不需要高浓度 在很低的浓度下就能与 蛋白结合 使蛋白的构象发生变化 4 盐 在蛋白质的研究中广泛地使用了各种盐以维持一定的离子强度 不同的盐 对蛋白质的构象有着不同的影响 另外 有机溶剂 尿素等也能引起蛋白质的变性 1 1 5 血清白蛋白的光谱性质 4 l 1 紫外光谱 血清白蛋白能够吸收紫外光 由于色氨酸t r p 酪氨酸t y r 残基对光的吸收 大 多数蛋白质在2 8 0n n l 附近有一 个吸收峰 苯丙氨酸p h e 残基的吸收峰在2 5 7n m 附 近 肽键在2 2 5n n l 附近有一较强的吸收峰 在2 8 0n m 处 血清白蛋白溶液的光吸 荧光染料与牛血清白蛋白作用的光谱研究 收与其含量成正比 可用作定量分析 当血清白蛋白生色基所处的环境发生变化时 其紫外吸收光谱随之发生变化 吸 收峰红移或者蓝移 吸光度及谱带亦有变化 变化前后的光谱之差称之为差光谱 d i f f e r e n t j a ls p e c t r u m 利用紫外差光谱可以获得蛋白质的结构信息 差光 谱的种类很多 常用的有溶剂微扰差光谱 p h 差光谱和变性差光谱等 利用溶剂微 扰差光谱可以探测血清白蛋白分子中生色基团的暴露程度 利用p h 差光谱作为指标 可以研究在变性因素下血清白蛋白的变性过程 2 荧光光谱 血清白蛋白分子中的色氨酸t r p 酪氨酸t y r 和苯丙氨酸p h e 残基能吸收紫外光 并且能发射荧光 所以血清白蛋白具有天然荧光 由于t r p t y r 和p h e 的r 基团不 同 三者的荧光光谱也不同 其荧光峰位分别是3 4 8 3 0 3 和2 8 2n m t r p 的荧光 强度最大 p h c 的荧光强度很小 血清白蛋白的内源荧光主要是t r p 和t y r 残基所发 射的 荧光光谱法可以研究血清白蛋白分子的构象变化 研究t r p 或t y r 残基的微环 境以及研究血清自蛋白的变性等 现在 常用荧光探针技术 外源荧光法 来测定血 清白蛋白的含量或进行构象等方面的研究 这种技术比利用蛋白质的内源荧光有更 高的灵敏度 3 圆二色谱法 血清白蛋白的圆二色谱分为远紫外区 1 8 5 2 4 5 n m 和近紫外区 2 4 5 3 2 0n m 远紫外区是肽键的吸收峰范围 反映了主链构象 在远紫外区 一般天然蛋白质的 c d 光谱包含一个正峰 1 9 0n r l l 左右 和一个负槽 2 0 5 2 3 5n m 其中 负槽的形状 与主链形状密切相关 一般的说 a 螺旋给出2 0 9n n l 和2 2 2n n l 左右的两个负槽 称为双槽曲线 口一折叠给出2 1 5 n m 的负槽 研究血清白蛋白的主链构象用远紫外c d 谱 由远紫外c d 谱可以推算出血清白蛋白分子中a 一螺旋 俨折叠以及无规则卷曲 的含量 近紫外区主要与侧链生色基团有关 二硫键在2 5 0 2 6 0n n l 有一个峰 t r p 和t y p 和p h e 三个侧链的峰在2 3 0 3 1 0n m 之间 4 激光拉曼光谱 激光拉曼光谱能够显示血清白蛋白分子中肽键的特征性振动谱带 上链骨架的 振动谱带 以及侧链的振动谱带 许多谱带相互重叠 给谱带的解析带来困难 其 中能够解释的比较清楚的 要算是肽键的特征性振动谱带 由于肽键 酰胺键 的环 境是血清白蛋白主链构象的主要反映 因此 可以利用肽键的特征性振动谱带作为 第一章引言 指标 来推断血清白蛋白主链构象 用激光拉曼光谱法 己经能够对血清白蛋白分 子中的三种二级结构 n 一螺旋 伊折叠以及无规则卷曲 作出确切的分析 但是 要 对血清白蛋白的所有谱带都做出解释 还需深入研究 在上述几种光谱方法中 荧光光谱法 紫外光谱法有着广泛的应用 荧光发射 峰位置 荧光偏振 能量转移 荧光寿命等指标可以对荧光生色团的结构及其所处 的微环境提供有用的信息 蛋白质内源荧光可用于定量分析或结构研究 利用荧光 探针技术不仅可以提高荧光测定的灵敏度 而且可以获得更丰富的结构或反应机理 方面的信息 据此可以判断它们之间相互作用力的类型 强弱 结合数 结合常数 结合区域和给体和受体间的距离等信息 1 2 染料与血清白蛋白相互作用的光谱研究进展 染料与血清白蛋白的相互作用研究主要针对蛋白质临床分析检验 并将染料作 为光谱探针应用于临床分析检验 蛋白质分子中含有色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸残基 在紫外光区有吸收 且在3 4 0 3 5 0 n m 波长范围内有内源荧光发射 但其内源光谱所 反映的信息不完整 灵敏度较差 在检测分析中实用价值有限 因此 常利用染料作为 光谱探针应用于蛋白质检测分析中 近年来 为进一步完善检测方法 对一些染料和 蛋白质的相互作用机理进行了深入研究 染料分子与血清白蛋a 相互作用的研究是介于化学与生命科学之间的边缘性课 题 从化学研究的角度来看 血清白蛋白与染料结合反应的研究主要包括结合位置 结合数及结合常数 作用力类型 共存物质的影响等 根据在蛋白质检测分析中对 染料的不同应用方式 染料可作为蛋白质检测的荧光法探针 分光光度法探针和共振 瑞利散射探针等 用荧光法研究染料分子与蛋白质的结合反应可以综合利用蛋白质 和染料的荧光猝灭 荧光敏化 能量转移和实验条件的影响等方面的信息 因而是 主要的研究手段之一 很多染料在与蛋白质分子结合时 会发生颜色变化 晟大吸收 峰改变 且在一定范围内其吸光度变化与蛋白质浓度成线性关系 由此可建立蛋白 质检测分析方法 目前 在早期研究的基础上 又有许多蛋白质吸光光度法测定染料 光谱探针被研究开发 1 2 1 研究内容与方法 1 结合部位的确定 用荧光法确定染料分子在血清白蛋白上的结合部位常用如下方法 根据f o r s t e r 能量转移理论来求染料与色氨酸残基之间的距离 5 1 在蛋白质分子 荧光染料与牛血清白蛋白作用的光谱研究 中 能发射荧光的氨基酸残基有色氨酸 酪氨酸和苯丙氨酸残基 它们的荧光光谱 各不相同 蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发出的 利用f o r s t e r 能量转移理论 可 以求出和蛋白质作用的染料与色氨酸残基之间的距离 由此推测染料与蛋白质结合 的空间部位 能量转移作用可以发生在染料一蛋白质复合物内部 也可以发生在染料 与蛋白质分子之间 在后一种情况时 求得的染料与色氨酸残基之间的距离表示分 子扩散过程中染料分子与色氨酸残基的最近距离隅 根据偶极一偶极无辐射能量转移理论 给体分子 或基团 与受体分子 或基团 之间发生能量转移必须满足以下条件 一是给体必须发荧光 二是给体的荧光发射 光谱与受体的吸收光谱必须有足够的重叠 三是给体与受体之间的距离最大不超过 7 1 0 n m 能量转移效率e 与给体一受体间距离r 及临界能量转移距离r 有关 e i 心 r 0 6 r 6 1 1 其中凰是能量转移效率为5 0 时的临界距离 r 0 6 8 8 10 1 k n1 j t l i c m 6 1 2 1 式中 为偶极空间取向因子 一般取k 2 2 3 n 为介质的折射指数 对于稀溶液取水的n 1 3 3 6 m o 为给体的光量子产率 j 为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的光谱重叠积分 可表示为 j f o u e a u d 4 i f do o u 1 3 其中 f o u 为荧光给体在波数为u 的荧光强度 u 为受体在波数为u 的摩尔吸光系数 能量转移效率可通过实验由下式测定 e i f f o 1 4 其中 f 和f o 分别为能量接受体存在和不存在时能量给予体的荧光发射强度 显然 只要得知e k 2 西d 和n 并通过实测光谱求积分j 就可算出r o 和r 2 结合位点数与结合常数的测定 对于结合常数与结合位点数的求算 可以根据所研究体系的具体情况 采用适 当的测定方法 s c a t c h a r d 作图法是研究生物大分子与有机小分子结合反应的经典方 法 此法在应用时须知道反应体系中游离态有机小分子的浓度 这一点在用荧光法 进行测定时常不易做到 而且s c a t c h a r d 作图法所得结果往往不理想 因此 在研究 染料分子与蛋白质的结合反应中 s c a t c h a r d 作图法应用不多 张保林等曾用此法研 究了葸醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应 9 1 第一章引言 蛋白质与染料分子发生反应时 可引起体系荧光性质的改变 有两种情况 1 染料分子无荧光 在蛋白质溶液中加入染料后 蛋白质的内源荧光被猝灭 2 染料分子有荧光 蛋白质与染料混合后 其内源荧光被猝灭 同时染料分 子的荧光被敏化增强 染料分子对蛋白质荧光的猝灭可分为动态猝灭 静态猝灭和能量转移猝灭i m 川 在测定结合常数与结合位点数时 必须首先确定荧光猝灭的类型 能量转移猝灭的 结果 通常使受体的荧光敏化增强 在实验上易于观察 因此 需要认真区别的 是动态猝灭和静态猝灭 动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程 是与自发的 发射过程相竞争从而缩短激发态寿命的过程 碰撞猝灭过程遵循s t e m v o l m e r 方程 f o f 2 l k l q i k s v q 1 5 式中 f o 和f 分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度 k 是生物大分子的猝 灭常数 t 是不存在猝灭剂时荧光体的荧光寿命 q 是猝灭剂的浓度 k k 叫s t e r n v o l m e r 猝灭常数 是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率 因 次l m 0 1 它意味着这两种衰变途径之间的竞争 s t e r n v o l m e r 方程式说明 f o f 与猝灭剂的浓度 q 呈线性关系 由f o f q 1 作图所得直线的斜率可求出k 静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物 从而导致荧 光物质荧光强度降低的过程 此过程可用下式表示 f o f i k s q 1 6 式中 f o 和f 分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度 q 是猝灭剂的浓度 k 是基态配合物的缔合常数 上述静态猝灭f o f 与 q 的关系式与动态猝灭所获得的关系式相似 也存在着 线性关系 仅仅通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据 无法判断猝灭现象究竟 是属于动态还是静态的 区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以下实验来确定 1 1 改变温度实验 动态猝灭与温度有关 温度升高将增大扩散系数 从而增 大双分子猝灭常数 而温度升高可能引起配合物的稳定性下降 从而减小静态猝灭的 程度 可以作出同一体系的不同温度的s t e m v o l m e r 方程 根据温度对猝灭常数的关 系及k s v 的大小判断猝灭类型 如果高温的斜率大于低温的斜率 则为动态猝灭 如果高温的斜率小于低温的斜率 则为静态猝灭 荧光染料与牛血清白蛋白作用的光谱研究 2 测量吸收光谱 动态猝灭只影响到荧光分子的激发态 因而并不改变荧光 物质的吸收光谱 而静态猝灭中 基态配合物的生成往往会导致荧光物吸收光谱的改 变 3 测量荧光寿命 静态猝灭 猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命 o r i 而动态猝灭 猝灭剂的存在使荧光寿命缩短 t d c f d f 这是区分静态猝灭 与动态猝灭的最确切的方法 但受实验条件的限制 各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为2 0 1 0 l m o l i s 荧光 分子的平均寿命约为i 0s 根据k s v 的值可求出l q 的大小 如果所求得的k q 值远大 于2 0 1 0 l t o o l i s 一 则此猝灭过程为静态猝灭 在确定荧光猝灭反应为静态猝灭的情况下 根据式 1 6 作f o f q 图 可 由回归直线斜率可求得k 值 但应用式 1 6 作图 所得回归直线往往线性关系不 好 为此 将式 1 6 变形为双倒数公式 他1 f o f 一1 f 0 1 k f0 q i 1 7 式 1 7 是目前国内外作者引用最多的一个公式 式 1 6 1 7 只适用于染料与蛋白质1 l 结合的情况 对于多结合位点的情况 张勇等提出了一个求取结合位点数的线性形回归公式 13 i g f o f f l g k nl g q 1 8 由回归直线的截距和斜率可求出结合常数k 和结合位点数n 但此式应用不多 第一章引言 此外 易平贵等 4 1 也提出了求算结合位点数和稳定常数的公式 应用亦不多 3 染料分子对血清白蛋白构象的影响 血清白蛋白在溶液中存在同分异构体1 1 5 1 6 1 在p h4 5 p h 7 5 之间为n 型 p h 4 5 口h3 之间转变为部分酸膨胀f 构象 p h 8 时 为另一种膨胀的b 构象 3 种 构象能可逆转换 应该指出 同一种染料与蛋白质的不同构象形态结合情况不同 染料分子与血清白蛋白作用时 常伴随蛋白质构象的变化 利用同步荧光可以 了解染料分子对蛋白质构象的影响 由a k 1 5 n m 所作出的同步荧光光谱只显示蛋白 质酪氨酸的光谱特性 而由ax 6 0n i n 的同步荧光光谱仅表现色氨酸残基的荧光 因氨基酸残基的最大吸收波长与其所处环境的极性有关 故而由氨基酸发射波长的 改变可判断蛋白质构象的变化 若发射波长红移表明氨基酸残基所处环境的极性增 加 蓝移则疏水性增加 一般来说 蛋白质的荧光主要是由色氨酸残基发出的 故 通常作色氨酸残基的同步荧光光谱 以此判断蛋白质构象的变化 当色氨酸残基位 于疏水性介质中时 k 3 3 1 n m 部分位于疏水性介质中时 k 3 4 l n m 完全暴露于水 相时 k 3 5 l n m 4 影响结合反应的因素 能与血清白蛋白结合的共存物质会影响染料与蛋白的结合 但血液中常存的微 量金属离子不干扰测定 此外 实验条件 如浓度 酸度 反应时间及稳定性 离子 强度和溶剂 也会不同程度地影响染料与蛋白质的结合 1 2 2 主要研究结果 国外对染料与蛋白质结合反应研究较早 国内化学工作者在这方面的研究有十 几年的历史 下面总结了近年来国内作者在这方面的主要研究结果 1 分光光度法探针 方面的研究 很多染料在与蛋白质分子结合时 会发生颜色变化 最大吸收峰改变 且在一定 范围内其吸光度变化与蛋白质浓度成线性关系 由此可建立蛋白质检测分析方法 如 溴酚蓝 b p b 与白蛋白结合时 会导致溶液吸收光谱发生变化 最大吸收峰位于 6 1 0 n m 波长处 吸光度值在酸性条件下与蛋白质浓度成正比 由此建立了白蛋白分析 法 1 9 9 6 年魏永巨等 7 利用分光光度法等手段对b p b 与白蛋白的结合机理进行了研 究 证明b p b 与血清白蛋白和y 球蛋白的结合主要是静电力作用 并测出了不同条件 下b p b 与血清白蛋白和y 球蛋白的结合参数 在酸性条件下 棕红色 m a x 4 6 5 n m 的考马斯亮蓝g 一2 5 0 c b b 与蛋白质结合后 颜色变为蓝色 n n a x 5 9 5 n m 线性范围 为l 2 0 9 9 m l 目前 这仍然是一种经典的蛋白质分析测定方法 此后 在以上这些较 9 荧光染料与牛血清白蛋白作用的光谱研究 早期研究的基础上 又有许多蛋白质吸光光度法测定染料光谱探针被研究开发 魏永 巨等 l8 l 对铬天青s 与血清6 1 蛋6 1 的结合情况进行了研究 发现铬天青s 是一种良好的 蛋白质测定光谱探针 马春琪等 驯则应用平衡透析法 双波长法和摩尔比法对铬天青 s 与牛血清白蛋白 b s a 的作用机理进行了研究 发现在蛋白质等电点前后或不同铬 天青s 浓度下 铬天青s 和牛血清白蛋白有两种不同的结合模式 并求出了两者的有 关结合参数 冯喜兰等b 叫应用荷移理论对四氰基醌二甲烷 t c n q 与蛋白质的相互作 用进行了研究 发现其在v 丙酮 v 水 l 4 p h9 8 的溶液中所形成的配合物在 4 2 5 n m 处有最大吸收 在一定范围内其吸光度变化分别与b s a 和人血清白蛋白 h s a 的浓度成线性关系 并同时对t c n q 与蛋白质结合机理进行了研究 胡庆红等 2 i l 则利 用蛋白质对铬蓝s e 的退色反应 发现在p h1 0 2 0 的c l a r k l u b s 缓冲溶液中 不同蛋 白质在0 8 0 r r l 范围内 其吸光度降低值与蛋白质浓度成正比 由此建立了多种蛋 白质分光光度分析法 此外 还有氯磺酚s 1 2 偶氮胂 i i i 一镱 i 1 2 3 硝基磺酚c i 1 固氯f c f 25 j 等各种类型的染料光谱探针 这些染料在与蛋白质结合中呈现出不同特 点 2 荧光法探针方面的研究 一些具有荧光特性的染料与血清白蛋白结合后引起荧光敏化或猝灭 其荧光强 度增强或减弱的程度在一定范围内与蛋白质浓度成线性关系 如在p h2 5 3 时 曙红y 与血清白蛋白作用后 在l e x l e m 3 0 8 5 4 0 n m 处发生的荧光猝灭程度与血清白蛋白浓 度成正比 检测限可达2 0 1 a g m l l 2 6 1 b i r l a 等 应用吸收光谱和荧光技术对曙红与牛 血清白蛋白 b s a 的相互作用机理进行了研究 发现曙红与蛋白质结合符合s c h w a r z 模型 在b s a 表面有两类结合位置 其结合常数为2 6 1 0 6l m o l 由离子强度对 s t e m v o l m e r 曲线的影响 可得出曙红与b s a 的结合主要为静电作用力 微量蛋白质对水溶性卟啉衍生物旺 p 托8 四 对磺苯基 卟啉 t p p s 4 可产生荧 光猝灭作用1 2 由此可对微量蛋白质进行测定 而另一种卟啉衍生物a p 8 四 对 羧苯基 卟啉 t c p p 1 2 9 在酸性条件下其本身荧光很弱 白蛋白可使其荧光增强 而球 蛋白对其荧光影响不大 但当有十二烷基磺酸钠 s d s 存在时 白蛋白和球蛋白对其 均有荧光增强作用 由此可在一个体系中分别测定白蛋白和球蛋白 高峰等i3 0 l 研究了 耐尔蓝 n b 一十二烷基苯磺酸钠 s d b s 一蛋白质体系的荧光情况 发现在适宜浓度的 s d b s 存在下 耐尔蓝以二聚体的形式存在 本身具有很弱的荧光 当加入h s a 后 荧 光强度显著增强 且有良好的线性关系 由此建立了蛋白质测定新方法 此外 还有吖 啶橙 i 四磺基铝酞菁1 3 2 3 3 1 四碘荧光素br n i 等 此外 一些染料也作为共振瑞利散射 第一章引言 探针 如金橙g 3 5 1 系列染料在p ho 6 2 0 时与血清白蛋白结合能产生很强的共振瑞 利散射 可用于血清白蛋白检测 此方法在0 5 0 p g l 范围内b s a 检出限为2 6 1 x g l 而对h s a 检出限则为3 4 p g l 吴会灵等1 36 j 对依波西隆蓝与蛋白质作用的共振光散射 进行了研究 发现其共振光散射信号增强与血清白蛋白浓度在o 2 3 0 m g l 范围内 成线性关系 对b s a 检出限为3 8 1 t g l 而对h s a 检出限为4 1 9 9 l 1 2 3 存在的问题 利用公式 1 6 j 1 7 和 1 8 求算结合位点数和结合常数看来较为简单 但实际上 存在不少问题 首先蛋白质分子上的结合位点不一定是等同的和独立的 结合位点 之间可能存在影响 理论模型本身就是一种近似 其次 在计算中要求知道游离染 料分子的浓度 q 这一数值往往不易得知 计算中多利用染料的总浓度代替 q 作图 这样势必带来误差 总之 在这方面还缺乏准确的方法 有待进一步研究 1 2 4 文献报道的准确性 在现有文献中 发现不同作者对同一体系的研究结论不一致 例如 环丙沙星 对牛血清白蛋白荧光的猝灭 文献 8 认为是动态猝灭 文献 3 7 认为是静态猝灭 丝 裂霉素与牛血清白蛋白的结合 文献 1 3 认为是1 l 结合 文献 1 4 认为是 2 结合 这种情况说明目前对于有机小分子与蛋白质结合反应的研究 理论和实验上都有待 完善 1 2 5 国内外研究方法的比较 比较国内外的研究论文 可以看到在研究方法上有较大的差异 国内用荧光法 紫外