（环境科学专业论文）基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响.pdf

基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 高浓度( 1 6 0l a g l ) 氟虫腈处理的幼鱼运动活力显著降低，对光照条 件的变化更为敏感。 ( 2 ) 以a b 品系斑马鱼为模式生物，研究了氟虫腈外消旋体和两个不 同对映体对斑马鱼的早期发育及行为影响的选择性差异。结果显示： 氟虫腈对斑马鱼胚胎幼鱼的发育毒性具有对映体选择性，其毒性从大 n d , j i l 页序为：外消旋体 ( + ) - f i p r o n i l r - ( - ) - f i p r o n i l 。同时，对斑马 鱼幼鱼光周期刺激实验结果发现：在高浓度( 1 6 0g g l ) 下，经氟虫 腈外消旋体处理的幼鱼对光刺激最敏感，两个对映体之间无显著性差 异。在低浓度( 4 0p 叽) 下，外消旋体及两个对映体对幼鱼运动行为 没有显著性差异。 ( 3 ) 以a b 品系斑马鱼为模式生物，研究了氟虫腈与重金属铜对鱼类 早期发育的联合毒性作用。结果表明：两者对胚胎孵化率的影响为协 同作用，对胚胎死亡及幼鱼身体弯曲表现为相加作用。 上述研究结果表明氟虫腈对斑马鱼的早期发育及行为具有毒性 效应，而且不同对映体在发育毒性方面存在着显著的差异，而对幼鱼 的行为影响无明显差异。此外，结果还显示环境中其他污染物质的存 在能够影响氟虫腈的水生毒性。本文的研究结果为评价氟虫腈的生态 安全和健康风险以及新农药的创制提供理论依据。 关键词：氟虫腈，斑马鱼，发育毒性，运动行为，对映体选择性 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 e n a n t i o s e l e c t i v ee f f e c to f c h i r a l i n s e c t i c i d ef i p r o n i lo nd e v e l o p m e n ta n d l o c o m o t o rb e h a v i o ri ne m b r y o n i c l a r v a l z e b r a f i s h a b s t r a c t f i p r o n i l ，o n eo ft h ep o t e n ta n de f f e c t i v ep h e n y l p y r a z o l ei n s e c t i c i d e s ， i sw i d e l yu s e df o ra g r i c u l t u r a la n dd o m e s t i cp e s tc o n t r 0 1 a l t h o u g hf i p r o n i l i sc h a r a c t e r i z e da sl o wm a m m a l i a nt o x i c ，i th a sb e e np r o v e dh i g h l yt o x i c t ob e e sa n da q u a t i co r g a n i s m s f u r t h e r m o r e ，a sac h i r a lc o m p o u n d ，f i p r o n i l u s u a l l yi n t e r a c tw i t hb i o l o g i c a ls y s t e m ss e l e c t i v e l ya n dm a yr e s u l t i n d i f f e r e n ta q u a t i ct o x i c i t y i nr e c e n ty e a r s ，g r o w i n gc o n c e r ni sp a i dt o i n v e s t i g a t et h ea d v e r s ee f f e c ta n de n a n t i o s e l e c t i v et o x i c i t yo f 邱r o n i lo n a q u a t i c i n v e r t e b r a t e s h o w e v e r , i n f o r m a t i o n o ne n a n t i o s e l e c t i v e d e t r i m e n t a le f f e c to f 邱r o n i lo na q u a t i cv e r t e b r a t e ss u c ha sf i s hi sn o t a v a i l a b l e t h e r e f o r e ，t h ep r i m a r yo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st oe v a l u a t e t h ee n a n t i o s e l e c t i v ee f f e c t so ff i p r o n i lo nl o c o m o t o rb e h a v i o ra n d d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yi ne m b r y o n i c - l a r v a lz e b r a f i s h d e t a i l so f o u rs t u d y 3 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 w e r el i s t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) z e b r a f i s h ( a bs t r a i n ) w e r eu s e dt os t u d yt h ee f f e c to ff i p r o n i lo ne a r l y d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t ya n dl o c o m o t o ra c t i v i t y r e s u l t si n d i c a t e dt h a t f i p r o n i li n d u c e dm a l f o r m a t i o n si n c l u d i n gu n i n f l a t e ds w i mb l a d d e r , b e n t s p i n ea n dr e d u c e db o d yl e n g t h a sw e l la s m o r t a l i t y o fz e b r a f i s h l o c o m o t o ra c t i v i t y a s s a y s h o w e dt h e a v e r a g es p e e do fl a r v a ew a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o la tl o wc o n c e n t r a t i o n ( 4 0 愕l ) a n dl o w e r a th i g hc o n c e n t r a t i o n ( 1 6 0 “g l ) b e s i d e s ，p h o t o p e r i o ds t i m u l a t i o nt e s t r e v e a l e dl a r v a e e x p o s e dt of i p r o n i l a t h i g hc o n c e n t r a t i o nw e r em o r e s e n s i t i v et h a nt h a ta tl o wc o n c e n t r a t i o n ( 2 ) t h ee n a n t i o s e l e c t i v ee f f e c to ff i p r o n i lo nl o c o m o t o rb e h a v i o ra n d d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yi ne m b r y o n i c - l a r v a lz e b r a f i s hw a si n v e s t i g a t e d r e s u l t si n d i c a t e dt h ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t yo ff i p r o n i lo nz e b r a f i s hw a s e n a n t i o s e l e c t i v ea n dt h et o x i c i t yo r d e rw a sr a c e m a t e 孓( + ) 一 尺- ( - ) - e n a n t i o m e r f u r t h e r m o r e ，t h ep h o t o p e r i o ds t i m u l a t i o nr e s u l t sd e m o n s t r a t e d t l l a tt h e r ew e r en od i f f e r e n t i a le f f e c tb e t w e e nt w oe n a n t i o m e r sa n d r a c e m a t ea tl o wc o n c e n t r a t i o nw h i l el a r v a ew e r e s i g n i f i c a n t l ym o r e s e n s i t i v et or a c e m i cf i p r o n i lt h a nt w oe n a n t i o m e r sa th i g hc o n c e n t r a t i o n ( 3 ) t h ej o i n te f f e c to nt h ed e v e l o p m e n t a l t o x i c i t yo ff i p r o n i la n dc u 2 十 o nz e b r a f i s hw a ss t u d i e db yt w o - f a c t o ra n a l y s i so fv a r i a n c em e t h o d s s i g n i f i c a n ti n t e r a c t i o no ni n h i b i t i n gt h eh a t c h i n go fz e b r a f i s he m b r y ow a s o b s e r v e dw h e ne x p o s e dt ot h em i x t u r eo ff i p r o n i la n dc u 2 + ，w h i l en o 4 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 s i g n i f i c a n ti n t e r a c t i o ne x i s t e d o nt h em o r t a l i t ya n dc u r v e db o a ya x i s t h ep r e s e n ts t u d yd e m o n s t r a t e dt h a tf i p r o n i lw a sa d v e r s eo nt h ee a r l y d e v e l o p m e n ta n dl o c o m o t o rb e h a v i o ro fz e b r a f i s h ，a n de n a n t i o s e l e c t i v i t y w a so b s e r v e db e t w e e nt w oe n a n t i o m e r so nt h ee a r l yd e v e l o p m e n to f z e b r a f i s h o u rs t u d yi su s e f u lf o rb r o a d e n i n go u rk n o w l e d g et or e a l i z et h e e n v i r o n m e n t a lr i s ko ff i p r o n i l k e yw o r d s ：邱r o n i l ，z e b r a f i s h ，d e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y , l o c o m o t o r b e h a v i o r , e n a n t i o s e l e c t i v i t y 5 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 第一章绪论 化学农药作为2 0 世纪最重要的发明之一，为提高农作物单位面积产量，解 决粮食问题作出了巨大的贡献【1 】。化学农药给人类社会带来福音的同时，也产生 了一系列的环境污染问题，可能会对生态安全和人类健康造成严重的危害。早期 使用的有机氯农药由于稳定性好、持久性长以及易生物富集而被淘汰。后改用有 机磷和氨基甲酸酯类农药，但是由于高残毒以及害虫抗药性的产生，它们也开始 被禁用【2 】。苯基吡唑类杀虫剂在这种背景下应运而生，它具有对靶标生物高效对 非靶标生物低毒的特点而广泛使用于农作物害虫和卫生害虫的防治。目前使用的 苯基吡唑类杀虫剂主要有氟虫腈、乙虫腈和丁烯氟虫腈三种。但是，研究表明氟 虫腈对蜜蜂和甲壳类水生生物的毒性很大，因此法国在2 0 0 4 年宣布暂时禁用氟虫 腈，中国农业部也要求自2 0 0 9 年7 月1 日起除卫生用、部分旱田种子包衣剂和专 供出口产品外，我国禁止销售和使用含氟虫腈成分的农药制剂【3 】。但是，环境中 仍普遍检测到氟虫腈及其代谢产物的存在，因此进一步研究氟虫腈对高等水生生 物及哺乳动物的毒性作用具有十分重要的意义。 1 1 氟虫腈的研究进展 1 1 1 氟虫腈的性质、用途及作用机制 氟虫腈是新一代苯基吡唑类杀虫剂，1 9 8 7 年由原法国罗纳一普朗克公司研发， 1 9 9 3 开始使用并与1 9 9 6 年在美国成功注册。氟虫腈主要用于农作物、宠物及草 坪害虫的防治，对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有 很高的杀虫活性1 4 缶1 。其使用量逐年增加，仅加利福尼亚的年使用量就从2 0 0 1 年 的35 2 0k g 增加到2 0 0 6 年的4 43 7 0k g ，增加了1 2 倍之多r 7 1 。 作为新一代新型高效的杀虫剂，氟虫腈主要有以下三方面的优点。首先，氟 虫腈的杀虫机制与传统农药不同，因此对于防治产生抗药性的害虫具有很好的效 果【6 1 。氟虫腈是一种神经毒剂，能与昆虫的y 氨基丁酸( g a b a ) 受体结合，有 效阻塞中枢神经系统的y 氨基丁酸调节的氯离子通道，干扰中枢神经系统，引起 1 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 昆虫神经和肌肉的过度兴奋直至死亡【引。s t e v e n s 等 9 1 发现相对于马拉硫磷，摇蚊 幼虫对氟虫腈更敏感，每公顷施用1 2 5g 氟虫腈的致死率比施用3 0 0 g 马拉硫磷 的高。其次，氟虫腈的杀虫活性很高，较少施用量就能有效的杀死害虫1 0 。12 】。氟 虫腈对蚊子c k ，i 绪q u i n q u e f a s c i a t u s 的4 8 - h rl c s o 为0 35p g l ，对a e d e sa e g y p t i 的 4 8 - h rl c 5 0 为7 1 4r t g m ，此外氟虫腈对葱蛆、水稻象鼻虫、白蚁等的毒性也很高 1 3 , 1 4 。第三，氟虫腈对哺乳动物毒性低。哺乳动物的g a b a a 和g a b a c 受体与昆 虫的g a b a 受体的结构相似，同属于配体门控氯离子通道家族。但是氟虫腈对这 三种g a b a 受体的亲和力是有差异的，与昆虫g a b a 受体的亲和力要比g a b a a 和g a b a c 受体的大得多”d 7 1 。研究表明氟虫腈对昆虫的毒性是哺乳动物的 7 0 0 1 3 0 0 倍 1 6 , 1 8 1 。 1 1 2 氟虫腈的环境行为 氟虫腈在土壤中不易被吸附，流动性大1 1 9 , 2 0 。淋溶实验表明3 1 - 3 7 的土壤 表层氟虫腈能够快速的转移到6 1 2 c m 的土层中【2 们。氟虫腈在土壤中的吸附程度 与土壤有机质含量、土壤类型及温度有关。当土壤有机质含量从0 1 增至6 5 ， 吸附系数k f 由4 3 增加到4 5 5 ，吸附作用增加了1 0 倍多。将土壤温度由2 2 升 高到3 5 ，吸附系数由7 3 增加到9 3 【2 1 】。y i n g 等【2 2 1 采集了澳大利亚南部八种类 型的土样观察氟虫腈的吸附情况，发现k 。值在5 4 2 到1 1 7 6 之间波动，波动幅度 较大。 氟虫腈随着农田尾水及生活污水进入水体，在地表径流中普遍存在。美国地 质勘测组抽样调查了十个州的水样，均能检测到氟虫腈的存在，其中路易斯安那 州含量最高为o 1 1 7 岭几。而在灌溉区，氟虫腈的浓度要高得多，在路易斯安那 州的m e r m e n t a u 河湾检测到氟虫腈的浓度高达5 2 9p g l 【2 3 1 。氟虫腈很难挥发【2 4 1 ， 亨利系数为6 6 0x1 0 一m 3 a t m m o l ，因此可以忽略其通过大气对环境产生影响。 氟虫腈在环境中容易降解，土壤表层的氟虫腈能够通过氧化转化为 m b 4 6 5 1 3 ；土壤中的氟虫腈能够还原为m b 4 5 9 5 0 ；水中和土壤中的氟虫腈能通过 水解转化为r p a 2 0 0 7 6 6 ；氟虫腈还能通过光解转化为m b 4 6 51 3 t 1 9 】。这些转化产 物在环境中的持久性比母体长，毒性更高，因此研究转化产物的环境风险及生态 安全已成为热剧6 ，2 5 。2 7 1 。m o h a p a t r a 等2 7 1 发现氟虫腈母体及其转化产物在葡萄叶中 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 的半衰期比单一氟虫腈的长。氟虫腈，m b 4 6 5 1 3 ，m b 4 5 9 5 0 ，m b 4 6 1 3 6 对 p r o c a m b a r u sc l a r k i i 的9 6 h rl c 5 0 分别为1 4 3 ，6 8 6 ，1 5 5 和1 1 2 岭l ，对d a p h n i a m a g n a2 1 天的e c 5 0 分别为1 9 0 ，2 3 0 ，2 7 和4 5 岭l 1 9 2 8 1 。 光解：水状的氟虫腈在自然光的照射下可发生光解，主要产物是m b 4 6 5 1 3 ，转化 速率与有机质含量、盐分有关，有机质能够竞争性的吸收光从而降低氟虫腈的转 化速率，而在体系中加入3 的氯化钠能够加快氟虫腈的光解【2 9 】。此外，在体系 中加入h 2 0 2 也能够加快氟虫腈的光解速率，n g i m 等2 4 1 在体系中加入一定比例的 h 2 0 2 使母体的半衰期由7 9 7 9 4 2h r 缩短到0 8 7 4 5lh r 。 水解：水环境中的氟虫腈在无光照的条件下发生水解，水解产物主要是m b 4 5 9 5 0 ， r p a 2 0 0 7 6 6 。水解速率与p h 和温度有关。研究表明氟虫腈在酸性和中性条件下 f i p r o n i l a m i d ef i p r o n i lf i p m n i l - s u l f i d e ( r p a200766)(mb4 5 9 5 0 ) o n f 3 c 一爰c n 彤 b i o t i c ( s o i l ) h y d r o l y s i s ( w a t e r ) c l c f 3 b i 嘶c o x i d a t i o n p h o t o l y s i s ( f o l i a g e f i p r o n i l s u l f o n e f i p m n i l d e s u l f i n y l ( m b46136)(mb 4 6 5 1 3 ) 图1 - 1 氟虫腈在环境中通过氧化、还原、光解和水解转化为降解产物的过型1 9 】 f i gi - it h ed e g r a d a t i o no f 邱r o n i lt o 邱r o m l - s u l f i d e ，f i p r o n i l - s u l f o n e ，邱r o n i l - d e s u l f i n y la n d f i p r o n i l a m i d ev i ar e d u c t i v e ，o x i d a t i v e ，p h o t o l y t i ca n d b i o t i cr e a c t i o nm e c h a n i s m sr e s p e c t i v e l y 1 9 比较稳定，但在碱性条件下易发生水解，当p h = 1 2 时水解速率是p h = 9 时的3 0 0 多倍。当温度从3 0 升高到4 5 ，氟虫腈的水解半衰期由7 5h r 缩短到1 8h r 3 0 1 。 3 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 生物降解：土壤中的氟虫腈通过微生物降解主要转化为m b 4 5 9 5 0 ，而水中的则转 化为m b 4 6 5 1 3 1 2 4 1 。z h u 等【3 1 1 研究了氟虫腈在土壤中的微生物降解过程，发现在 没有灭菌的粘土中氟虫腈的半衰期为9 7 2 ( 2 5 ) 和8 7 8 ( 3 5 ) ，而在灭菌的 粘土中其半衰期为3 3 5 1 ( 2 5 ) 和3 2 0 7 ( 3 5 ) 。生物降解速率及产物类型 与土壤湿度密切相关，随着土壤湿度的增加氟虫腈的半衰期从1 9 8d 缩短至6 8d ， 当土壤水分含量大于5 0 转化产物为m b 4 5 9 5 0 ，小于5 0 时则转化为 m b 4 6 1 3 6 1 3 1 , 3 2 】。其次，温度也是影响降解速率的一个重要因素，随着温度升高降 解速率随之增大【3 1 1 。 1 1 3 氟虫腈对非靶标生物的毒性效应 1 1 3 1 急性毒性 氟虫腈对蜜蜂和水生生物具有高毒性 2 8 , 3 3 - 3 9 。氟虫腈对蜜蜂彳p 西m e l l i f e r al 的触杀l d 5 0 为3 8 6n g b e e ，口服l d 5 0 为0 0 5 3m g l 3 引。氟虫腈对水生生物的急 性毒性如表1 1 所示，由表可见不同物种对氟虫腈的敏感度不同，但是l c s o 总体 很低( p p b 级别) ，此外同一物种的不同发育时期以及不同性别对氟虫腈的敏感度 也存在差异。 表1 1 氟虫腈对7 k 生生物的急性毒性 t a b l e1 - la c u t et 0 c l 够o ff i p r o n i lt oa q u a t i cs p e c i e s s p e c i e sl c s o ( 嵋l ) s o u r c e p a l a e m o n e t e sp u g i o ( a d u l tg r a s ss h r i m p 、9 6 - h r0 3237 p a l a e m o n e t e sp u g i o ( a d u l tm a l eg r a s ss h r i m p l9 6 _ h ro 23 4 p a l a e m o n e t e sp u g i o ( g r a s ss h r i m pl a r v a e )9 6 - h ro 6 837 p a l a e m o n e t e sp u g i o ( g r a s ss h r i m pe m b r y o )9 6 - h r 5123 7 a m p h i a s c u st e n u i r e m i s ( a d u l te s t u a r i n ec o p e p o d ) 9 6 - h r6 838 a m p h i a s c u st e n u i r e m i s ( m a l ee s t u a r i n ec o p e p o d ) 9 6 - h r3 538 a m p h i a s c u st e n u i r e m i s ( f e m a l ee s t u a r i n ec o p e p o d ) 9 6 - h r13 038 p r o c a m b a r u sc l a r k i i ( r e ds w a m pc r a y f i s h )9 6 - h r14 32 8 p r o c a m b a r u sz o n a n g u l u s ( w h i t er i v e rc r a y f i s h )9 6 - h rl9 52 8 c e r i o d a p h n i ad u b i a ( d a p h n id)48-hrl7 7 33 o r y z i a sl a t i p e s ( j a p a n e s em e d a k a l 9 6 - h r9 4 235 4 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 1 1 3 2 慢性毒性 氟虫腈的长期暴露会产生慢性毒性，影响生物的繁殖发育 4 0 , 4 1 。大型蚤 ( c e r i o d a p h n i ad u b i a ) 的慢性暴毒实验显示氟虫腈能导致大型蚤的后代数量减 少，后代死亡率升高。桡脚类( a m p h i a s c u st e n u i r e m i s ) 长期暴毒表明氟虫腈能 推迟其生长发育并使繁殖失败率提高到8 0 【4 1 1 。 1 1 3 3 细胞毒性 虽然之前的研究认为氟虫腈对哺乳动物毒性低，但是近期研究表明它对鱼类 和哺乳动物的细胞具有毒性 1 6 , 1 8 , 3 5 , 4 2 】。人体原代肝细胞的暴露研究显示氟虫腈能 够通过调节c a s p s a e 3 7 的活性同时降低a t p 的产生及细胞活性诱导细胞凋亡4 2 1 。 n i l l o s 等吲也报道氟虫腈对虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 的原代肝细胞具有细 胞毒性，其2 4 h re c 5 0 为2 6 7 g m l 。 1 1 3 4 神经毒性 氟虫腈是一种神经毒剂，作用于昆虫的中枢神经系统，已有的研究表明氟虫 腈与无脊椎动物的g a b a 受体的结合力比脊椎动物高得多，因此认为对高等动物 神经系统是低毒的。但近期研究发现氟虫腈对鱼类及哺乳类具有神经毒性 4 3 - 4 5 】。 氟虫腈能够抑制未分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞p c i 2 的d n a 和蛋白质合成，诱导 氧化应激反应，导致细胞数量减少【4 3 1 。此外，大鼠经过暴毒后会出现短暂的过度 兴奋【4 5 1 。氟虫腈还能导致斑马鱼幼鱼脊索退化，通过抑制甘氨酸受体配子的功能 损害身体运动信号通路的发育【4 4 1 。 1 1 3 5 行为毒性 氟虫腈能够破坏蜜蜂、鸟类和鱼类的行为系统，改变它们对外界刺激的反应， 从而影响摄食、躲避敌害和繁殖能力3 6 ，4 4 4 6 4 7 1 。蜜蜂经0 0 1n g b e e 的氟虫腈暴毒 后长时间处于静止状态而且比对照组的摄取更多的水分，经0 1n g b e e 暴毒后嗅 觉记忆力遭到破坏【3 6 ，4 3 1 。鸟类( 鹌鹑n o r t h e mb o b w h i t eq u a i l ，野鸡r i n g n e c k e d p h e a s a n t ，山鹑r e d - l e g g e dp a r t r i d g e ) 经氟虫腈暴露后进食行为受到影响，进食量 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 明显减少，而且不合群，对外界干扰反应迟钝h 7 1 。氟虫腈还会对斑马鱼的运动行 为产生影响，当受n ； i - 界刺激时斑马鱼不能快速的躲避，只能做波状的收缩【4 4 1 。 i i 3 6 生殖毒性 生殖毒性是指外来物质作用于生物体的生殖系统，引起结构和功能的变化， 从而影响繁殖能力甚至累及后代。研究表明大多数农药都具有生殖毒性4 9 。52 】，氟 虫腈也不例外。k i t u l a g o d a g e 等【4 6 】给繁殖期的雌性鸟类z e b r af i n c h e s 喂食l m g k g 的氟虫腈后，发现胚胎孵化率只有1 4 ，而且发育明显比对照组缓慢。此外，母 体中的氟虫腈还能转移到卵黄中被胚胎吸收，对胚胎的发育和行为造成影响。据 报道氟虫腈的生殖毒性存在性别选择性，对雄性甲壳类生物a m p h i a s c u st e n u i r e m i s 比较敏感，能够扰乱雄性性腺发育过程中非常重要的神经激素级联，从而损害其 生殖功能使后代数量减少【5 3 1 。 1 1 3 7 内分泌干扰 氟虫腈是一种内分泌干扰物，内分泌干扰物是指进入机体后，具有干扰体内 正常内分泌物质的合成、释放、转运、代谢和结合等过程，激活或抑制内分泌系 统的功能，从而破坏内分泌系统维持机体稳定性和调控作用，并影响生物体或其 后代的发育、繁殖和( 或) 行为的外源性化合物。研究表明氟虫腈能够提高大鼠 甲状腺瘤的发生率，其作用机制是使肝脏代谢增强，提高甲状腺素t 4 消耗率，从 而使血液中t 4 浓度降低，破坏甲状腺的正常功能1 3 4 , 5 4 , 5 5 。 综上所述，氟虫腈对非靶标生物具有急慢性、细胞、神经毒性，能够干扰生 物体内分泌系统，破坏生物体的行为和生殖能力，威胁人类健康和生态安全。但 是现有的研究还局限于表观现象，作用机制尚不清楚。因此，对氟虫腈的进一步 研究迫在眉睫。 1 1 4 氟虫腈与其他污染物的联合毒性作用 生态系统是十分复杂的，存在着多种化学污染物质，相互之间会发生各种作 用或反应，因此其他污染物会影响单一污染物质存在时对生态系统的作用强度和 机理，这种效应称之为联合作用。联合作用有四个类型：相加、协同、拮抗和独 6 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 立作用。多种污染物的联合毒性比单一污染更为复杂，同时更能反映污染物在实 际环境中对生态安全的影响。目前已开展了一些氟虫腈与其他污染物如表面活性 剂、重金属及农药的联合毒性研究 5 6 - 5 8 】。例如吴声敢等5 8 1 研究了氟虫腈与几种表 面活性剂对斑马鱼的联合毒性，发现乙氧基改性三硅氧烷与氟虫腈的联合毒性表 现为协同作用。楼建晴等5 6 1 研究了氟虫腈、三唑磷与重金属p b 2 + ，c d 2 + 对麦穗鱼的 联合毒性，发现氟虫腈+ 三唑磷+ c d 2 + 及氟虫腈+ 三唑磷+ p b 2 + 的组合对麦穗鱼的联合 作用均表现为协同作用。由此可见，单一评价氟虫腈对非靶标生物的毒性作用不 能全面反映它在环境中的实际作用，需要考虑其他污染物对它的影响。 1 2 斑马鱼及其在毒理学中的应用 1 2 1 斑马鱼的毒理学优势 近年来，斑马鱼被广泛应用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理 学与环境检测等方面的研究，是国际标准化组织认可的鱼类实验动物之一。相对 于啮齿类动物实验的费用高、耗时以及受法律制约等局限性，斑马鱼具有以下几 方面的优点：首先，斑马鱼个体小，易饲养，多产。相对于虹鳟鱼等鱼类的大体 型，斑马鱼成鱼体长只有1 1 5 英寸，节省了饲养空间和成本。此外，一对成年 斑马鱼一天可以产2 0 0 3 0 0 枚胚胎，几对一天即可产上千枚胚胎【5 9 1 。第二，胚胎 透明，易于观察。斑马鱼胚胎从孵化到黑色素沉积这段时间( 3 0 7 2h p f ) 都是透 明的，直接在显徼镜下就可观察到化合物对大脑、脊索、心脏、颌及体节发育的 影响并进行定量分析 5 9 】。第三，便于进行高通量分析。斑马鱼胚胎体积小，可以 在同一块培养板上进行多种化合物同时暴毒或者几个实验平行一起进行【6 0 】。第 四，降低实验费用。较低浓度和剂量的化合物即可对斑马鱼胚胎或者成鱼产生影 响，因此可以降低实验费用并且减少废物的排放【6 。第五，斑马鱼基因序列基本 测定，斑马鱼基因组计划使得斑马鱼成为基因测序最完善的物种之一。这对基因 结构的研究，突变体基因图谱的绘制具有重要作用 6 2 1 。最后，斑马鱼突变品系多。 特定的突变体可以用来进一步研究有毒物质的靶标基因，而且可能对相应的毒物 产生抑制，可以为解释去毒机制提供帮助【5 9 】。 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 1 2 2 斑马鱼行为指标在毒理学中的应用 动物的行为对躲避敌害、捕食及繁衍后代至关重要，而且它对环境因素和自 身生理状态的改变非常灵敏，可以作为环境风险物质毒性评估的一个指标。斑马 鱼最早用于发育生物学和遗传学的研究，近几年来人们越来越关注斑马鱼行为学 在化合物毒性检测和风险评估，药物筛选中的应用。例如，通过检测斑马鱼幼鱼 的活力来筛选惊厥药物及抗惊厥药物，通过检测斑马鱼成鱼的行为变化来评价可 卡因、酒精的毒性。 鱼类对环境的行为反应是错综复杂的，主要分为三个层次：运动，感觉及学 习和记忆能力【6 3 1 。运动主要是指运动活力，外源性物质能够通过调节神经元对运 动活力造成影响，因此运动活力是检测神经损伤的一个重要指标。运动活力包括 运动速度【6 4 1 、运动距离嘲和转弯速率6 6 1 。研究发现安非他明【6 7 j 、可卡因【6 8 1 、尼 古丁【6 9 1 、乙醇删以及杀虫剂7 1 ，倒会改变斑马鱼的运动活力。感觉主要包括视觉、 嗅觉、听觉、味觉、平衡能力及体觉。当感觉或者运动器官被损伤时，斑马鱼对 外界的感知能力会发生改变。对于哺乳动物，海马区是负责学习和记忆能力的， 但是斑马鱼没有海马区，主要依靠侧大脑皮层来学习和记忆。研究发现酒精会对 斑马鱼的学习和记忆能力造成损伤7 3 1 。近年来，斑马鱼行为学研究的方法和技术 发展迅速，已经发展到定量检测水平。检测仪器主要有e t h o v i s i o n ，l o c o s c a n ， l o l i g o 和v i d e ot r a c k 。 1 3 氟虫腈的手性研究进展 1 3 1 氟虫腈的手性结构 手性化合物具有两个不能与镜像完全重叠的对映体，按其对偏振光的旋转方 向命名为左旋( 一) 和右旋( + ) ，两个对映体以1 ：1 的比例混合成为外消旋体，目前 生产和使用的手性化合物多数以外消旋体形势存在。对映体具有相同的分子式， 物理化学性质以及无机降解速率r 7 4 1 ，但是生物活性及生物降解速率存在差异 7 5 , 7 6 。因此，了解单个对映体的作用及在环境中的持久性对手性农药的管理非常 重要。欧洲一些国家已经撤销了外消旋体的注册，改而鼓励单个对映体的注册7 5 1 。 美国环保局也开始重视农药的手性问题，但仍然缺乏单个对映体的毒性及环境行 r 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 为方面的信息p 7 1 。因此研究手性化合物的生态安全和健康风险的对映体选择性差 异对农药管理和新农药的创制尤为重要。 氟虫腈是一种手性化合物，具有一个硫原子手性中一t h , ，两个对映异构体 ( + ) - f i p r o n i l 和尺( ) f i p r o n i l 。其对映体结构如图所示。 c f 3 ；f 3 c i n m u t o r 图1 2 氟虫腈两个对映体的结构图( 事为手性中心) f i g1 - 2s t r u c t u r eo ff i p r o n i le n a m i o m e r s ( a na s t e r i s kp r e s e n t sc h i r a lc e n t e r ) 1 3 2 氟虫腈的对映体选择性毒性和生物降解 研究表明氟虫腈对靶标生物和非靶标生物的急性毒性的对映体选择性差异具 有物种特异性【7 8 1 。氟虫腈两个对映体对靶标生物( 污棉虫、水稻象鼻虫、家蝇) 和非靶标生物蜜蜂的急性毒性的差异很小，可以忽略不计1 2 l 。而对大型蚤、淡水 鳌虾等物种来说，譬( + ) 异构体急性毒性较大，是尺( ) 异构体的2 - 4 倍；对草虾 则是尺( 一) 异构体毒性较大，但是两个对映体的差异比较小( 见表1 2 ) 。o v e r m y e r 等呷1 的研究归纳出氟虫腈急性毒性的对映体选择性差异在甲壳类动物中比较普 遍。 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 表1 - 2 氟虫腈对水生生物急性毒性的对映体选择性 t a b l e1 - 2e n a n t i o s e l e c t i v i t yi na c u t ea q u a t i ct o x i c i t yo ff i p r o n i l a e r = e n a n t i o m e rs e l e c t i v i t yr a t i o ：t h er a t i oo ft h el c 5 0o ft h el e s sa c t i v ee n a n t i o m e rt ot h a to ft h e m o l ea c t i v ee n a n t i o m e r s i g n i f i c a n te n a n t i o s e l e c t i v i t y 氟虫腈的生物降解过程也存在对映体差异性7 9 1 ，在富含硫酸盐细菌的底泥中 娶( + ) 一异构体降解速率较快，在富含产甲烷菌的底泥中r - ( ) 异构体降解速率较快。 k o n w i c k 等3 3 1 发现在虹鳟鱼体内，s - 异构体被优先降解，导致r ( ) 异构体在 鱼体内富集。 1 4 课题的立题依据及研究内容 1 4 1 课题的立题依据 氟虫腈是一种新型高效的苯基吡唑类杀虫剂，广泛应用于农作物害虫和卫生 害虫的防治，尤其是对产生抗药性的害虫效果显著。随着有机磷和氨基甲酸酯类 农药的进一步限用和禁用，氟虫腈替代了呋喃丹等农药的使用，使用量迅速增加， 使用范围越来越广，其引起的生态安全和健康风险问题也逐渐受到关注。虽然氟 虫腈对哺乳动物是低毒的，但它对蜜蜂和小龙虾等水生生物的毒性却很大，给养 殖业带来了严重的经济损失。此外，氟虫腈是一种手性化合物，不同对映体在水 生生物的毒性以及生物降解过程中表现出明显的对映体选择性。但是，目前关于 氟虫腈的水生毒性研究和对映体选择性研究主要集中在桡脚类、甲壳类等低等水 生生物，在鱼类水平上的研究很少，主要集中在虹鳟鱼和日本青鲻鱼。而且研究 主要集中在氟虫腈的单一毒性上。实际环境中存在着多种污染物，且复合污染的 1 0 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 毒性效应比单一污染更为复杂，单一毒性的研究并不能客观得反映氟虫腈的环境 风险。 生物的行为是对外界环境和自身生理条件的直观反应，对躲避敌害、捕食以 及种族的繁衍至关重要。动物的行为是十分敏感的，外界或者内部环境发生微小 的变化即可使行为发生变化，因此行为指标越来越多的应用于化合物的毒性评估 以及药物筛选中。近年来，斑马鱼已经成为最受关注的模式生物之一，越来越多 的应用于发育生物学和行为学的研究中。与啮齿类动物相比，斑马鱼具有体型小， 易饲养，多产，胚胎透明，各阶段发育特征明显，基因序列明了，品系资源丰富 等优点。动物的早期发育过程复杂，对外界刺激敏感，目前对高等生物的早期发 育过程的认知仍是十分匮乏。但是，斑马鱼早期发育过程以被很好的表征，能为 揭示化合物的毒理学作用机制提供帮助。目前，在外消旋水平或者对映体水平上， 关于氟虫腈对斑马鱼发育早期的行为研究未见报道。 因此，本文以斑马鱼为模式生物，研究了氟虫腈对斑马鱼胚胎一幼鱼的急性毒 性、行为影响，以及对映体在急性毒性和行为变化方面的对映体选择性差异，以 及氟虫腈与重金属铜离子对斑马鱼早期发育的影响，并阐述了可能的毒理学作用 机制，为氟虫腈的生态安全和健康风险评估以及新农药创制提供相关数据和信息。 1 4 2 研究内容 本研究以a b 品系斑马鱼为模式生物，以氟虫腈为测试化合物，作了以下几 方面的研究： ( 1 ) 研究氟虫腈对斑马鱼早期发育和行为的影响，并阐述可能的毒理学作用机制。 ( 2 ) 研究氟虫腈两个对映体对斑马鱼早期发育和行为影响的对映体选择性差异， 并解释可能的作用机制。 ( 3 ) 研究氟虫腈和重金属铜离子对斑马鱼早期发育的联合毒性效应，并解释可能 的作用机制。 基于对映体的氟虫腈的斑马鱼胚胎发育毒性及其对幼鱼运动行为的影响 第二章氟虫腈对斑马鱼胚胎幼鱼的发育毒性及幼鱼运动行 为的影响 生物的早期发育是整个生命周期中一个非常重要和敏感的阶段，许多组织 器官在该时期开始分化发育并逐步成熟，研究污染物对早期发育的影响可以追踪 污染物作用的靶器官，为解释其毒理学机制奠定基础。斑马鱼具有胚胎透明，早 期发育进程明了，基因测序完善等优点，广泛用于研究污染物对早期发育的毒性 作用。氟虫腈曾被认为是一种高效低度的新型杀虫剂，广泛用于农作物害虫和卫 生害虫的防治。但是近期研究表明氟虫腈对蜜蜂和甲壳类水生生物具有高毒性， 此外对鱼类、鸟类及哺乳动物