白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562 AO2生长增殖及凋亡的相关.doc

www.CRTER.org雷春霞. 白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性雷春霞(武汉市儿童医院新生儿内科，湖北省武汉市 430016)引用本文：雷春霞. 白血病患儿骨髓间充质干细胞与白血病细胞株K562/AO2生长增殖及凋亡的相关性J.中国组织工程研究，2016，20(41):6112-6117.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.005 ORCID: 0000-0002-1793-8332(雷春霞)文章快速阅读：白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞生长增殖及凋亡的影响雷春霞，女，1979年生，湖北省黄冈市人，2010年武汉大学第一临床学院毕业，硕士，主治医师，主要从事早产儿心肺发育及动脉导管未闭方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)41-06112-06稿件接受：2016-08-05单独培养组：K562/AO2细胞单独悬浮培养实验分组白血病患儿骨髓间充质干细胞培养细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡检测共培养组：K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养白血病骨髓间充质干细胞能够延迟白血病细胞周期，抑制其增殖，并能抵抗白血病细胞凋亡 文题释义：细胞凋亡：是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡属于主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。锥虫蓝染色：正常的活细胞胞膜结构完整，能够排斥锥虫蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被锥虫蓝染成蓝色。因此，借助锥虫蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。锥虫蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。摘要背景：骨髓微环境是白血病的发病根源，微环境的改变对白血病细胞的生物学行为和性能有一定的影响。目的：探讨白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞生长增殖及凋亡的影响。方法：体外环境下进行K562/AO2细胞单独悬浮培养，K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养。锥虫蓝染色计数活细胞数，描绘两组细胞生长曲线，PI单染法检测细胞周期，Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况。结果与结论：单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓，无明显的增殖高峰；单独培养组的G0-G1期细胞比例显著低于共培养组，S期细胞比例显著高于共培养组(P 0.05)。两组G2-M期细胞比例差异无显著性意义；单独培养组的细胞凋亡数显著高于共培养组(P 0.05)；结果表明，与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后K562/AO2细胞生长受到抑制，细胞周期阻滞在G0-G1期，且会对K562/AO2细胞凋亡产生抵抗作用。关键词：干细胞；骨髓干细胞；白血病；骨髓间充质干细胞；白血病细胞株；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期 主题词：白血病；骨髓；间质干细胞；细胞增殖；细胞凋亡；组织工程6113 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Correlation between growth, proliferation and apoptosis of leukemia cell lines K562/AO2 and bone marrow mesenchymal stem cells in children with leukemiaLei Chun-xia (Department of Neonatal Medicine, Wuhan Women and Children Medical Care Center, Wuhan 430016, Hubei Province, China)AbstractBACKGROUND: Leukemia comes from the damage to bone marrow microenvironment, and changes in bone marrow microenvironment lead to some effects on biological characteristics and behavior of leukemia cells.OBJECTIVE: To explore the effect of bone marrow mesenchymal stem cells from children with leukemia on K562/AO2 cell line growth, proliferation and apoptosis.METHODS: K562/AO2 cells were cultured alone in vitro, or co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells from leukemia children. The living cells in the two groups were counted using trypan blue staining, and the cell growth curves were described. PI single staining method was used to detect the cell cycle, and cell apoptosis was detected by V/PI Annexin method in the two groups.RESULTS AND CONCLUSION: After single suspension culture, the cells showed no marked changes within the first 3 days, but began to proliferate fast at 4 days and reached the proliferation peak at 6 days. Co-cultured cells showed a gentle growth curve with no presence of obvious proliferation peak. Compared with the co-culture group, the proportion of G0/G1 phase cells was significantly lower, but the proportion of S phase cells was significantly higher in the single culture group (P 0.05). All these findings indicate that co-culture with bone marrow mesenchymal stem cells from leukemia children inhibits the proliferation of K562/AO2 cells through G0/G1 phase arrest, and also resists apoptosis in K562/AO2 cells.Subject headings: Leukemia; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Cell Proliferation; Apoptosis; Tissue EngineeringCite this article: Lei CX. Correlation between growth, proliferation and apoptosis of leukemia cell lines K562/AO2 and bone marrow mesenchymal stem cells in children with leukemia. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(41):6112-6117.Lei Chun-xia, Master, Attending physician, Department of Neonatal Medicine, Wuhan Women and Children Medical Care Center, Wuhan 430016, Hubei Province, China6115ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction白血病是一种常见的血液系统疾病1，从发病机制角度来看，骨髓微环境是白血病的发病根源2。白血病细胞的生物学行为和性状也受到微环境改变的影响，例如诱导白血病细胞耐药和抗细胞凋亡等3-5。骨髓间充质干细胞在造血微环境的形成中具有十分重要的作用6。以往关于白血病患儿骨髓间充质干细胞对白血病细胞影响的相关研究较少。为此，实验以白血病K562/AO2细胞为研究对象，通过观察与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养前后的增殖和凋亡情况，为临床治疗白血病提供一定的参考依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞学体外观察实验。1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在武汉市儿童医院新生儿内科实验室完成。1.3 材料 K562/AO2细胞株均由武汉市儿童医院标本室提供，白血病患儿骨髓标本来自武汉市儿童医院血液科，患儿家属知情同意。研究相关方案经武汉市儿童医院医学伦理部门批准。主要试剂与仪器：肝素(北京世纪奥科生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(上海时代生物科技有限公司)；Percoll 分离液(北京华夏远洋科技有限公司)；DF-12培养液(北京奥博来科技有限责任公司)；胎牛血清(上海弘顺生物科技有限公司)；青霉素(北京四正柏生物科技有限公司)；地塞米松(上海博谷生物科技有限公司)；表皮生长因子(上海美吉生物医药科技有限公司)；链霉素(上海美季生物技术有限公司)；谷氨酰氨(爱必信(上海)生物科技有限公司)；Annexin V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒(北京艾然生物科技有限公司)；二氧化碳培养箱(北京博蕾德科技发展有限公司)；培养板(北京成萌伟业科技有限公司)；倒置显微镜(北京中仪光科科技发展有限公司)。1.4 实验方法1.4.1 细胞培养与鉴定7 参照细胞培养技术进行白血病患儿骨髓间充质干细胞培养。取白血病患儿骨髓液，用肝素抗凝后利用PBS进行等比稀释，于另一离心管中以11比例添加Percoll分离液 (1.073 g/mL)，将骨髓液缓慢滴加于Percoll分离液上，离心后收集单个核细胞层，PBS洗涤，去掉上清液，用DF-12培养液(含体积分数为10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素、10-9 mol/L地塞米松、10 g/L表皮生长因子、10 U/mL链霉素、0.2 mol/L谷氨酰氨)进行细胞重悬，以11010 L-1细胞浓度接种在培养瓶中，置于37 ，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养。培养2 d后半量换液，第5天全量换液，去掉非贴壁细胞，以后每3 d换液1次，当细胞生长达80%-90%融合时进行传代培养，收集第3代细胞，胰蛋白酶消化后进行细胞表面标志物检测CD29，CD90呈阳性表达，并选择第3代细胞用于后续实验8。1.4.2 实验分组9 实验分2组：单独培养组：行K562/AO2细胞单独悬浮培养；共培养组：K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养。1.4.3 细胞增殖情况检测10-12 收集生长良好的K562/AO2细胞，调整细胞浓度为1107 L-1，接种在24孔培养板，每孔1 mL，作为单独培养组。第3代白血病患儿骨髓间充质干细胞接种在24孔培养板上，待融合后直接添加1 mL上述K562/AO2细胞悬液，作为共培养组，两组均3 d换液1次，观察细胞增殖情况，连续7 d，每天收集两组K562/AO2细胞进行锥虫蓝染色，计数活细胞数。以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，描绘两组细胞生长曲线。1.4.4 细胞周期与细胞凋亡检测13-15 利用PI单染法检测细胞周期，K562/AO2细胞换用无血清DF-12培养，将白血病患儿骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，60Co照射，吸弃上清，接种K562/AO2细胞于白血病患儿骨髓间充质干细胞上，培养48 h收集细胞，PBS洗涤，乙醇固定，添加RNA酶水浴消化，离心，弃上清，添加 400 L 50 mg/L PI，室温避光存放，过滤，上流式细胞仪进行检测。使用Muhicycle分析软件进行细胞周期分析，计算G0-G1期，S期和G2-M期的相对比例。利用Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况，严格按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作。1.5 主要观察指标 K562/AO2细胞与白血病患儿骨髓间充质干细胞培养结果；两组K562/AO2细胞生长曲线；两组K562/AO2细胞周期与细胞凋亡情况。1.6 统计学分析 采用SPSS 15.0统计软件，组间比较予以t 检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 K562/AO2细胞培养结果 培养第3天，倒置显微镜下观察可见K562/AO2细胞悬浮生长，呈圆形，见图1。2.2 白血病患儿骨髓间充质干细胞培养结果 培养1 d后细胞部分贴壁，倒置显微镜下观察可见细胞呈圆形或多角形，培养3 d后细胞呈长梭形，培养5 d后细胞形成集落，见图2。2.3 共培养结果 共培养1 d，白血病细胞与骨髓间充质干细胞开始发生黏附，共培养3 d，黏附程度进一步加深，见图3。2.4 共培养对K562/AO2细胞增殖的影响 通过生长曲线可以看出，单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组不同培养时间均未出现明显变化，无明显增殖高峰，整体增殖曲线较为平缓，培养第5，6天细胞较之前略增多，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞生长缓慢，见图4。2.5 共培养对K562/AO2细胞周期的影响 单独培养组的G0-G1期细胞比例显著低于共培养组，S期细胞比例显著高于共培养组(P 0.05)，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞阻滞在G0-G1期，见表1。2.6 共培养对K562/AO2细胞凋亡的影响 单独培养组K562/AO2细胞凋亡显著高于共培养组(P 0.05)，表明共培养白血病患儿骨髓间充质干细胞有抵抗白血病细胞凋亡的作用，见表2，图5。表1 两组细胞周期分布情况分析 (s，n=6，%)Table 1 Analysis of cell cycle distribution in the two groups组别G0-G1SG2-M单独培养组共培养组39.581.2548.121.32a47.991.2639.150.65a12.452.2512.231.25表注：与单独培养组比较，aP 0.05。表2 两组K562/AO2细胞凋亡情况 (s，n=6，%)Table 2 Apoptosis of K562/AO2 cells in the two groups组别细胞凋亡单独培养组共培养组10.150.257.120.21a表注：与单独培养组比较，aP 0.05。 A B图1 K562/AO2细胞培养结果(40)Figure 1 K562/AO2 cell culture results (40)图注：连续培养3 d，倒置显微镜下观察可见细胞悬浮生长，呈圆形。图2 白血病患儿骨髓间充质干细胞培养结果(400)Figure 2 Culture of bone marrow mesenchymal stem cells in children with leukemia (400)图注：图中A为培养3 d后细胞呈长梭形；B为培养5 d后细胞形成集落。1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 单独培养组共培养组76543210 B A图3 白血病细胞与骨髓间充质干细胞共培养结果Figure 3 Co-culture of leukemia cells and bone marrow mesenchymal stem cells 图注：图中A为共培养1 d，白血病细胞与骨髓间充质干细胞开始发生黏附；B为共培养3 d，黏附程度进一步加深。细胞数(106)图4 两组K562/AO2细胞生长曲线Figure 4 Growth curve of K562/AO2 cells cultured with or without bone marrow mesenchymal stem cells from leukemia children图注：单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓，无明显的增殖高峰。 B A图5 两组K562/AO2细胞凋亡分析Figure 5 Apoptosis of K562/AO2 cells in the two groups图注：图中A为共培养组，B为单独培养组，单独培养组的细胞凋亡显著高于共培养组。3 讨论 Discussion骨髓造血微环境不仅影响造血实质细胞的生长、分化，而且也影响白血病细胞的增殖和分化16-18。以往研究发现，白血病骨髓基质细胞黏附功能异常，且出现细胞因子异常分泌的情况，与健康者比较，急性白血病患者的骨髓细胞外基质成分会出现明显的变化19。在白血病细胞的恶性增殖和分化过程中，骨髓基质细胞会发挥出重要的作用。骨髓间充质干细胞具有多向分化能力，属于骨髓基质细胞的前体细胞20-23。骨髓间充质干细胞不仅对正常造血具有调控作用，也对造血系统恶性肿瘤细胞的增殖和分化以及凋亡等具有重要作用24-28。实验结果发现，单独培养组前3 d细胞生长未出现明显改变，第4天开始细胞增殖速度明显加快，并于培养第6天达到最高峰。共培养组整体增殖曲线较为平缓，无明显的增殖高峰，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞生长缓慢。此外，细胞周期检测结果显示，单独培养组的G0-G1期细胞比例显著低于共培养组，S期细胞比例显著高于共培养组(P 0.05)，表明与白血病患儿骨髓间充质干细胞共培养后，K562/AO2细胞阻滞在G0-G1期。以往Lin等29将健康者的骨髓间充质干细胞与K562细胞进行黏附培养，通过观察发现K562细胞增殖受到明显抑制，处于G0-G1期的细胞数显著增加，证实了骨髓间充质干细胞会对细胞周期进程产生一定的阻滞作用，此次实验结果与之基本一致，提示抑制K562/AO2细胞增殖是治疗白血病的有效方法，但也是根治该病的重要障碍30。大多数化疗药物主要通过作用于白血病细胞增殖期而发挥出杀伤细胞的作用，达到治疗疾病的目的。如果白血病细胞的细胞周期出现改变，被阻滞在静止期，逃避了化疗药物的杀伤作用，无法获得彻底的治疗效果，导致骨髓微小残留病的发生31-33。白血病的出现与细胞增殖异常有关，也与细胞的凋亡受到抑制存在十分密切的关系。细胞凋亡是一种主动的程序化细胞死亡过程，会受到多种内源性基因控制34。正常状态下，机体可通过诱导凋亡来清除受损或无生理意义的细胞，有利于机体内环境的稳定，而肿瘤细胞却可通过抑制凋亡来实现自我保护，维持自身的存活，导致各种病变的出现35-36。实验结果显示，单独培养组的细胞凋亡显著高于共培养组(P 0.05)，表明白血病骨髓间充质干细胞有抵抗白血病细胞凋亡的作用。综上所述，白血病骨髓间充质干细胞能够延迟白血病细胞周期，抑制其增殖，并能抵抗白血病细胞凋亡，由此推测出白血病骨髓间充质干细胞能够形成白血病干细胞龛室，储备其增殖潜能和自我更新能力，维持其恶性进展37-39，但是关于其具体的作用机制以及相关的细胞信号通路等，还有待在今后予以进一步的分析。作者贡献：实验设计、实施、评估为雷春霞。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：白血病患儿骨髓标本的采集均经家属知情同意，研究相关方案经武汉市儿童医院伦理委员会批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：雷春霞对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 王昭霞,邹亚伟,李敏敏,等.急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562和K562/AO2细胞耐药的影响J.实用儿科临床杂志,2012,27(19):1507-1510.2 邹亚伟,王昭霞,陈福雄,等.白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/AO2细胞增殖和凋亡的影响J.中国组织工程研究与临床康复,2009,13(45):8997-9000.3 王昭霞,赵玉新,邹亚伟,等.急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562细胞株药物耐受性的影响J.中国医师杂志,2010,12(6):775-778.4 王昭霞,杨志敏,邹亚伟,等.急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02 细胞株耐药的影响J.中国实验血液学杂志,2011,19(1):19-23.5 徐清云.长春新碱逆转骨髓间充质干细胞对白血病门冬酰胺酶耐药的研究D. 广州:广州医科大学,2014.6 王昭霞.急性淋巴细胞白血病儿童骨髓间充质干细胞对K562和K562/AO2细胞株药物耐受性的影响D. 广州:广州医学院,2009.7 Ratajczak MZ, Kucia M, Reca R, et al. Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mRNA for early muscle, liver and neural cells hide out in the bone marrow. Leukemia. 2004;18(1):29-40.8 林梅,白海,王存邦,等.骨髓间充质干细胞分泌基质细胞衍生因子1对异体T淋巴细胞和白血病细胞HL-60增殖的影响J.中国组织工程研究与临床康复,2008,12(51): 10059-10062.9 魏朝辉,贾颖,陈乃耀,等.与白血病骨髓间充质干细胞共培养后K562细胞增殖与凋亡的变化J. 实用临床医药杂志, 2013, 17(11):34-37. 10 郭晓萍.儿童白血病病人特异性诱导多能干细胞(iPSCs)样细胞株的建立及其生物学特性研究D.杭州:浙江大学, 2012.11 马玉花.HGF在儿童白血病中的表达及其对白血病细胞增殖、药物敏感性的影响研究D. 广州:广州医学院,2013.12 Yeh SP, Chang JG, Lo WJ, et al. Induction of CD45 expression on bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Leukemia. 2006;20(5):894-896.13 王丽霞,陆化,费小明,等.硼替佐米体外诱导K562细胞凋亡的作用不受骨髓间充质干细胞的影响J.中国实验血液学杂志,2011,19(4):890-893.14 Nwabo Kamdje AH, Mosna F, Bifari F, et al. Notch-3 and Notch-4 signaling rescue from apoptosis human B-ALL cells in contact with human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Blood. 2011;118(2):380-389.15 曾东风,张勇,孔佩艳,等.白血病成骨细胞屏蔽共培养AML细胞化疗杀伤作用的研究J.中国输血杂志,2013,26(3): 115-119.16 Yamachika E, Tsujigiwa H, Matsubara M, et al. Basic fibroblast growth factor supports expansion of mouse compact bone-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and regeneration of bone from MSC in vivo. J Mol Histol. 2012;43(2):223-233.17 陈晓晨.慢性粒细胞白血病患者骨髓间充质干细胞生物学特性研究D.苏州:苏州大学,2007.18 赵智刚,孙立,王晓芳,等.急性白血病骨髓间充质干细胞调控免疫的功能及机制J.中华肿瘤杂志,2011,33(2): 105-109.19 Zhang X, Wang P, Chen XH, et al. Effects of leukemia bone marrow stromal cells on resistance of co-cultured HL-60 to idarubicin. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2004;12(2):163-165.20 赵智刚,孙立,王晓芳,等.慢性粒细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞对树突状细胞功能的调控J.中华器官移植杂志,2011,32(1):16-19.21 Arnulf B, Lecourt S, Soulier J, et al. Phenotypic and functional characterization of bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with multiple myeloma.Leukemia. 2007;21(1):158-163.22 荆凯,李辰成,王义生,等.乙醇对人骨髓间充质干细胞神经肽及凋亡相关基因表达的影响J.中华实验外科杂志, 2013,30(4):793-795.23 胡文兵,高清平,赵金涛,等.骨髓间充质干细胞对急性淋巴细胞白血病小鼠骨髓移植后GVHD和GVL的影响J.武汉大学学报:医学版,2005,26(5):588-591.24 Lu H, Lu SF, Shen WY, et al. Successful combination therapy with infusion of allogenetic bone marrow mesenchymal stem cells and CAG regimen in hypoplastic relapsed acute myelogenous leukemia. Leuk Res. 2008;32(11):1776-1779.25 蒋秀美.4例异体骨髓间充质干细胞和外周血造血干细胞联合移植治疗白血病的护理J.南京医科大学学报:自然科学版,2005,25(2):141-143.26 魏朝辉,陈涛,杨文成,等.白血病骨髓间充质干细胞对K562细胞凋亡的影响J.山西医药杂志,2013,42(17): 986-988.27 Sales VL, Mettler BA, Lopez-Ilasaca M, et al. Endothelial progenitor and mesenchymal stem cell-derived cells persist in tissue-engineered patch in vivo: application of green and red fluorescent protein-expressing retroviral vector. Tissue Eng. 2007; 13(3):525-535.28 Fang J, Chen L, Fan L, et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cells on myocardial infarction by ischemic postconditioning through paracrine mechanisms in rats. J Mol Cell Cardiol. 2011;51(5):839-847.29 Lin YM, Bu LM, Yang SJ, et al. Influence of human mesenchymal stem cells on cell proliferation and chemo-sensitivity of K562 cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2006;14(2):308-312.30 魏朝辉,贾颖,陈乃耀,等.与白血病骨髓间充质干细胞共培养后K562细胞增殖与凋亡的变化J.实用临床医药杂志, 2013,17(11):34-37.31 Wu KH, Tsai C, Wu HP, et al. Human application of ex vivo expanded umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: enhance hematopoiesis after cord blood transplantation. Cell Transplant. 2013;22(11):2041- 2051.32 Wiedemann A, Hemmer K, Bernemann I, et al. Induced pluripotent stem cells gener