RNA干扰抗A型H1N1流感病毒的研究_李洋.pdf

RNA 干扰抗 A 型 H1N1 流感病毒的研究 李洋马程远1郭健杏田明尧2金宁一2华树成 吉林大学第一医院呼吸内科 吉林长春130021 摘要 目的 制备靶向 A 型 H1N1 流感病毒 RNA 聚合酶 PA 基因的小干扰 RNA siRNA 研究其抑制病毒复制的效果 方法设计并 合成 3 对靶向 A 型 H1N1 流感病毒 PA 基因的 siRNA 构建表达质粒 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 分别转染 MDCK 细胞及鸡胚 并感染 H1N1 亚 流感病毒 检测 siRNA 抑制流感病毒复制的效果 结果设计的 3 对 siRNA 中 pS PA1537 可明显抑制 A 型 H1N1 流感病毒在 MDCK 细胞及鸡胚中 的复制 结论该研究为开发抗 H1N1 治疗制剂研究奠定了基础 关键词 A 型 H1N1 流感病毒 小干 RNA 聚合酶基因 中图分类号 R511 7 文献标识码 A 文章编号 1005 9202 2013 04 0835 03 doi 10 3969 j issn 1005 9202 2013 04 043 RNA interference against influenza A H1N1 virus LI Yang MA Cheng Yuan GUO Jian Xing et al Department of Respiration the First Hospital of Jilin University Changchun 130021 Jilin China Abstract ObjectiveTo establish the small interfering RNA siRNA targeting RNA polymerase PA gene of influenza A H1N1 virus to study its effect of inhibiting virus replication MethodsThe three pairs of siRNA targeting PA gene of influenza A H1N1 virus were designed and synthesized as well as constructed expression plasmid pS PA646 pS PA841 and pS PA1537 being trans fected into MDCK cells and chicken embryos respectively and infected with influenza virus subtype H1N1 to detect effects of siRNA on in hibiting influenza virus replication ResultsIn the designed 3 pairs of siRNA pS PA1537 inhibited the replication of influenza A H1N1 virus in MDCK cells and chicken embryos ConclusionsThe study lays the foundation for the development of therapeutic agents resistant H1N1 Key words Influenza A H1N1 virus Small interfering RNA Polymerase A gene 基金项目 国家自然科学基金项目 2009ZX10004 103 吉林省科技厅 资助项目 20090487 201101066 吉林大学研究生创新研究 计划项目 20101035 1吉林大学第一医院神经外科 2中国人民解放军军事医学研究院军事兽医研究所基因工程重点实 验室 通讯作者 华树成 1961 男 博士 博士生导师 主要从事呼吸道病原 学研究 第一作者 李洋 1979 女 在读博士 主要从事呼吸道病原学研究 尽管传统的 A 型 H1N1 流感病毒不是当前的流行毒株 但 是它可以持续不断地变异和重组 一旦 A 型 H1N1 流感病毒通 过抗原漂移和抗原转换机制获得强致病能力 会对人类健康造 成的巨大威胁 A 型流感病毒基因组 RNA 在复制过程中高达 10 4的错配率及机体免疫和药物治疗的选择压力 使病毒不断 地变异与进化 1 造成了流感流行与爆发 而现有的疫苗和药 物不能有效控制该病毒感染 寻找一种新的抗流感病毒方法 迫在眉睫 在病毒基因中往往越保守的序列就越重要 如果能 封闭或抑制病毒基因的某些保守序列发挥功能 就可以抑制病 毒基因的表达 抵抗病毒感染 因此 本实验利用 RNA 干扰 RNAi 技术进行抗 A 型 H1N1 流感病毒的体外研究 选择在 A 型 H1N1 流感病毒复制 过程中起重要作用的 RNA 聚合酶 PA 编码基因中的高度保守 序列作为靶序列 观察诱导 PA 基因沉默情况 为预防与治疗流 感寻找一种有效的措施 1材料与方法 1 1实验材料和设备A NewCaledonia 20 99 H1N1 毒株及 马丁 达比狗肾 MDCK 细胞由本室保存 各种限制性内切酶 及荧光定量 PCR 试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTM 购自 TaKaRa 公司 T4 连接酶 M MLV 反转录酶购自 Promega 公司 RNA 提 取试剂 Trizol 购自 GIBCO 公司 转染试剂 LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen 公司 鼠源 NP 单抗由本室提供 辣根过氧化物 酶标记的羊抗小鼠 IgG 单抗 DAB 为鼎国公司产品 pSilencer 5 1 U6 表达性载体 Ambion ABI 7300 荧光定量 PCR 仪 美 国 ABI 公司 荧光显微镜 OLYMPUS 1 2方法 1 2 1siRNA 的设计合成及表达质粒的构建根据 siRNA 的 设计原则 以 A 型 H1N1 毒株 PA 基因为靶基因 选择其高度保 守区 设计了特异性 siRNA 的 DNA 寡核苷酸序列 GC 含量为 30 50 BLAST 分析使其不针对任何已知的其他基因 符 合 siRNA 设计原则 由上海生工生物有限公司合成 序列如 下 PA646 5 GATCCGCTTCTCCTGCATTGAGAATTTCAAGAGA ATTCTCAATGCAGGAGAAGTTTTTTGGAAA 3 5 AGCTTTTCC AAAAAACTTCTCCTGCATTGAGAATTCTCTTGAAATTCTCAATG CAGGAGAAGCG 3 PA841 5 GATCCATTCCTGCTGATGGAT TCTTTCAAGAGAAGAATCCATCAGCAGGAATTTTTTTGGAAA 3 5 AGCTTTTCCAAAAAAATTCCTGCTGATGGATTCTTCTCTT GAAAGAATCCATCAGCAGGAATG 3 PA1537 5 GATCCGTGA CACCGATGTGGTAAACTTCAAGAGAGTTTACCACATCGGTGTCA 538 李洋等RNA 干扰抗 A 型 H1N1 流感病毒的研究第 4 期 TTTTTTGGAAA 3 5 AGCTTTTCCAAAAAATGACACCGATGTG GTAAACTCTCTTGAAGTTTACCACATCGGTGTCACG 3 序列合 成后参照 pSilencerTM5 1 Retro Kit 操作说明构建表达质粒 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 之后测序鉴定 1 2 2病毒培养及血凝效价测定病毒经绒毛尿囊腔接种 10 日龄鸡胚 37 培养 48 h 收获尿囊液 80 贮存 在 96 孔 V 形板测定病毒血凝价 HA 病毒经 2 倍倍比稀释 加入等 量 1 鸡红细胞悬液 V V 置微量振荡器上混合均匀 室温静 置 20 min 以完全凝集的病毒最大稀释度作为病毒效价 HA 1 2 3细胞培养及病毒感染常规方法培养 MDCK 细胞于细 胞瓶中 加入含体积分数为 10 胎牛血清的 DMEM 培养基 置 于 37 体积分数为 5 CO2培养箱中培养 待细胞铺满形成 单层后 0 5 胰酶 体积分数 消化 分装于 6 孔细胞板 1 107细胞 孔 待细胞单层达到 80 左右 按照 LipofectamineTM 2000 的说明书 分 别 转 染 3 g 的 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 未转染的 MDCK 细胞孔作为空白对照 转染后 18 h 弃去转染混合物 每孔加入 103TC ID50病毒液 150 l 于室温吸 附 1 h 吸附后清洗细胞后 加入 2 ml 含 2 g ml TPCK 胰酶的 病毒生长液于 37 体积分数为 5 CO2培养箱中培养 转染 后不同时间收获上清液 测定病毒 HA 1 2 4病毒与 siRNA 接种鸡胚取 30 l 10 g siRNA 的 DMEM 同 30 l Oligofectamine Invitrogen 混合 2 室温孵育 30 min 之后同 103TC ID50病毒液 100 l 一起经绒毛尿囊腔接 种 10 日龄鸡胚 37 培养 17 h 后收获尿囊液测定病毒效价 1 2 5反转录与 real time PCR将 MDCK 细胞培养于 6 孔 板 1 107细胞 孔 待细胞单层达到 80 左右 按照 Lipo fectamineTM2000 的说明书分别转染 3 g 的 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 和 Ps negative 转染后 18 h 弃去转染混合 物 每孔加入 103TC ID50病毒液150 l 接种病毒后 8 h 提取总 RNA 用 oligo d T 5 TTTTTTTTTTTTTTT 3 反转录合成 cDNA 模板 取 2 l 进行 real time PCR 用 ABI 7300 荧光定量 PCR 仪 检测荧光信号 用 2 ct法计算 PA 基因 mRNA 相对表达水平 抑制效果以 siRNA 组与对照组差异的倍数表示 PA 的扩增引 物 序 列 如 下 Pa1 CCTATGTGGATGGATTCGAAC Pa2 TG GTCGTGGTGTTGTTTTC actin1 CAGAGCAAGAGGGGCATC actin2 AGGTAGTCGGTCAGGTCC 1 2 6间接免疫荧光试验MDCK 细胞培养于 96 孔板 待细 胞单层达到 80 左右 按照 LipofectamineTM2000 的说明书分别 转染 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 未转染的 MDCK 细胞孔 作为空白对照 转染 18 h 后攻毒 未攻毒的 MDCK 细胞孔作 为细胞对照 攻毒24 h 后去除上清 80 冷丙酮37 固定2 h PBS 洗3 次 鼠源 NP 单抗作为一抗 37 孵育1 h PBS 洗3 次 FITC 标记的羊抗鼠 IgG 作为二抗 含 0 1 伊文思蓝 37 孵 育 1 h 荧光显微镜下观察 2结果 2 1表达质粒抑制病毒在 MDCK 细胞中复制的结果siRNA 转染 MDCK 后 24 h 48 h 72 h 收 获 上 清 液 利 用 公 式 HA对照组 HA实验组 HA对照组 100 计算抑制效率 结果见表 1 转染 MDCK 后 24 h 收获的上清液 HA 均为 0 所以表中未 列出 空转染对照组的 HA 在 48 72 h 之间达到高峰 而 pS PA1537 在病毒滴度的高峰时间其 HA 值仅为 32 4 表明它们 在一定程度上能够抑制 H1N1 在 MDCK 细胞中复制 其病毒抑 制率在78 以上 其他 siRNA 转染组 其血凝效价与空转染对 照组相似 其抑制效果不显著 表 1特异性 siRNA 对 H1N1 在 MDCK 中增殖的影响 x s 组别 HA 48 h72 h 抑制率 MDCK642560 pS PA64645 2256 427 33 pS PA84150 4180 515 28 pS PA153712 232 478 84 2 2表达质粒抑制病毒在鸡胚中的复制结果表达质粒抑制 病毒在鸡胚中复制结果与 MDCK 细胞实验结果一致 MDCK pS PA646 pS PA841 pS PA1537 组的 HA 分别为 256 37 180 31 220 17 48 9 siRNA 表达质粒 pS PA1537 可以有 效抑制 H1N1 流感病毒在鸡胚中的复制 因此 siRNAs 还可以 干扰 H1N1 亚型流感病毒在鸡胚中的复制 2 3各组 mRNA 表达水平pS negative pS PA646 pS PA841 pS PA1537 组的 pA mRNA 表达量分别为13 5 0 7 7 5 0 4 9 6 0 5 4 3 0 2 PA1537 能显著抑制 H1N1 基因在 MDCK 中的表达 而 pS PA646 pS PA841 对 PA 基因的表达干涉作用 不显著 感染后 8 h PA1537 使 PA mRNA 的表达水平较对照 组降低了 3 倍 2 4间接免疫荧光实验结果与空白对照组相比 pS PA1537 荧光信号明显减弱 相反 pS PA646 pS PA841 组与空白对照 组相比信号减弱不明显 结果表明 pS PA1537 可以抑制流感 病毒蛋白在 MDCK 中的表达及病毒复制 3讨论 本研究应用 RNAi 技术 选择 MDCK 细胞及鸡胚作为宿 主 以对 A 型 H1N1 流感病毒复制起重要作用的 PA 基因保守 序列为作用靶点 成功地构建了哺乳动物细胞 pS PA646 pS PA841 pS PA1537 表达载体 对 A 型 H1N1 流感病毒的 PA 基 因从转录后水平进行了抑制 并在核酸水平进行了验证 结果 表明 pS PA1537 重组质粒能抑制目的基因 PA 的 RNA 转录水 平 HA 结果表明 在分别转染 pS PA1537 的 MDCK 细胞及鸡 胚中 流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制 为进一步体内 实验奠定了基础 定量 PCR 显示 pS PA1537 表达的 siRNA 能 够靶向前基因组 mRNA 使 RNA 水平降低 pS PA1537 相比 pS PA646 pS PA841 抑制效果更好 可能的原因是靶位点选择 的差异 应用 siRNA 进行流感病毒的抗病毒研究已取得进展 Ge 等 3 4 设计了针对 H1N1 亚型流感病毒基因组 NP PA PB1 保守区的 siRNA 能够抑制流感病毒在细胞或鸡胚中的增殖 Tompkins 等 5 将合成的 siRNA 导入小鼠 明显降低了感染鼠 肺中的流感病毒滴度 保护鼠免于致死性流感病毒的攻击 并 638 中国老年学杂志 2013 年 2 月第 33 卷 证明这种保护是特异性的 而不是由抗病毒干扰素应答介导 的 本试验较其他研究中的抑制效率略有下降 其原因可能包 括以下几方面 1 与实验操作和技术有一定的关系 2 病 毒的逃逸 H1N1 的频繁突变与 RNAi 的高度序列性之间的矛 盾是设计 siRNA 的难点 虽然选择在病毒高度保守区设计 siR NA 但本毒株在保存过程中也可能造成靶基因的突变或碱基 的缺失 导致病毒的逃逸 3 siRNA 的设计 目前各种 siR NA 设计原则不统一 各公司使用不同的规则筛选 siRNA 也导 致不是所有的 siRNA 都有抑制效果 4 合成的 siRNA 质量 不稳定等 siRNA 干扰现象是一个很复杂的过程 而且到目前 为止仍然有许多机制不清 不同的 siRNA 抑制效果可能受到目 标序列位置 GC 含量 二级结构等多种因素的影响 尽管 RNAi 技术有许多明显的优点 但也存在一些限制因 素 如 siRNA 并不是对所有的靶向基因都有作用 而是有选择 性的 它对某些靶向基因可能表现出较强的干扰作用 但对其 他靶向基因却表现出较弱的效应 甚至无效应 对同一靶向 基因 mRNA 来说 可能某些 siRNA 对其有较强的抑制作用 而 另一些 siRNA 却只有较弱的抑制作用或无作用 6 在 siRNA 应用方面也有许多问题需要解决 如靶位的选 择 怎样设计出有效地 siRNA 序列 如何有效的将 siRNA 分子 转运到靶器官并进入靶细胞 给药方式 怎样提高 siRNA 的稳 定性 联合用药 体内实验及作用机制等方面 这些都有待于进 一步的研究 4参考文献 1Ahlquist P RNA dependent RNA polymerases viruses and RNA silen cing J Science 2002 296 5571 1270 3 2Elbasir SM Harborth J Lendeckel W et al Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells J Na ture 2001 411 6836 494 8 3Ge Q McManus MT Nguyen T et al RNA interference of influenza vi rus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription J Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 5 2718 23 4Ge Q Filip L Bai A et al Inhibition of influenza virus production in virus infected mice by RNA interference J Proc Natl Acad Sci USA 2004 101 23 8676 81 5Tompkins SM Lo CY Tumpey TM et al Protection against lethal in fluenza virus challenge by RNA interference in vivo J Proc Natl Acad Sci USA 2004 101 23 8682 6 6Holen T Amarzguioui M Wiiger MT et al Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor J Nucleic Acids Res 2002 30 8 1757 66 2012 06 10 收稿2012 09 21 修回 编辑徐 杰 氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞及促血管平滑肌细胞增殖的机制 何玉萍匡忠生何玉珊许翌嘉 广州中医药大学第一附属医院实验中心 广东广州510405 摘要 目的 观察氧化低密度脂蛋白 ox LDL 诱导人脐静脉血管内皮细胞株 ECV304 损伤及损伤条件培养基作用于血管平滑肌细胞 VSMC 的影响 方法采用流式细胞术 FCM 测定 ECV304 细胞内 Ca2 线粒体膜电位 MMP 凋亡率及 VSMC 细胞周期各时相 DNA 含量 增殖 指数 结果ox LDL 致 ECV304 细胞活力降低 细胞内 Ca2 浓度升高 MMP 下降 细胞凋亡率明显增高 损伤条件培养基有明显促进 VSMC 增殖 与 正常对照组比较有显著差异 P 0 01 P 0 001 结论ox LDL 导致血管内皮细胞损伤 引起 E